凌旭坤 謝文鴻 張喆 胡琛

惠州市中心人民醫(yī)院胃腸外科（廣東惠州516200）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是嚴(yán)重威脅全球人群健康的主要公共衛(wèi)生問題之一，在男女性高發(fā)腫瘤中常年位居前3 位，且男性的發(fā)病率明顯高于女性［1］。許多研究表明［2-3］，CRC 的發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，探討CRC增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)其臨床治療十分關(guān)鍵。

miRNA 的異常表達(dá)被證明與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其可靶向下游mRNA，調(diào)控腫瘤的發(fā)展進(jìn)程［4-6］。研究表明，miR?17?5p 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［7-9］。但miR?17?5p 在CRC 中的作用機(jī)制仍有待探討。肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈相互作用蛋白（myosin regulatory light chain interacting protein，MYLIP）參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移的調(diào)節(jié)［10-11］。通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測得知MYLIP 是miR?17?5p 的潛在靶基因，然而，目前還沒有關(guān)于MYLIP 在CRC 發(fā)展過程中的重要作用的研究，因此，本文將探討miR?17?5p 調(diào)控MYLIP 表達(dá)的潛在機(jī)制及其在CRC 增殖及轉(zhuǎn)移中的作用，為尋找CRC 的有效治療靶點(diǎn)探索新的道路。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞系及主要試劑收集2017年12月至2018年1月在惠州市中心人民醫(yī)院切除的60 例CRC 患者的癌及癌旁組織標(biāo)本。研究方案征得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。CRC 細(xì)胞系SW620（貨號(hào)：ATCC CCL?227），Caco?2（貨號(hào)：ATCC HTB?37），HT29（貨號(hào)：ATCC HTB?38），Lovo細(xì)胞（貨號(hào)：ATCC CCL?229）及結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC（貨號(hào)：ATCC CRL?1831）均購買自美國ATCC 公司。胎牛血清、RPMI?1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，miR?17?5p抑制劑（miR?17?5p inhibitor）及其陰性對(duì)照（NC）和siRNAs購自上海吉瑪制藥技術(shù)公司，TRIzol RNA 提取試劑盒及SYBR PCR Master Mix 購自Thermo Fisher Scientific 公 司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA 購自日本TaKaRa 公司，Transwell 小室購自Corning 公司，ECL 化學(xué)發(fā)光液購于美國BioRad 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和雙熒光素酶報(bào)告基因購自Pro?mega 公司，RIPA 細(xì)胞裂解液及BCA 試劑盒購于北京碧云天公司，一抗購于美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞系SW620、Caco?2、HT29、Lovo 細(xì)胞和FHC 細(xì)胞分別培養(yǎng)在含10%胎牛血清和雙抗的RPMI?1640 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件5%CO2、37 ℃恒溫箱。參照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書將培養(yǎng)好的miR?17?5p inhibitor及陰性對(duì)照進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h 后檢測其轉(zhuǎn)染效率?；旌限D(zhuǎn)染HEK?293 和Lovo 細(xì)胞48 h 后進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前期分為2 組：對(duì)照組（NC）和轉(zhuǎn)染miR?17?5p 的敲降組（miR?17?5p inhibitor），實(shí)驗(yàn)后期分為3 組：對(duì)照組（NC），敲降MYLIP 組（si?MYLIP）和回復(fù)組（si?MYILP+miR?17?5p inhibitor）。

1.3 RT?qPCR檢測miR?17?5p的表達(dá)TRIzol提取CRC組織和各組細(xì)胞中總RNA，測定其濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)SYBR PCR Master Mix 的說明進(jìn)行PCR 反應(yīng)，條件為：95 ℃10 min、95 ℃15 s、58 ℃30 s，72 ℃30 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。U6為內(nèi)參，2?ΔΔCt法計(jì)算miR?17?5p的表達(dá)（表1）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.4 生物信息學(xué)預(yù)測、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測MYLIP 與miR?17?5p 的靶向關(guān)系使用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase 預(yù)測miR?17?5p 的靶基因，將miR?17?5p 的種子序列與所預(yù)測的靶基因3′?UTR區(qū)域進(jìn)行堿基互補(bǔ)比對(duì)。將與miR?17?5p 具有靶向結(jié)合位點(diǎn)的MYLIP 片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，構(gòu)建野生型MYLIP 載體，對(duì)MYLIP 與miR?17?5p 的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變構(gòu)建MYLIP 突變型載體。將miR?17?5p mimics 和野生或突變型MYLIP 載體轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞中，48 h 后，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，檢測螢火蟲熒光素酶活性。

1.5 MTT 法檢測Lovo 細(xì)胞增殖活力將對(duì)數(shù)生長期CRCLovo 細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，加入MTT液混合均勻，在37 ℃下孵育4 ～6 h 后吸出上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO）形成單細(xì)胞懸浮液并以1 × 103細(xì)胞/孔的密度接種到24 孔板中。培養(yǎng)7 d 后，加入20 μL DMSO，在室溫下攪拌10 min 使晶體充分溶解。分別在0、24、48、72 和96 h 測定490 nm 處的OD值。

