寧靜 于 鵬 劉家金 黨浩丹 徐白萱

中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心核醫(yī)學(xué)科，北京 100853

替莫唑胺（temozolomide, TMZ）是初診或復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤患者的重要化療藥物[1]。O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）基因甲基化可使膠質(zhì)瘤患者對TMZ 治療產(chǎn)生更好的臨床反應(yīng)，特別是能顯著延長患者的生存期[2]。因此，MGMT 基因甲基化狀態(tài)的評估對于膠質(zhì)瘤患者治療方案的選擇至關(guān)重要。

18F-FDG PET/CT 已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷。葡萄糖代謝可以直接反映膠質(zhì)瘤的代謝特征，并進(jìn)一步指示膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特征，如腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)、膠質(zhì)瘤的分級和內(nèi)在的血管分布等[3-4]。盡管術(shù)中組織病理學(xué)檢查仍是診斷膠質(zhì)瘤的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但利用分子探針來探索顯像劑與膠質(zhì)瘤分子特征之間的相關(guān)性逐漸成為研究焦點(diǎn)。已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過分析18F-FDG 的代謝指標(biāo)[腫瘤與正常組織攝取率（tumor-to-normal-tissue uptake ratio，TNR）]能夠預(yù)測MGMT 基因的甲基化狀態(tài)[5]。

影像組學(xué)通過提取ROI 高通量的圖像特征，能將肉眼不可見的影像信息轉(zhuǎn)化為多維可挖掘的空間特征數(shù)據(jù)[6]。相關(guān)研究結(jié)果表明，影像組學(xué)的研究方法相較于傳統(tǒng)的手動勾畫ROI，能夠從圖像中獲取更多有用的信息，此類信息對于提高確診率和預(yù)測預(yù)后至關(guān)重要[7-8]，特別是近年來，因其可無創(chuàng)、重復(fù)且整體分析腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性而愈發(fā)受到重視[9-10]。

據(jù)筆者所知，迄今尚未有已發(fā)表的研究通過分析18F-FDG PET/CT 圖像的紋理特征來探索膠質(zhì)瘤的特征與MGMT 基因甲基化狀態(tài)之間的關(guān)系。本研究嘗試以此來綜合評估MGMT 基因甲基化狀態(tài)，以預(yù)測膠質(zhì)瘤患者對TMZ 治療的反應(yīng)，并探索膠質(zhì)瘤的多種生物學(xué)特性，以服務(wù)于臨床診療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016 年1 月至2018 年9 月在中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心核醫(yī)學(xué)科進(jìn)行18F-FDG PET/CT 檢查的17 例膠質(zhì)瘤患者，其中男性13 例、女性4 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)結(jié)果證實(shí)為膠質(zhì)瘤患者；（2）初診患者，做PET/CT 之前未接受過其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有其他重大疾病無法配合完成檢查的患者；（2）有幽閉恐懼癥等PET/CT 檢查禁忌癥的患者。

1.2 組織病理學(xué)分析

按照標(biāo)準(zhǔn)程序取部分腫瘤樣品固定在10%福爾馬林中，并包埋在石蠟中。每一份腫瘤樣品都進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）國際腫瘤組織學(xué)分類確定腫瘤分級。

1.3 基因組DNA 提取

腫瘤標(biāo)本取出后立即放入液氮中冷凍并儲存在–80℃冰箱中。參照DNeasy Blood and Tissue 試劑盒（美國Qiagen 公司）說明書的步驟提取基因組DNA。

1.4 MGMT 基因甲基化分析

按照文獻(xiàn)[11]中的焦磷酸測序法來分析、確定MGMT 基因的甲基化狀態(tài)。根據(jù)說明書提示的步驟，使用EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒（美國Zymo Research 公司）對從腫瘤組織中提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。使用PyroMark PCR 試劑盒（美國Qiagen 公司）將亞硫酸氫鹽修飾的DNA 用于PCR；PCR 的陰性對照組則用水代替模板DNA。將MGMT 基因的PCR 條件設(shè)定為95℃15 min；45 個循環(huán)，95℃持續(xù)20 s，53℃持續(xù)20 s，72℃持續(xù)20 s，在72℃下維持5 min，最后儲存在4℃條件下。將PCR 產(chǎn)物固定在珠子上并進(jìn)行鏈分離。使用PyroMark CpG MGMT 試劑盒（美國Qiagen 公司）中提供的測序引物在PyroMark Q96ID 焦磷酸測序儀（美國Qiagen 公司）上進(jìn)行焦磷酸甲基化測序。使用PyroMark CpG MGMT 試劑盒檢測MGMT基因外顯子1 上的5 個CpG 位點(diǎn)的甲基化水平；將未緊臨鳥嘌呤的胞嘧啶作為完成亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的內(nèi)部對照，記錄下每個CpG 位點(diǎn)的甲基化百分比（胞嘧啶的含量百分比）。甲基化高于任何單個CpG 島的10%或5 個CpG 島平均值的樣品視為陽性（甲基化組）；甲基化低于10%的樣品視為陰性（未甲基化組）。

