周天順 余東 劉玲 歐陽寧 袁貴龍 段美娟 袁定陽

(1湖南雜交水稻研究中心/雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長沙 410125; 2湖南大學(xué) 研究生院隆平分院, 長沙 410125; 3湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 長沙 410125;4湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 長沙 410126; #共同第一作者; *通信聯(lián)系人, E-mail: duanmeijuan@163.com; yuandingyang@hhrrc.ac.cn)

非生物脅迫是阻礙水稻生長、發(fā)育和繁殖的主要因素之一[1]。研究表明，干旱、高鹽、高溫等非生物脅迫可能會導(dǎo)致水稻大面積減產(chǎn)，甚至絕收[2]。而通過挖掘逆境相關(guān)基因選育耐逆水稻品種是降低逆境脅迫危害最有效的途徑之一。

AFP蛋白（ABI5結(jié)合蛋白，ABI5 binding protein）可以通過抑制ABI5活性，參與植物生長發(fā)育和多種逆境脅迫響應(yīng)[3]。研究表明，AtTMAC2(AtAFP4)過表達(dá)擬南芥對 ABA和鹽的敏感性降低，存活率下降，葉中淀粉積累增多，生育期延遲，根長伸長受到抑制[4]。AtAFP2通過調(diào)節(jié) SOM 的表達(dá)，GA和 ABA的動態(tài)平衡，打破種子由高溫所引起的二次休眠[5]。AtAFP2還可形成 CO-AFP2-TPR2蛋白復(fù)合體負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的開花時(shí)間，AtAFP3和AtAFP4同樣影響開花時(shí)間，但其機(jī)制是否相同有待進(jìn)一步研究[4,6-7]。OsMODD通過MODD-TPR3-HDA702和MODD-OsOTLD1復(fù)合體在干旱恢復(fù)期促進(jìn)OsbZIP46蛋白的降解，防止干旱相關(guān)基因的過度表達(dá)影響水稻生長發(fā)育[8-9]。向日葵HaABRC5基因響應(yīng) ABA、干旱和鹽脅迫[10]。在擬南芥中異源過表達(dá)類GgAFP基因可降低擬南芥種子萌發(fā)期的ABA敏感性，并改變ABA相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)種子萌發(fā)[11]。

前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)水稻AFP家族基因AFP1（MODD）被ABA、干旱等多種激素和非生物脅迫處理誘導(dǎo)表達(dá)[15]。為進(jìn)一步鑒定AFP1在水稻非生物脅迫抗性中的作用，快速創(chuàng)制優(yōu)異等位基因。我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對AFP1基因進(jìn)行定向編輯，以期創(chuàng)制耐逆性提高的突變體材料。

1 材料與方法

1.1 材料與載體

以優(yōu)異秈型恢復(fù)系華占為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，所有材料種植于湖南雜交水稻研究中心網(wǎng)室，常規(guī)水肥管理。sgRNA表達(dá)載體pYLgRNA- U3/U6和敲除載體pYLCRISPR/ Cas9-MH9（MT）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光課題組饋贈。引物（表 1）合成和測序均委托湖南擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建

利用CRISPR-GE（http://skl.scau.edu.cn/）設(shè)計(jì)AFP1（Os03g0214200）敲除靶點(diǎn)。利用IDT Oligo Analyzer 3.1在線軟件(https://eu.idtdna.com/calc/analyzer)計(jì)算 GC含量。載體構(gòu)建參見單子葉敲除載體構(gòu)建方法[16]。將MT-AFP1載體送至武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.3 T0代陽性株系獲得及突變位點(diǎn)檢測

采用CTAB法提取T0代植株的基因組DNA，利用Hpt和Cas9（表 1）進(jìn)行陽性植株檢測。利用AFP1-J擴(kuò)增靶位點(diǎn)序列進(jìn)行測序。測序結(jié)果為雙峰的株系，利用TA克隆+測序確定突變位點(diǎn)。

1.4 T1代無T-DNA株系篩選及脫靶位點(diǎn)分析

以T1代植株DNA為模板，HPT-F/R和Cas9-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。兩者均不能擴(kuò)出目的條帶的株系為無 T-DNA株系，用于下一步分析。利用CRISPR-GE預(yù)測脫靶位點(diǎn)。每個(gè)株系隨機(jī)選取 20株，對前3個(gè)最高脫靶率的位點(diǎn)進(jìn)行檢測。

表1 本研究所用引物Table 1. Primers used in this study.

