付赤學(xué) 鄧勁松 李秋穎

1武警重慶總隊(duì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科（重慶400061）；2武警廣東省總隊(duì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科（廣州510507）；3武警吉林省總隊(duì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科（長春130000）

盡管腫瘤化療藥物不斷推陳出新，但是，近幾年腦腫瘤的化療效果仍然不令人滿意，其原因可能是血腦屏障及血腫瘤屏障（blood?tumor barrier，BTB）影響大分子藥物到達(dá)腦腫瘤中的濃度。許多藥物在體外實(shí)驗(yàn)顯示出治療腦腫瘤的巨大潛力，但是由于BTB 的影響，臨床實(shí)驗(yàn)并沒有獲得預(yù)期效果。傳統(tǒng)采用滲透性破壞和輻射誘導(dǎo)的方法可以提高BTB 的通透性。但是，這些傳統(tǒng)的方法在促使BTB 通透性增加的同時(shí)，非選擇性的增加了血腦屏障的通透性，這既增加了藥物的用量又增加了藥物的毒副作用。有學(xué)者用低頻超聲和低功率聚集超聲進(jìn)行了開放大鼠腦膠質(zhì)瘤BTB 的研究并取得了一定的效果［1］，但是需要專門的設(shè)備。而診斷超聲是否能取得類似的效果以及對(duì)于更大動(dòng)物是否有效未見報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn)診斷超聲聯(lián)合微泡超聲造影劑能夠選擇性促進(jìn)血腦屏障的通透性增加［2］，其主要機(jī)理與血腦屏障的緊密連接開放有關(guān)，BTB 與血腦屏障都具有緊密連接，緊密連接是影響藥物通透性的重要組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此，本研究利用超聲激發(fā)微泡產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，選擇性增加BTB 的通透性，提高腫瘤局部紫杉醇的含量，從而在不增加紫杉醇用量的前提下，提高腦腫瘤的化療效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20 只新西蘭大白兔，清潔級(jí)，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，雌雄不限，體重（2.45±0.23）kg。荷VX2 腫瘤種兔由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲工程研究所提供。

1.1.2 超聲診斷儀兔腦腫瘤超聲二維及造影檢查采用LOGIQ E9，12 L 探頭，頻率7.0 MHz，MI 0.13。腫瘤治療采用Sequoia 512，3V2c 探頭，頻率1.75 MHz，輸出強(qiáng)度MI 1.9，超聲波以間斷觸發(fā)方式輻照兔腦，觸發(fā)間隔時(shí)間為400 ms。

1.1.3 微泡超聲造影劑“脂氟顯”由陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍超聲中心自制并提供，粒徑范圍為1 ～5 μm，主要為1 ～2 μm，微泡的濃度為（5 ～7）×109mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組將瘤齡14 d 的荷瘤新西蘭大白兔20 只隨機(jī)分為4 組，每組5 只。即對(duì)照組（記為CON）；單純藥物組（記為PTX）；超聲+藥物組（US+PTX）；超聲+微泡+藥物組（記為US+PTX+MB）。1.2.2 兔腦腫瘤模型參照《兔腦種植VX2 腫瘤動(dòng)物模型的建立》建立兔腦腫瘤模型。首先，將腫瘤兔用速眠新麻醉，腫瘤及周邊脫毛，常規(guī)消毒，取魚肉樣腫瘤組織置于盛有適量生理鹽水的燒杯內(nèi)，用手術(shù)外科剪將腫瘤組織剪成大小約1.5 mm× 1.5 mm × 1.5 mm 的組織顆粒備用。然后，常規(guī)麻醉、脫毛、消毒后，在距顱骨矢狀線和冠狀線各1 cm 處鉆孔開顱，去除兔頂骨約2 cm×2 cm，骨蠟止血，于骨窗中央切開硬腦膜，實(shí)驗(yàn)分組與方法：于腦皮質(zhì)深約2 mm ，植入備用VX2 瘤塊1 枚包埋，明膠海綿少許止血后縫合硬腦膜、頭皮，并再次消毒。肌肉注射適量青霉素，送入動(dòng)物房，常規(guī)喂養(yǎng)14 d，經(jīng)超聲檢查確認(rèn)模型成功，備用。

