安卓，謝聰聰，趙明，王雪瑩，王樹松，尚丹丹*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生院，石家莊 050017；2.河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，河北省生殖醫(yī)院，國家衛(wèi)生健康委員會計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050071)

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，自2012年以來，不孕不育發(fā)病率為3%～4%，而我國不孕不育發(fā)病率高達(dá)12.5%～15%，其中女性因素占一半，不孕不育已經(jīng)成為全球日益嚴(yán)重的問題[1-2]。自世界首例采用IVF-ET技術(shù)的試管嬰兒誕生以來，篩選優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞和胚胎并獲得健康的子代一直是IVF的目標(biāo)，但影響卵母細(xì)胞質(zhì)量、胚胎發(fā)育和植入的因素有很多。隨著年齡的增長，女性卵巢儲備功能減退，影響了卵母細(xì)胞的質(zhì)量，因此會出現(xiàn)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能逐漸降低，導(dǎo)致35歲以上女性的生育力顯著下降的現(xiàn)象[3]。如何提高卵母細(xì)胞質(zhì)量一直是不孕領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

線粒體是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的一個關(guān)鍵因素[4-5]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)主要的產(chǎn)能細(xì)胞器和活性氧(ROS)的來源，可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化成丙酮酸，轉(zhuǎn)運(yùn)到卵母細(xì)胞中生成三磷酸腺苷(ATP)，參與減數(shù)分裂紡錘體的生成及第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ期)紡錘體結(jié)構(gòu)的維持。在減數(shù)分裂中期，卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體的動態(tài)分布可啟動紡錘體的遷移，這說明線粒體動力學(xué)對卵母細(xì)胞成熟及下一步發(fā)育至關(guān)重要[6]。當(dāng)線粒體出現(xiàn)功能異常、能量儲備不足，會導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂異常，非整倍體發(fā)生率增加[7]。線粒體通過調(diào)節(jié)鈣離子、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和ROS等多種信號因子，影響卵母細(xì)胞凋亡。本文主要探究線粒體形態(tài)、功能與卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系。

一、線粒體與卵母細(xì)胞發(fā)育

1.線粒體數(shù)量、結(jié)構(gòu)、空間分布與卵母細(xì)胞發(fā)育：線粒體是相互連接、具有高能動性的細(xì)胞器，對于維持細(xì)胞的正常功能、生長和發(fā)育必不可少，在機(jī)體出現(xiàn)生理和病理變化時會發(fā)生動態(tài)改變[8-9]。Liang等[10]和劉珊等[11]研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞成熟前后線粒體分布不同，成熟卵母細(xì)胞中線粒體均勻分布，而未成熟卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體分布在核周圍，出現(xiàn)異常的線粒體體積膨大并且呈現(xiàn)均勻的簇狀分布。所以，線粒體的空間分布可以作為卵母細(xì)胞發(fā)育程度評估的重要指標(biāo)之一。

在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中，線粒體數(shù)量會急劇增加，與初級卵母細(xì)胞相比，成熟卵母細(xì)胞的線粒體可以從幾十個增加到一百多萬個[12-13]。

在卵母細(xì)胞成熟和衰老過程中，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等各種膜細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)會發(fā)生動態(tài)變化，細(xì)胞器聚集與生殖細(xì)胞的形成和表觀遺傳調(diào)控有關(guān)[9，14]。2010年，Liu等[15]通過實(shí)驗(yàn)確定了線粒體的3種分布模式：外圍、半外圍和均勻擴(kuò)散，其中生發(fā)泡期(GV期)卵母細(xì)胞線粒體大多在外圍分布，在發(fā)育成熟的減數(shù)分裂時期卵母細(xì)胞內(nèi)，線粒體大多均勻擴(kuò)散分布，少量的線粒體介于這兩種分布模式之間，呈半外圍分布。隨著年齡的增加，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，線粒體的狀態(tài)也隨之發(fā)生改變。在卵母細(xì)胞GV期，線粒體呈幼稚型，為圓形或橢圓形，少嵴，呈管泡狀嵴，分布在細(xì)胞質(zhì)中；當(dāng)進(jìn)行減數(shù)分裂時，即在生發(fā)泡破裂期，線粒體呈成熟型，長梭形，基質(zhì)加深，嵴呈板層狀[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，年輕女性卵母細(xì)胞的線粒體多呈圓形，有少量的平行管狀或泡狀嵴和均勻的基質(zhì)密度，而高齡(≥35歲)女性卵母細(xì)胞的線粒體細(xì)長且基質(zhì)內(nèi)有大量的嵴和較多的高密度顆粒，顆粒細(xì)胞中還偶爾可見線粒體腫脹或空泡[17]。