1.5 T2代純合突變體農(nóng)藝性狀調(diào)查

水稻完全成熟后，在非邊際區(qū)域隨機(jī)調(diào)查突變體和野生型(每個(gè)株系5株)的株高、有效分蘗數(shù)、一次枝梗數(shù)、穗長、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株產(chǎn)量。

1.6 afp1突變體耐逆性鑒定

對 4葉期幼苗進(jìn)行脅迫處理。極速干旱處理：將幼苗直接暴露在空氣中直至萎蔫表型；高溫處理：將幼苗放置在42℃（濕度為70%）人工氣候箱處理至葉片壞死。冷處理：將幼苗轉(zhuǎn)移至 4℃的培養(yǎng)箱中處理2～3 d。處理后正常條件下恢復(fù)1周，統(tǒng)計(jì)存活率。

40粒發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)移至裝有含150 mmol/L甘露醇、200 mmol/L NaCl的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，分別進(jìn)行滲透脅迫和鹽脅迫抗性鑒定，培養(yǎng)7～10 d后，統(tǒng)計(jì) 10株幼苗的株高、根長和鮮質(zhì)量。對照處理采用1/2 MS固體培養(yǎng)基。

隨著人民水平的提高，越來越多的人飼養(yǎng)寵物。城市中的寵物，由于其生活空間小，周圍的犬只少，公犬獲得交配的機(jī)會十分的少。如果犬只沒有被閹割的話，公犬達(dá)到中老年以后(尤其是6歲以后)，其發(fā)生前列腺膿腫的幾率會很大。而且在臨床上這幾年犬的前列腺膿腫也在增加。在診斷方面，由于醫(yī)生的水平和醫(yī)院的儀器設(shè)備不同，理論上最好要用B超檢查，然后腹腔探查確診，但國內(nèi)對于該疾病不是特別重視，誤診、漏診的幾率很大；在治療方面，由于前列腺的特殊結(jié)構(gòu)，其藥物治療效果（尤其在抗菌方面）不是很好。

1.7 ABA敏感性分析

萌發(fā)期：去殼種子消毒處理后，置于含3 μmol/L ABA的1/2 MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。對照處理采用1/2 MS固體培養(yǎng)基。

苗期：去殼種子進(jìn)行消毒處理后，轉(zhuǎn)移至 1/2 MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d，將生長狀況一致的發(fā)芽種子置于含3 μmol/L ABA的1/2 MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～10 d，統(tǒng)計(jì)幼苗的株高、根長和鮮質(zhì)量。對照處理采用1/2 MS固體培養(yǎng)基。

1.8 離體葉片失水率的測定

取4葉期突變體與野生型的全展葉，每個(gè)株系取3片，擦干表面水分后置于室溫條件，每隔0.5 h測量葉片質(zhì)量，直至恒重。葉片失水率（%）=（初始葉片鮮質(zhì)量-某一時(shí)間葉片鮮質(zhì)量）/初始葉片鮮質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFP1敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

為提高突變效率，在AFP1第1外顯子靠近起始密碼子ATG處設(shè)計(jì)了兩個(gè)20 bp的敲除靶點(diǎn)T1和 T2，PAM序列分別為 AGG和 CGG，T1位于ATG下游25-47 bp，T2位于ATG下游117-140 bp（圖1-A）。MT-AFP1敲除載體如圖1-B。

2.2 afp1突變體敲除特征分析

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得12株轉(zhuǎn)MT-AFP1載體水稻，檢測陽性株系發(fā)現(xiàn)，所有植株均能擴(kuò)增出特異性條帶，說明12株均為陽性植株（表2）。突變位點(diǎn)分析表明，8個(gè)株系的靶點(diǎn)T1發(fā)生突變，9個(gè)株系的靶點(diǎn)T2發(fā)生突變，T1和T2位點(diǎn)的編輯效率分別為66.67%和75.00%。T1和T2靶點(diǎn)突變基因型類型最多的均為雙等位突變，分別為75.00%和44.44%；而嵌合突變僅存在于T2中，概率為11.12%。

圖1 利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向突變OsAFP1基因Fig. 1. Directed mutation of OsAFP1 using CRISPR/Cas9 technology.