1.2.3 動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)對(duì)瘤齡14 d 的載瘤兔全部施行常規(guī)超聲檢查，觀察腦腫瘤的大小、形態(tài)、血供等，測量腫瘤的長（L）、寬（D）、高（H），根據(jù)公式（L × D × H × ∏/6）計(jì)算出腫瘤的體積，記為TV，并進(jìn)行方差分析，判定治療前各組實(shí)驗(yàn)兔腫瘤組織體積差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)兔均進(jìn)行超聲造影，觀察動(dòng)脈增強(qiáng)期VX2 兔腦腫瘤是否存在壞死區(qū)域，如有腫瘤壞死排除于實(shí)驗(yàn)組。

1.2.4 紫杉醇注射液的制備常溫下將紫杉醇純品溶解于適量的三醋酸甘油酯中，高效液相色譜法檢測紫杉醇溶液的濃度。

1.2.5 治療過程CON 組不進(jìn)行任何治療；PTX組經(jīng)兔耳緣靜脈9 min 內(nèi)勻速注入紫杉醇溶液（3 mg/kg）；US+PTX 組經(jīng)兔耳緣靜脈9 min 內(nèi)勻速注入紫杉醇溶液（3 mg/kg），同時(shí)診斷超聲波輻照兔腦腫瘤10 min；PTX + MB + US 組經(jīng)兔耳緣靜脈9 min 內(nèi)勻速注入紫杉醇溶液（3 mg/kg）及微泡超聲造影劑（0.02 mL/kg），同時(shí)用診斷超聲波輻照兔腦腫瘤10 min?？偣策M(jìn)行7 次治療，每天一次。最后一次治療完成10 min 后處死實(shí)驗(yàn)兔。完整取出腫瘤組織稱重，取約1/10 腫瘤組織精確稱量、冰凍經(jīng)高效液相色譜測量各種腫瘤組織中紫杉醇的含量。剩余部分福爾馬林固定，24 h 后石蠟包埋、切片、HE 染色，光學(xué)生物顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.2.6 療效評(píng)價(jià)治療后通過測量各組腫瘤質(zhì)量（TM）、計(jì)算抑瘤率（TIR）以及腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)評(píng)價(jià)療效。腫瘤抑瘤率=（對(duì)照組腫瘤平均質(zhì)量?實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均質(zhì)量）/對(duì)照組平均質(zhì)量×100%。凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）的觀察：采用位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡。光學(xué)顯微鏡下觀察染色切片，于400 倍視野下隨機(jī)選取5 個(gè)腫瘤細(xì)胞區(qū)，記數(shù)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算TUNEL 染色陽性細(xì)胞的百分率。AI=（凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0 軟件，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立VX2 腦腫瘤模型超聲檢查發(fā)現(xiàn)瘤齡14 d 的VX2 兔腦腫瘤相較于正常腦組織呈均勻高回聲，邊界清晰（圖1A），CDFI：內(nèi)部未見確認(rèn)的血流信號(hào)（圖1B）。經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注0.05 mL/kg超聲造影劑，可見腫瘤區(qū)迅速均勻強(qiáng)化，沒有無增強(qiáng)區(qū)域（圖1C）。治療前各實(shí)驗(yàn)組腦組織的體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 各組腦腫瘤區(qū)紫杉醇的濃度US+MB+PTX組腦腫瘤中紫杉醇的含量明顯高于US + PTX 組、PTX 組及CON 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。各組腦腫瘤中紫杉醇的含量見圖2。

2.3 各組治療后的質(zhì)量、抑瘤率治療后US +MB + PTX 組體積明顯小于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.4 各組經(jīng)治療后靶區(qū)腫瘤細(xì)胞凋亡TUNEL法檢測，靶區(qū)腫瘤組織凋亡細(xì)胞中有棕黃色顆粒，可見腫瘤細(xì)胞固縮、核碎裂、固縮、染色質(zhì)脫落、形成凋亡小體（圖3）。超聲＋載藥微泡組靶區(qū)腫瘤細(xì)胞凋亡最明顯，其凋亡指數(shù)（AI）最高，與其余各組比較差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01），見圖4。

圖1 瘤齡14 d 的VX2 兔腦腫瘤Fig.1 VX2 rabbit brain tumor at 14 d

圖2 各處理組腦腫瘤區(qū)紫杉醇的濃度Fig.2 Concentrations of paclitaxel in brain tumor areas of each treatment group

圖3 腫瘤細(xì)胞凋亡（×400）Fig.3 Apoptosis of tumor cells（×400）

表1 各組治療后的質(zhì)量、抑瘤率Tab.1 Quality and tumor inhibition rate after treatment in each group ±s