2.線粒體DNA拷貝數(shù)及完整性與卵母細(xì)胞發(fā)育：線粒體由線粒體基因組和核基因組雙重編碼。線粒體DNA(mtDNA)的多拷貝特性可導(dǎo)致異質(zhì)性，是判斷線粒體功能的重要指標(biāo)[18]。隨著年齡增長，卵母細(xì)胞線粒體自由基活性增強(qiáng)，mtDNA由于缺乏組蛋白和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的保護(hù)而無法自我修復(fù)，容易發(fā)生突變。所以mtDNA的拷貝數(shù)和完整性對卵母細(xì)胞質(zhì)量尤為重要。

隨著卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，線粒體復(fù)制增多。到第二次減數(shù)分裂中期，1個成熟的卵母細(xì)胞內(nèi)有1萬個線粒體，大約5萬到150萬個mtDNA拷貝數(shù)[19]。卵母細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)與受精、胚胎發(fā)育潛能呈正相關(guān)。Bentov等[20]發(fā)現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)少的卵母細(xì)胞發(fā)育不良。Chan等[21]研究發(fā)現(xiàn)年齡超過35歲的女性卵母細(xì)胞中mtDNA 4977片段缺失發(fā)生率更高，而且mtDNA拷貝數(shù)較低，提示mtDNA拷貝數(shù)與供體的年齡呈負(fù)相關(guān)。Murakoshi等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與未受精卵母細(xì)胞和未卵裂胚胎相比，退化卵母細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)顯著降低。Pasquariello等[14]也證明小鼠和女性卵母細(xì)胞成熟前后拷貝數(shù)有顯著改變，但體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)高于體外成熟，表明mtDNA的降解是影響卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵因素。

老年婦女卵母細(xì)胞中的mtDNA常發(fā)生一些與年齡相關(guān)的突變，其線粒體基因組存在同質(zhì)A3302G突變，此突變破壞了高度保守的堿基對(2T-71A)并導(dǎo)致mt-tRNA異常，此突變攜帶者的mtDNA拷貝數(shù)較低，并可能導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞質(zhì)量和后期受精情況[23]。缺失mtDNA 4977片段會對線粒體酶類物質(zhì)合成造成干擾，出現(xiàn)氧化磷酸化功能異常、能量合成障礙[24]。Keefe等[25]首次在老年女性卵母細(xì)胞的mtDNA上發(fā)現(xiàn)了5 kb的片段缺失，認(rèn)為未受精卵母細(xì)胞中缺失的mtDNA可作為卵母細(xì)胞衰老的標(biāo)志物。后來 Yesodi等[26]在年輕患者中發(fā)現(xiàn)了卵母細(xì)胞mtDNA 5286片段突變，這種突變有可能是卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的標(biāo)志。

3.線粒體膜電位與卵母細(xì)胞發(fā)育：線粒體在產(chǎn)生能量時會將電化學(xué)勢能儲存于線粒體內(nèi)膜，若質(zhì)子及其他離子濃度的不對稱分布就會在內(nèi)膜兩側(cè)形成線粒體膜電位(MMP)。正常的MMP是線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的必要條件，MMP的穩(wěn)定有助于維持卵母細(xì)胞的正常機(jī)能。當(dāng)MMP下降時，線粒體腫脹、ATP水解、離子穩(wěn)態(tài)遭到破壞，釋放促凋亡因子(如細(xì)胞色素C)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27]。