1.6 Transwell小室法檢測Lovo細(xì)胞侵襲和遷移將50 mg/L 的基質(zhì)膠按1∶8 的比例稀釋，平鋪于Transwell 小室上室，靜置30 min。遷移實(shí)驗(yàn)不需要基質(zhì)膠。收集培養(yǎng)的Lovo 細(xì)胞饑餓培養(yǎng)1 d，消化后離心，PBS 洗滌，重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按每室2 ×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到Transwell 小室上室，將含20%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基加入下室，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室表面未穿過膜的細(xì)胞，并用95%乙醇固定滲透膜，結(jié)晶紫染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.7 Western blot檢測蛋白的表達(dá)水平用PBS清洗樣本組織和細(xì)胞，RIPA 裂解組織和細(xì)胞提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白純度和濃度，用SDS?PAGE凝膠電泳分離蛋白，PVDF進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，在4 ℃條件下加入一抗（MYLIP，1∶1 000；E?cadherin，1∶2 000；N?cadherin，1∶1 000；vimentin，1∶1 000；GAPDH，1∶1 000）孵育。次日，TBST 洗滌。加入二抗（1∶1 000），在室溫環(huán)境中孵育1 h，洗膜，ECL 發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)，采集圖像并對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析，GAPDH 作為內(nèi)參，Image J 分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 16.0 和GraphPad Prism 7軟件分析數(shù)據(jù)并作圖，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以表示。P<0.05或P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織和細(xì)胞中miR?17?5p表達(dá)上調(diào)RT?qPCR 結(jié)果表明，miR?17?5p 在CRC 組織中的表達(dá)水平明顯高于與其相鄰的癌旁組織（P< 0.05，圖1A）；miR?17?5p 在CRCSW620，Lovo，Caco?2 和HT29 細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC（P< 0.05，圖1B），其中，miR?17?5p 在CRC Lovo 細(xì)胞中的表達(dá)水平最高，后續(xù)選取Lovo 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 CRC 組織及其細(xì)胞中miR?17?5p 的表達(dá)水平Fig.1 The expression of miR?17?5p in CRC tissues and cells

2.2 敲降miR?17?5p 抑制Lovo 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移RT?qPCR 檢測表明，轉(zhuǎn)染miR?17?5p inhibitor組中miR?17?5p的表達(dá)低于NC組（P<0.05，圖2A），表明miR?17?5p inhibitor 成功轉(zhuǎn)染。MTT 法檢測結(jié)果顯示，與NC相比，敲降miR?17?5p對(duì)Lovo細(xì)胞的增殖能力有明顯的抑制（P< 0.05，圖2B）。Transwell小室法檢測結(jié)果顯示，與NC 相比，敲降miR?17?5p明顯抑制Lovo 細(xì)胞的侵襲和遷移能力（P< 0.05，圖2C，D）。此外，Western blotting 檢測結(jié)果表明，E?cadherin 表達(dá)顯著高于NC 組（P< 0.05），Vimentin和N?cadherin 蛋白的表達(dá)則低于NC 組（P< 0.05，圖2E）。由此可知，敲降miR?17?5p 抑制Lovo 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖2 敲降miR?17?5p 對(duì)Lovo 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響Fig.2 The effect of knockdown of miR?17?5p on proliferation and metastasis of Lovo cells

2.3 MYLIP與miR?17?5p的靶向關(guān)系及其在CRC組織中的表達(dá)水平通過生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase的預(yù)測顯示（圖3A），MYLIP 與miR?17?5p 存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測表明，與NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR?17?5p mimics 進(jìn)入HEK293 細(xì)胞后，MYLIP 3′?UTR?WT 報(bào)告基因的相對(duì)熒光素酶活性顯著下調(diào)（P<0.05），而MYLIP 3′?UTR?MUT報(bào)告基因的熒光素酶活性與NC 組相比無明顯變化（P>0.05）（圖3B）。Western blot 檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，過表達(dá)miR?17?5p顯著下調(diào)MYLIP 的表達(dá)水平（P<0.05，圖3C），由此可知miR?17?5p 可以靶向調(diào)控MYLIP 的表達(dá)水平。

圖3 miR?17?5p 靶向調(diào)控MYLIP 的蛋白表達(dá)水平Fig.3 miR?17?5p targeted regulation of MYLIP protein expression level