表1 各組治療后的質(zhì)量、抑瘤率Tab.1 Quality and tumor inhibition rate after treatment in each group ±s

注：US+MB+PTX 腫瘤質(zhì)量與各組比較#P<0.05，*P<0.01

分組US+MB+PTX US+PTX PTX CON腫瘤質(zhì)量（mg）516±108.7 697.7±136.2#724.1±131.7*912.0±172.6*抑瘤率（%）34.7±1.4 23.5±1.5 20.6±0.9

圖4 各組經(jīng)治療后靶區(qū)腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）Fig.4 Apoptosis index（AI）of target tumor cells in each group after treatment

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤80%都是轉(zhuǎn)移性腫瘤，大多發(fā)現(xiàn)的時(shí)候已是晚期，手術(shù)切除的可能性很低，因此化療顯得尤其重要。然而，目前腦腫瘤的化療效果并不令人滿意。盡管一些廣譜抗癌藥如紫杉醇、阿霉素等在顱外腫瘤治療中表現(xiàn)良好［3-4］，但是對(duì)腦腫瘤的化療效果不明顯，這可能和BTB阻礙大分子藥物通過有關(guān)。為克服BTB 對(duì)化療藥物通過的阻礙，國內(nèi)外專家分別通過細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞途徑進(jìn)行了一系列的探索［5］。經(jīng)頸動(dòng)脈灌注高滲溶液和作用于血管的緩激肽增加BTB 的通透性，但是持續(xù)時(shí)間短，而不斷重復(fù)給藥，又會(huì)引起顱內(nèi)壓的增高，甚至破壞腦脊液內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［6-7］。有學(xué)者嘗試通過影響緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)提高緊密連接通透性［8-9］。超聲波輻照組織細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的生物學(xué)效應(yīng)，宋陽等［10-13］研究發(fā)現(xiàn)1 MHz，12 mw 的低功率超聲輻照小鼠腫瘤20 s，能抑制caveolin?1 的表達(dá)，調(diào)高occludin 的表達(dá)，跨內(nèi)皮電阻增高，提示緊密連接的通透性增加，選擇性開放BTB，可持續(xù)12 h 之久。也有研究者用低頻低強(qiáng)度聚焦超聲（20 kHz ～1 MHz）進(jìn)行了類似研究［14-16］，發(fā)現(xiàn)低功率聚焦超聲聯(lián)合小劑量緩激肽可上調(diào)caveolea 結(jié)構(gòu)蛋白caveolin?1 的表達(dá)水平，增加吞飲小泡的數(shù)量，使緊密連接相關(guān)蛋白claudin?5、occludin 和ZO?1 的表達(dá)顯著減少，增加BTB 的通透性。超聲對(duì)BTB 的影響具有良好的應(yīng)用前景，但是無論是低功率超聲或是低功率聚焦超聲都需要專門制備相應(yīng)的設(shè)備，不利于推廣應(yīng)用。因此，本課題在前期研究診斷超聲波能夠促進(jìn)血腦屏障通透性增加的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了診斷超聲波激發(fā)微泡超聲造影劑對(duì)BTB 通透性影響的研究。嘗試在不引起廣泛血腦屏障開放的前提下，選擇性地提高大分子藥物紫杉醇跨BTB 轉(zhuǎn)運(yùn)水平，以提高腦腫瘤中紫杉醇的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲激發(fā)微泡作用腫瘤組織組，紫杉醇的濃度達(dá)到（3.86 ± 0.21）μg/g，較對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與以下增強(qiáng)超聲生物效應(yīng)的措施有關(guān)：（1）超聲輻照時(shí)間長，達(dá)到10 min，超聲與微泡協(xié)同的生物效應(yīng)與超聲輻照時(shí)間成正相關(guān)。（2）采用間斷觸發(fā)（⊿t= 400 ms）的方式輻照腫瘤組織，靶區(qū)微泡濃度持續(xù)聚集，形成微泡局部高濃度。在一定濃度范圍內(nèi)，微泡濃度與生物效應(yīng)成正相關(guān)。（3）采用持續(xù)靜脈輸注微泡的方式，與傳統(tǒng)團(tuán)注超聲造影劑比較，肝脾等臟器潴留的微泡數(shù)量明顯減少，有利于血池中持續(xù)存在一定濃度的微泡，有利于超聲激發(fā)微泡持續(xù)作用BTB，從而促使BTB 的通透性進(jìn)一步加大。第四，超聲能量較高，MI 1.9，診斷目的的超聲造影MI 設(shè)置為0.15 左右。隨著超聲能量的增加，生物效應(yīng)更明顯［17］。但是所有這些增強(qiáng)超聲生物效應(yīng)的措施可能會(huì)出現(xiàn)安全性問題，盡管在后續(xù)治療中沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤兔出現(xiàn)即刻的神經(jīng)癥狀，但是否有輻照區(qū)域周圍的腦組織水腫，甚至少量的出血，有待進(jìn)行更深入的安全性研究。