Van Blerkom等[28]發(fā)現(xiàn)，MMP的高低決定了線粒體功能，包括ATP的產(chǎn)生、鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，并且發(fā)現(xiàn)隨著女性年齡的增加，MⅡ卵母細(xì)胞中MMP會降低，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育。Martínez-Quezada等[29]研究發(fā)現(xiàn)在卵母細(xì)胞生小泡破裂(GVBD)階段，暴露于全氟己烷磺酸鹽(PFHXS)的卵母細(xì)胞MMP顯著降低，說明PFHXS通過降低MMP抑制卵母細(xì)胞的成熟。

Liu等[30]的研究結(jié)果提示褪黑素可在體外成熟(IVM)期間通過維持人未成熟卵母細(xì)胞的MMP、降低Ca2+水平，來減輕人卵母細(xì)胞的氧化應(yīng)激。加了褪黑素的卵母細(xì)胞MMP顯著增加，保證了未成熟卵母細(xì)胞健康發(fā)育[31]。

4.線粒體ATP水平與卵母細(xì)胞發(fā)育：卵母細(xì)胞在發(fā)育成熟的過程中需要大量的ATP，主要通過線粒體進(jìn)行氧化磷酸化(OXPHOS)反應(yīng)獲得[32]。OXPHOS由電子傳輸鏈(ETC)組成，ETC包括4種多聚酶復(fù)合體(復(fù)合體Ⅰ指輔酶Q氧化還原酶復(fù)合體，復(fù)合體Ⅱ指琥珀酸脫氫酶，復(fù)合體Ⅲ指細(xì)胞色素C氧化還原酶復(fù)合體，復(fù)合體IV指細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體)、兩種移動電子載體(NAD+/NADP+，F(xiàn)AD/FAM)以及ATP合酶(也稱為復(fù)合物V，cV)。ETC進(jìn)行細(xì)胞呼吸時會發(fā)生氧化還原反應(yīng)，同時產(chǎn)生cV，是合成ATP的質(zhì)子原動力[33]。已有研究表明，在卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中，ATP不足會導(dǎo)致非整倍體增加，導(dǎo)致染色體分離異常[34]。此外，Zhao等[35]發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞和胚胎中ATP含量越高，不孕癥患者的妊娠結(jié)局越好。

卵母細(xì)胞成熟過程中，許多能量底物在線粒體內(nèi)通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化代謝途徑產(chǎn)生ATP，充足的ATP供給保證了卵母細(xì)胞至囊胚期胚胎的發(fā)育[36]。Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)與高齡組(≥35歲)相比，年輕組(<35歲)卵泡液中顆粒細(xì)胞的ATP水平更高，并且ATP5A1作為OXPHOS的4種蛋白質(zhì)之一，其表達(dá)隨年齡增長而降低，說明衰老引起的顆粒細(xì)胞功能障礙主要與線粒體OXPHOS復(fù)合物表達(dá)有關(guān)，改善顆粒細(xì)胞中的OXPHOS功能可成為解決高齡女性不育癥的突破口。