1.5 18F-FDG PET/CT 檢查

18F-FDG PET/CT 檢查在手術(shù)前7 d 內(nèi)進(jìn)行；患者禁食至少6 h。所有檢查均使用德國西門子公司 的Siemens Biograph 64 TruePoint PET/CT 掃 描儀，檢查前患者安靜休息約30 min，經(jīng)肘靜脈注射3.7 MBq/kg 的18F-FDG（由中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心核醫(yī)學(xué)科18F-FDG 自動化合成模塊合成，放射化學(xué)純度＞95%），繼續(xù)安靜休息40 min后，使用512×512 矩陣以螺旋模式進(jìn)行CT 采集（管電壓120 kV、管電流110 mAs）。以三維模式進(jìn)行PET 全身掃描（從下頜骨至股骨上部），頭部采集1 個床位，采集時間4 min。后行PET 顯像，采用迭代重建算法（迭代3 次，每次21 個子集），層厚5 mm。再使用CT 對PET 圖像進(jìn)行衰減校正。經(jīng)CT 衰減校正后獲得橫斷面、矢狀面和冠狀面的PET/CT 圖像。

1.6 圖像分析

使用專用的圖像后處理軟件Multiparametric Analysis（德國西門子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司）進(jìn)行圖像分析。由2 位核醫(yī)學(xué)科醫(yī)師（1 位具有10 年神經(jīng)疾病診斷經(jīng)驗(yàn)，另1 位具有3 年紋理特征分析經(jīng)驗(yàn)）根據(jù)PET/CT 圖像手動勾畫腫瘤的感興趣體積（volume of interest，VOI）進(jìn)行紋理分析。通過分析基于VOI 的信號強(qiáng)度直方圖，該軟件可提供圖像的一階紋理特征，包括排除了最小5%和最大5%體素的平均標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（mean standardized uptake value，SUVmean）、Percentile 5th、Percentile 95th、Skewness、Kurtosis、DiffEntropy、DiffVariance、Contrast 和Entropy。此外，通過軟件也可計(jì)算常規(guī)參數(shù)，如全部體素的SUVmean、SUVmax、代謝腫瘤體積（metabolic tumor volume，MTV）、糖酵解總量（total lesion glycolysis，TLG）和皮質(zhì)TNR。為了計(jì)算正常的SUV 攝取，手動在PET 圖像上對腫瘤病變對側(cè)的頂葉皮質(zhì)繪制感興趣環(huán)形區(qū)域[5,12]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的定量指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。若方差齊，定量變量均值的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用Levene檢驗(yàn)。所有P值均設(shè)置為雙側(cè)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

17 例患者中，2 例（11.8%）經(jīng)組織病理學(xué)結(jié)果證實(shí)為WHO 國際腫瘤組織學(xué)分類Ⅰ級、1 例（5.9%）為Ⅲ級、14 例（82.4%）為Ⅳ級膠質(zhì)瘤。9 例（52.9%）患者的MGMT 基因甲基化（甲基化組）、8 例（47.1%）患者的MGMT 基因未甲基化（未甲基化組）。甲基化組與未甲基化組比較，患者的年齡和腫瘤分級的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=?0.251、?0.016,P=0.806、0.198）；而性別之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=?1.426，P=0.031）（表1）。MGMT 基因甲基化組的SUVmax高于MGMT 基因未甲基化組的SUVmax，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=?3.095，P=0.007）；MGMT 基因甲基化組的TNRmax也高于MGMT 基因未甲基化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=?3.402，P=0.004）。18F-FDG PET/CT 圖像的常規(guī)半定量指標(biāo)、直方圖特征及紋理特征間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。典型病例的PET/CT 圖像見圖1，MGMT基因甲基化組與未甲基化組膠質(zhì)瘤患者18F-FDG PET 圖像的SUVmax和TNRmax比較見圖2。