有關(guān)腫瘤組織療效評(píng)價(jià)，觀察了細(xì)胞凋亡情況。凋亡是由相關(guān)基因調(diào)控完成的一種生理現(xiàn)象，貫穿于機(jī)體生長、發(fā)育和死亡的整個(gè)過程。而腫瘤細(xì)胞的一個(gè)最顯著的特性就是出現(xiàn)了凋亡功能的失調(diào)和無限增殖。近年來選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也已成為惡性腫瘤生物治療的新策略［18］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)通過超聲聯(lián)合載紫杉醇微泡靶向釋放于腫瘤組織內(nèi)，引起靶區(qū)腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯高于單純靜脈給藥組及不用紫杉醇治療的空白對(duì)照組，促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用顯著。前期研究發(fā)現(xiàn)診斷超聲輻照超聲造影劑能夠激發(fā)微泡的產(chǎn)生空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng)［19］，促進(jìn)血腦屏障及BTB的通透性增加，從而提高靶區(qū)紫杉醇的含量。而紫杉醇通過促進(jìn)微管的形成抑制其解聚，影響微管在有絲分裂中的正常功能，包括有絲分裂過程中染色體的移動(dòng)、細(xì)胞形成的調(diào)控、激素分泌、細(xì)胞膜上受體的固定等。紫杉醇通過促進(jìn)微管蛋白裝配成微管，然后抑制微管的解聚而穩(wěn)定微管，從而導(dǎo)致微管的異常排列，形成許多短微管束，這些微管束不與微管組織中心相連，微管彼此呈平行排列，與漿膜平行或垂直，在胞漿中出現(xiàn)許多均勻分布的星絲結(jié)構(gòu)。微管星絲是從一個(gè)中心放射發(fā)出的，中心內(nèi)并不含有中心粒，星絲也沒有與染色體連結(jié)。微管的異常，使紡錘體失去正常功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該類藥物可以在缺少鳥苷三磷酸與微管相關(guān)蛋白的條件下誘導(dǎo)形成無功能的微管，使微管不能解聚。紫杉醇為細(xì)胞周期特異性藥物，主要作用于G2 晚期和M 期，影響細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。微泡作為一種靶向治療的載體破壞后釋放的藥物能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、血管壁甚至組織間隙，增強(qiáng)藥物在局部組織的高濃度釋放，由于瘤區(qū)局部紫杉醇的含量增高，因此腫瘤細(xì)胞凋亡更明顯，從而發(fā)揮靶向治療作用［20］。

超聲激發(fā)微泡使BTB 通透性增加的機(jī)理可能是多方面的。通過前期對(duì)大鼠及兔血腦屏障的研究發(fā)現(xiàn)，超聲激發(fā)微泡能夠產(chǎn)生聲孔效應(yīng)，空化產(chǎn)生的微射流可能提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，超聲激發(fā)微泡產(chǎn)生共振，從而激發(fā)空化效應(yīng)，這可能促使腫瘤血管的緊密連接開放，以細(xì)胞旁路方式［21-22］，從而增加紫杉醇進(jìn)入腫瘤組織的通道，達(dá)到提高腫瘤組織中藥物濃度的目的。當(dāng)然，血腫瘤屏障除了機(jī)械屏障而外，還有電化學(xué)屏障［23］。因此，是否引起了血腫瘤屏障的電阻抗改變，是否像低頻超聲一樣引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞飲小體的增加都值得進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

研究表明，診斷超聲聯(lián)合微泡組腫瘤的抑瘤率明顯高于對(duì)照組，初步顯示了其良好的應(yīng)用前景，是一種有前途的臨床腫瘤治療技術(shù)。隨著各種兼具診斷治療雙重作用的超聲探頭的研制，以及對(duì)超聲生物學(xué)效應(yīng)的深入研究，微泡介導(dǎo)腫瘤靶向治療將為臨床腫瘤的治療帶來新的希望。