2.4 miR?17?5p下調(diào)MYLIP的表達(dá)促進(jìn)Lovo細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移Western blot結(jié)果顯示，相比較于NC組，敲降MYLIP后Lovo細(xì)胞中MYLIP、N?cadherin 及Vimentin 蛋白水平顯著下調(diào)（P< 0.05），E?cadherin表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），同時(shí)轉(zhuǎn)染si?MYLIP+miR?17?5p inhibitor 組中MYLIP、N?cadherin、Vimentin 和E?cadherin 蛋白的表達(dá)水平與NC 組無顯著差異（圖4A）。MTT 法檢測結(jié)果顯示，與NC 相比，敲降MYLIP 對(duì)Lovo 細(xì)胞的增殖能力有明顯的促進(jìn)作用（P< 0.05），而同時(shí)在Lovo 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si?MYLIP+miR?17?5p inhibitor 后Lovo 細(xì)胞的增殖能力與NC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B）。Transwell 小室法檢測結(jié)果顯示，與NC 相比，敲降MYLIP 顯著促進(jìn)Lovo細(xì)胞的侵襲和遷移能力（P< 0.01），而同時(shí)敲降MYLIP+ miR?17?5p 后Lovo 細(xì)胞侵襲和遷移能力與NC 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4C，D）。由此可知，miR?17?5p 通過靶向下調(diào)MYLIP 來促進(jìn)CRC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

3 討論

CRC 是預(yù)后極差的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)死亡率較高，每年有數(shù)百萬人罹患CRC［12］。CRC主要影響直腸、乙狀結(jié)腸和降結(jié)腸遠(yuǎn)端［13］。結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生始于上皮細(xì)胞的進(jìn)行性轉(zhuǎn)變［14］。CRC的危險(xiǎn)因素包括老齡化、不健康的飲食習(xí)慣、吸煙、肥胖、體育鍛煉不足、膽囊溶解鏈球菌血癥、炎癥性腸病和遺傳因素等。目前，CRC 的臨床治療包括手術(shù)、放療、化療和消融［15］。然而，由于對(duì)CRC 發(fā)展的詳細(xì)機(jī)制尚不完全了解，CRC 的5年生存率較低，特別是晚期［16］。因此，更好的了解CRC發(fā)病機(jī)制對(duì)于為CRC 患者提供有效的診斷和預(yù)后策略具有重要意義。

研究［17-20］表明，異常表達(dá)miRNA 的可能是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。因此，研究miRNA 在CRC 腫瘤發(fā)生中的細(xì)胞和分子機(jī)制，有助于開發(fā)新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，miR?17?5p 在CRC 中表達(dá)升高，敲降miR?17?5p可顯著抑制Lovo細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT。近來，SONG 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，miR?17?5p 在胃癌患者的血漿組織中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)miR?17?5p可抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，miR?17?5p可通過靶向負(fù)調(diào)控RUNX3，促進(jìn)胃癌腫瘤生長；WANG 等［22］報(bào)道，miR?17?5p 在喉鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中異常高表達(dá)，敲降miR?17?5p 可抑制喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和Bcl?2 表達(dá)，促進(jìn)Bax 和Caspase 蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，miR?17?5p 也被報(bào)道作為抑癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，如：LIU 等［9］發(fā)現(xiàn)，miR?17?5p 在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中下調(diào)，可逆轉(zhuǎn)Lnc HOTAIR 的敲低對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞活力、侵襲和遷移的抑制作用。

圖4 miR?17?5p 靶向下調(diào)MYLIP 對(duì)Lovo 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響Fig.4 The effect of miR?17?5p on proliferation and metastasis of Lovo cells by targeting down?regulation of MYLIP

MYLIP 通過細(xì)胞膜蛋白與肌球蛋白細(xì)胞骨架的相互作用，在維持細(xì)胞形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、重塑細(xì)胞骨架蛋白以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附中起著關(guān)鍵作用［11］。此外，MYLIP可以通過與細(xì)胞粘附分子的密切相互作用，對(duì)細(xì)胞的擴(kuò)展、生長、分化和遷移具有重要影響［23］。一旦這些細(xì)胞粘附分子中出現(xiàn)蛋白表達(dá)水平或基因突變，細(xì)胞間的接觸和連接就會(huì)發(fā)生改變，細(xì)胞會(huì)變得更松散而分散，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移［24］。筆者通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MYLIP 是miR?17?5p 的潛在靶基因，敲降miR?17?5p 靶向上調(diào)MYLIP，抑制CRC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，ZHAO等［25］發(fā)現(xiàn)，MYLIP 在乳腺癌患者中表達(dá)降低，過表達(dá)miR?19b 靶向下調(diào)MYLIP 的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移；在前列腺癌中，CNPY2 通過抑制通過MYLIP 介導(dǎo)的AR 泛素化作用的雄激素受體（AR）蛋白降解，促進(jìn)前列腺癌的細(xì)胞生長［10］。然而，本研究結(jié)果并不能排除其他下游目標(biāo)也可能受到miR?17?5p 影響的可能性。此外，MYLIP 在抑制增殖機(jī)制中的作用還有待進(jìn)一步探索。

綜上可知，miR?17?5p 在CRC 中表達(dá)升高，敲降miR?17?5p 可靶向上調(diào)MYLIP 的表達(dá)，抑制Lovo細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。