表2 T0代突變體突變基因型比率Table 2. Mutant genotype ratios of T0 mutations.

圖2 突變體特征分析Fig. 2. Analysis of mutation type.

突變株系中僅存在插入和缺失突變，分別占80.0%和20.0%（圖2）。突變類型中絕大部分為插入突變，而插入堿基數(shù)均為1 bp，其中插入腺嘌呤（A）和胞嘧啶（C）約為96.96%。90%突變體的突變長度少于5 bp（圖2）。

2.3 不含外源基因T2代純合敲除突變體的獲得

通過無外源 T-DNA篩選和突變位點(diǎn)鑒定，我們獲得了 6個(gè)不含外源基因的純合突變株系KO1～KO6（圖3）。蛋白質(zhì)序列分析表明，除KO2株系為 31個(gè)氨基酸的缺失外，其他突變體株系均發(fā)生移碼突變，造成蛋白質(zhì)翻譯的提前終止。脫靶分析表明，預(yù)測脫靶位點(diǎn)的錯(cuò)配堿基數(shù)為 2～5個(gè)，脫靶概率為0.136～0.353，KO1～KO6純合突變體中6個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)均未發(fā)生突變。

圖3 T2代純合敲除突變體的突變類型Fig. 3. Mutated types of T2 homozygous mutants.

2.4 T2代純合突變體農(nóng)藝性狀調(diào)查

純合突變體株高有不同程度的降低，生育期提前，有效分蘗增多（圖 4）。穗部性狀調(diào)查表明，突變體穗長顯著增加，一次枝梗數(shù)和每穗粒數(shù)與野生型相當(dāng)。突變體和野生型的千粒重?zé)o顯著差異，突變體的結(jié)實(shí)率下降，但只有 KO3株系達(dá)到顯著水平。各突變體株系的單株產(chǎn)量呈現(xiàn)不同的趨勢，KO1株系的單株產(chǎn)量顯著上升，KO2株系的單株產(chǎn)量增加但未達(dá)到顯著水平，而 KO3株系的單株產(chǎn)量卻顯著下降。

圖4 afp1敲除突變體和野生型的表型比較Fig. 4. Phenotypic comparisons of afp1 knockdown mutants and the wild type.

2.5 afp1突變體ABA敏感性增加

為研究AFP1是否參與ABA信號途徑調(diào)控，我們進(jìn)行ABA敏感性測試（圖5）。結(jié)果表明，3 μmol/L ABA處理后，突變體幼苗的株高、根長和鮮質(zhì)量均顯著低于野生型，種子萌發(fā)率也顯著降低，正常條件下，野生型和突變體之間卻沒有明顯區(qū)別。這些表明敲除AFP1后水稻ABA敏感性升高。

2.6 afp1突變體多種非生物脅迫抗逆性提高

ABA依賴型途徑是植物響應(yīng)干旱的主要信號途徑。極速干旱12 h后,afp1突變體和野生型均出現(xiàn)葉片卷曲、植株萎蔫等失水癥狀，復(fù)水10 d后，突變體綠葉面積多，存活率明顯高于野生型（圖6-A和B），說明afp1突變體耐旱性提高。

大田生產(chǎn)中，高溫脅迫往往與干旱脅迫同時(shí)出現(xiàn)，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量。熱脅迫處理15 d后，野生型和突變體葉片發(fā)白，葉片卷曲，但突變體的綠葉面積和生長狀態(tài)明顯好于野生型，而萎蔫程度低于野生型。以上結(jié)果表明，afp1突變體的耐熱性提高。

為進(jìn)一步探討水稻耐旱和耐熱性增強(qiáng)的原因，我們進(jìn)行了離體葉片水分散失率實(shí)驗(yàn)。突變體的水分散失率明顯低于野生型，說明突變體的水分散失慢（圖6-D）。此外，突變體在甘露醇脅迫下的株高和根長顯著長于野生型，根和地上部分的鮮質(zhì)量顯著增高，而正常條件下表型相似，表明afp1突變體的耐滲透脅迫能力增強(qiáng)（圖6-C～F）。

圖5 野生型和突變體ABA敏感性分析Fig. 5. ABA sensitivity of WT and mutants.