5.線粒體ROS水平與卵母細(xì)胞發(fā)育：線粒體既是ROS的生產(chǎn)者，也是ROS的靶標(biāo)。mtDNA由于沒有組蛋白保護(hù)，更容易因產(chǎn)生過量ROS導(dǎo)致自身受損。線粒體是ROS的一個主要來源，ROS會導(dǎo)致mtDNA突變的積累，反過來引起ETC功能失調(diào)，從而產(chǎn)生更高效的ROS，形成一個惡性循環(huán)，這是線粒體功能障礙、細(xì)胞衰老和凋亡的主要原因[37]。線粒體產(chǎn)生ATP的過程中，也會生成一定量的ROS，但少量的ROS會被線粒體中的抗氧化酶清除，以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)。當(dāng)線粒體功能出現(xiàn)障礙時，ROS的產(chǎn)生會增加。過量的ROS可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，對卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程產(chǎn)生影響，加速卵母細(xì)胞的凋亡[38]。電子傳遞系統(tǒng)會持續(xù)產(chǎn)生ROS，使得細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，影響線粒體功能，從而降低ATP的合成量，影響減數(shù)分裂過程中染色體分離和紡錘體裝配。過量的ROS會導(dǎo)致卵母細(xì)胞脆弱性增加，導(dǎo)致紡錘體不穩(wěn)定、染色體異常、端?？s短以及衰老的卵母細(xì)胞發(fā)育能力下降。也有研究表明，高濃度的ROS會上調(diào)mtDNA突變率，造成線粒體功能障礙，降低輔助生殖技術(shù)成功率[39]。

二、線粒體功能的改善

線粒體對卵母細(xì)胞的發(fā)育和功能至關(guān)重要。通過線粒體移植、線粒體營養(yǎng)劑等方法增強(qiáng)線粒體功能，可以作為輔助治療技術(shù)的補(bǔ)充治療，以提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量，改善胚胎發(fā)育[40]。

線粒體移植是將體外分離得到的供體細(xì)胞(目前主要是顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)的線粒體，通過顯微注射注入MⅡ期卵母細(xì)胞。異體體細(xì)胞線粒體移植是指用外源性體細(xì)胞正常的線粒體注射替換不孕女性的卵母細(xì)胞線粒體的一種治療方法，即線粒體替代療法[41]。隨著技術(shù)發(fā)展，卵胞質(zhì)移植、原核移植、生發(fā)泡移植、紡錘體移植、極體移植相繼出現(xiàn)。但外源性線粒體的植入或許會導(dǎo)致后代出現(xiàn)攜帶兩種來源線粒體的情況，因?yàn)榫€粒體具有異質(zhì)性，所以可能會引起健康隱患[42]。

自體細(xì)胞線粒體移植是指用自身其他組織內(nèi)正常細(xì)胞線粒體替換卵母細(xì)胞線粒體的一種治療方案[43]。目前自體線粒體移植技術(shù)已在臨床上應(yīng)用。Tzeng等[44]首次通過線粒體移植技術(shù)將患者自己卵丘顆粒細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)移到了卵母細(xì)胞中，避免了供體和受體mtDNA的異質(zhì)性，幫助患者成功妊娠?？琢罴t等[45]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)自體線粒體移植后，患者胚胎質(zhì)量改善、妊娠率和種植率均升高。方叢等[46]利用卵母細(xì)胞內(nèi)注射自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體技術(shù)，為解決原發(fā)不孕夫婦胚胎質(zhì)量差及妊娠結(jié)局差等問題提供了新思路。自體線粒體移植會增加卵母細(xì)胞的能量并改善后續(xù)IVF結(jié)果，是治療線粒體異常導(dǎo)致的卵巢儲備功能減退引起不孕或多次胚胎移植失敗患者的有效方法[47]。

綜上所述，線粒體的數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)、mtDNA拷貝數(shù)、線粒體膜電位、產(chǎn)生的ATP和ROS均會影響卵母細(xì)胞的發(fā)育。隨著研究的不斷深入，線粒體逐漸成為評判卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要非侵入性評估手段。但是，線粒體影響卵母細(xì)胞發(fā)育的功能機(jī)制尚不明確。在原有基礎(chǔ)上向前推進(jìn)線粒體和卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系，可以改善女性卵母細(xì)胞質(zhì)量，對改善輔助生殖技術(shù)臨床結(jié)局和提高臨床妊娠率也具有重要意義。