3 討論

在本研究中，我們通過對18F-FDG PET/CT 圖像的紋理研究分析了MGMT 基因甲基化狀態(tài)與膠質(zhì)瘤代謝特征之間的關(guān)系，同時發(fā)現(xiàn)18F-FDG 攝取與MGMT 基因甲基化狀態(tài)存在顯著相關(guān)性，其中SUVmax和TNRmax可用于區(qū)分MGMT 基因甲基化組和未甲基化組。通過手動勾畫VOI 及對側(cè)正常頂葉的圓形ROI 計(jì)算TNR 的方法客觀性較差，且僅僅靠半定量指標(biāo)評定18F-FDG 代謝與MGMT 基因甲基化狀態(tài)有關(guān)，說服力較低。因此，本研究采用了基于放射組學(xué)的分析方法，探討更多與MGMT基因甲基化狀態(tài)相關(guān)的直方圖特征及紋理特征，以求定量精準(zhǔn)化，同時探索這些圖像特征可否為解釋復(fù)雜的膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為明晰方向。

表1 17 例膠質(zhì)瘤患者的臨床特征及18F-FDG PET/CT 圖像特征（±s）Table 1 Clinical and 18F-FDG PET/CT imaging characteristics of 17 glioma patients ( ±s)

表1 17 例膠質(zhì)瘤患者的臨床特征及18F-FDG PET/CT 圖像特征（±s）Table 1 Clinical and 18F-FDG PET/CT imaging characteristics of 17 glioma patients ( ±s)

注：表中，F(xiàn)DG：氟脫氧葡萄糖；PET/CT：正電子發(fā)射斷層顯像計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)；MGMT：O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶；TNRmax：最大腫瘤與正常組織攝取率；TNRmean：平均腫瘤與正常組織攝取率；Percentile 5t、Percentile 95th、Skewness、Kurtosis 為圖像的直方圖特征參數(shù)；DiffEntropy、DiffVariance、Contrast、Entropy 為圖像的紋理特征參數(shù)

MGMT基因未甲基化組（n=8） MGMT基因甲基化組（n=9） t值 P值臨床指標(biāo) 年齡（歲） 45.7±19.6 47.9±16.3 ?0.251 0.806 性別（男∶女，例） 8∶0 5∶4 ?1.426 0.031 腫瘤級別（Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ∶Ⅳ，例） 2∶0∶0∶6 0∶0∶1∶8 ?0.016 0.198圖像的常規(guī)特征 最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值 9.66±4.13 18.83±7.77 ?3.095 0.007 平均標(biāo)準(zhǔn)化攝取值 4.83±2.19 6.20±2.98 ?1.088 0.294 代謝腫瘤體積 39.71±62.87 49.34±77.73 ?0.282 0.782 糖酵解總量 123.41±179.85 216.06±250.27 ?0.884 0.390 TNRmax 1.20±0.52 2.37±0.87 ?3.402 0.004 TNRmean 0.61±0.27 0.77±0.34 ?1.044 0.313圖像的直方圖特征 中位標(biāo)準(zhǔn)化攝取值 4.66±2.11 6.03±2.98 ?1.098 0.289 Percentile 5th 3.00±1.73 2.57±1.10 0.599 0.558 Percentile 95th 7.20±3.12 10.41±5.29 ?1.548 0.142 Skewness 0.52±0.32 0.50±0.63 0.081 0.937 Kurtosis 0.25±1.27 0.49±2.91 ?0.224 0.826圖像的紋理特征 DiffEntropy 0.93±0.37 0.96±0.50 ?0.161 0.874 DiffVariance 0.27±0.16 0.42±0.46 ?0.879 0.404 Contrast 0.84±0.51 1.58±2.12 ?0.956 0.368 Entropy 1.76±0.72 1.81±0.73 ?0.159 0.876

與能體現(xiàn)代謝特征的常規(guī)半定量指標(biāo)TNR 等相比，基于放射組學(xué)的紋理特征分析因能在短時間內(nèi)獲取、分析大量信息，在腫瘤學(xué)，特別是神經(jīng)腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域中的優(yōu)勢日益突出[13]?；诖?，幾項(xiàng)研究利用PET 顯像，綜合了腫瘤的代謝學(xué)和形態(tài)學(xué)特征來評估WHO Ⅱ級膠質(zhì)瘤患者的異檸檬酸脫氫酶基因突變狀態(tài)[14-15]。此外，O-（2-[18F]氟乙基）-L 的酪氨酸PET 圖像的紋理分析也已應(yīng)用于臨床膠質(zhì)瘤分級、高級別膠質(zhì)瘤的假性進(jìn)展鑒定以及放療導(dǎo)致的腦轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)改變等多個方面[16]。