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)體系中影響編輯效率的因素有很多，如sgRNA設(shè)計(jì)、sgRNA啟動子、Cas蛋白、轉(zhuǎn)化體系等[17]。sgRNA適宜GC含量在30%～80%之間，需具有完整二級結(jié)構(gòu)，且無7個(gè)以上連續(xù)堿基對[17-18]。靶點(diǎn)1（T1）和靶點(diǎn) 2（T2）的GC含量分別為70%和75%，位于適宜的GC含量范圍，最多僅有3個(gè)連續(xù)相同堿基。編輯效率和GC呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)關(guān)系，T1的編輯效率稍低于T2，可能是由于T1的GC含量低于T2所導(dǎo)致的。插入突變中，90%以上為A或T堿基，具有明顯的A/T偏好性[16]（圖2）。就突變長度而言，突變長度主要集中在5 bp以下的小片段，這與Li等[19]的報(bào)道相似（圖2）。T1和T2潛在脫靶位點(diǎn)中，均未發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象發(fā)生。首先，這可能和嚴(yán)格的 sgRNA設(shè)計(jì)有關(guān)[20]。其次，和載體 Cas9蛋白經(jīng)過優(yōu)化，識別準(zhǔn)確度高、活性好有關(guān)[16]。

在同一水肥管理的大田環(huán)境下，突變體和野生型的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出一定的差異。afp1突變體和野生型相比的生育期稍微提前，這在擬南芥中也有相似的報(bào)道，過表達(dá)AtAFP2/3/4均能造成晚花表型，AtAFP2通過CO-AFP2-TPR2復(fù)合體調(diào)控?cái)M南芥的開花時(shí)間[4,6-7]。據(jù)報(bào)道，AFP1（MODD）可以抑制ABA信號途徑，及時(shí)減少水稻因抗性提高所帶來的能量消耗[8]。afp1突變體的株高有不同程度的下降，這可能是由于敲除AFP1基因后，提高了植物的抗逆性，增加了能量的消耗所導(dǎo)致的（圖 4）。雖然突變體穗長顯著增加，但是未導(dǎo)致突變體每穗粒數(shù)的增加，這可能和一次枝梗數(shù)降低相關(guān)（圖 4）。水稻的產(chǎn)量主要由有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重共同決定。KO1和KO2的單株產(chǎn)量較野生型有所增加，結(jié)實(shí)率降低，但千粒重和每穗粒數(shù)均無明顯變化，表明這主要是有效分蘗顯著增加所引起的。KO3的單株產(chǎn)量卻顯著下降，這是由于KO3結(jié)實(shí)率下降所導(dǎo)致的產(chǎn)量損失大于通過有效分蘗增加的產(chǎn)量。這表明afp1具有育種應(yīng)用潛力，但需要對突變體材料進(jìn)行嚴(yán)格篩選，淘汰對產(chǎn)量和其他農(nóng)藝性狀有明顯負(fù)面影響的株系。

圖6 耐旱性和耐滲透性鑒定Fig. 6. Identification of drought and osmotic stress tolerances.

afp1突變體多種非生物脅迫篩選發(fā)現(xiàn)，osafp1突變體的耐旱性、耐滲透脅迫能力和耐熱性顯著提高，但耐鹽性和耐寒性沒有影響(圖6)。擬南芥AFP成員突變體均對ABA超敏感，而osafp1突變體萌發(fā)期和苗期ABA敏感性升高，暗示植物中AFP蛋白的功能比較保守。atafp2-4突變體的耐鹽性均顯著提高，而osafp1突變體在200 mmol/L鹽脅迫處理下存活率和生長狀態(tài)和野生型相似[21-22]。afp1突變體抗逆性增強(qiáng)的原因主要包括兩個(gè)方面：第一，在干旱脅迫和 200 mmol/L甘露醇處理下，osafp1突變體的根顯著長于野生型，這有助于干旱條件下植物的水分吸收，提高自身的水分含量，而另一方面，osafp1突變體的離體葉片失水率顯著降低，減少自身的水分散失，從而提高了抗逆性。