有研究結(jié)果顯示，腫瘤中高18F-FDG 攝取與MGMT 基因甲基化有關(guān)，且高18F-FDG 攝取的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良[11]，而MGMT 基因甲基化與良好預(yù)后呈正相關(guān)[17]。這種悖論一種可能的解釋是18F-FDG 攝取與患者對化療藥物的耐藥程度呈負(fù)相關(guān)，類似之前研究報(bào)道的肺癌、胃腸道間質(zhì)瘤等[18]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，18F-FDG 是腫瘤耐藥表型的底物，所以其攝取與P-糖蛋白表達(dá)的耐藥表型相關(guān)[19]，再者，與患者對TMZ 治療反應(yīng)相關(guān)的MGMT 基因甲基化狀態(tài)在組織病理學(xué)上伴有多耐藥亞型[20]，因此，那些抗藥性亞型可能影響到不同MGMT 基因甲基化狀態(tài)的患者對分子探針攝取的模式。另一方面，與甲基化類型相比，MGMT基因未甲基化類型往往具有更廣泛的壞死區(qū)[12]，這也可能是未甲基化組中18F-FDG 攝取較低的原因。由于腫瘤代謝是一種復(fù)雜的生物學(xué)行為，這些涉及耐藥性的表型可能與MGMT 基因甲基化狀態(tài)的不同導(dǎo)致不同的18F-FDG 攝取有關(guān)。因此，為了找出獨(dú)立的預(yù)后成像參數(shù)和分子標(biāo)志物，前瞻性隊(duì)列研究的多變量分析勢在必行。

圖1 不同MGMT 基因甲基化狀態(tài)的膠質(zhì)瘤患者（病例1，圖A～E，男性MGMT 基因未甲基化患者，41 歲；病例2，圖F～J，男性MGMT 基因甲基化患者，24 歲）的18F-FDG PET/CT 圖及紋理分析圖圖中，A、F：18F-FDG PET 圖；B、G：CT 圖；C、H：18F-FDG PET/CT 融合圖；D、I：18F-FDG PET/CT 圖的VOI；E、J：基于18F-FDG PET/CT 圖的VOI 紋理分析。病例1 的SUVmax 和TNRmax 分別為9.1 和0.8，病例2 的SUVmax 和TNRmax 分別為20.4 和3.8。MGMT：O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶；FDG：氟脫氧葡萄糖；PET：正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)；CT：計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)；VOI：感興趣體積；SUVmax：最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值；TNRmax：最大腫瘤與正常組織攝取率Fig. 1 18F-FDG PET/CT and representative images of MGMT unmethylated glioma (case 1, male, aged 41, glioblastoma: A–E) and MGMT methylated glioma (case 2, male, aged 24, glioblastoma: F–J)

圖2 MGMT 基因甲基化組和未甲基化組膠質(zhì)瘤患者18F-FDG PET 圖像的SUVmax 和TNRmax 比較 圖中，a：與MGMT 基因未甲基化組相比，MGMT 基因甲基化組的SUVmax 和TNRmax 均更高，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=?3.095， P=0.007；t=?3.402，P=0.004）。MGMT：O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶；SUVmax：最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值；TNRmax：最大腫瘤與正常組織攝取率；FDG：氟脫氧葡萄糖；PET：正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)Fig. 2 Comparison of SUVmax and TNRmax in 18F-FDG PET images of patients with glioma in MGMT methylation group and unmethylation group

我們通過18F-FDG PET/CT 圖像的紋理分析對MGMT 基因甲基化狀態(tài)和膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為、顯像特征之間的關(guān)系進(jìn)行了深度研究。研究結(jié)果表明，18F-FDG 攝取在MGMT 基因甲基化組和未甲基化組之間存在顯著差異，而18F-FDG PET/CT 圖像的SUVmax和TNRmax可能成為評估MGMT 基因甲基化狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)。但本研究有兩點(diǎn)局限性。首先，受制于18F-FDG PET/CT 圖像腦部本底較高，本研究的樣本量較小，不足以降低分析過程中產(chǎn)生的選擇偏倚。鑒于治療方法的個體化差異和樣本數(shù)量有限，我們沒有采用ROC 曲線來分析鑒別效能或評估患者的生存率。本課題組下一步將采用對照良好的前瞻性設(shè)計(jì)，盡可能納入個體差異較小的患者來做進(jìn)一步研究。其次，由于PET 圖像的空間分辨率低，本研究僅基于強(qiáng)度-體積直方圖分析了一些一階紋理特征。因此，未來需要更大的隊(duì)列研究來進(jìn)一步有效地分析基于其他探針的多模態(tài)影像（如11C-MET PET/MR 等）的紋理特征與MGMT基因甲基化的相關(guān)性。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明 寧靜負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的收集和分析、論文的撰寫；于鵬負(fù)責(zé)協(xié)助數(shù)據(jù)的分析；劉家金負(fù)責(zé)患者檢查的技術(shù)操作；黨浩丹負(fù)責(zé)部分?jǐn)?shù)據(jù)的收集和分析；徐白萱負(fù)責(zé)指導(dǎo)論文的撰寫。