陳聰,胡長利,謝晶,3*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術服務平臺，上海，201306) 3(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海，201306) 4(南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司 研發(fā)中心，江蘇 南京，211106)

牛乳是一種營養(yǎng)豐富的天然食品，含有人體所需的全部氨基酸、多種維生素和礦物質及乳糖、乳脂肪和乳蛋白等[1]，牛乳同時也是微生物的優(yōu)良培養(yǎng)基，為延長牛乳的保質期、調節(jié)淡旺季，常會對其進行加工處理。濃縮是一種常用的牛乳加工步驟，可有效提高牛乳的總固形物含量，牛乳濃縮后也可以用于生產奶粉、煉乳等乳制品，以及降低冷凍牛奶凍結過程中的能耗。牛乳中水分含量約為87%，濃縮將牛乳中的部分水去除，將極大地降低加工、包裝、貯藏和運輸成本。

液態(tài)食品的濃縮方法主要有蒸發(fā)濃縮、冷凍濃縮和膜分離濃縮等。蒸發(fā)是食品工業(yè)中應用最廣泛的濃縮方法之一，常在真空條件下進行，能有效降低濃縮溫度。SABANCI等[2]研究了歐姆加熱輔助真空蒸發(fā)對濃縮酸櫻桃汁品質的影響，冷凍濃縮利用了冰和水溶液之間的固液相平衡原理，使部分水以冰的形式結晶析出并分離出去，從而實現(xiàn)濃縮。秦貫豐等[3]對比研究了蘋果汁的真空蒸發(fā)濃縮和冷凍濃縮，結果表明冷凍濃縮的蘋果汁品質更高，但真空蒸發(fā)濃縮能實現(xiàn)更高的濃縮濃度。膜分離濃縮利用分離膜的選擇透過性將溶劑與溶質分離，達到濃縮的目的。牛乳是一種熱敏性食品，過高的溫度會破壞其營養(yǎng)物質，而膜技術是一種能在常溫下實現(xiàn)分離的技術，因此在牛乳濃縮[4]，乳酪蛋白提取[5]，乳脂分離[6]等乳品工業(yè)方面應用廣泛。經過濃縮后，牛乳中的酪蛋白膠束結構分布更加緊密，礦物質在可溶性相與膠體相之間的分布發(fā)生變化。有研究表明牛乳濃縮后總固形物含量上升，pH值降低，黏度增加[7]。

凍結作為一種保鮮方法，可抑制牛乳中微生物繁殖，降低脂肪酶和蛋白酶的活性，因而能夠長期有效地保藏牛乳[8]。LUCCIA等[9]研究了在冷凍貯藏期間牛乳蛋白質的水解。RUTIGLIANO等[10]研究了牛乳在冷凍貯藏期間α-酪蛋白的含量變化。凍結食品品質會受到凍結方式的影響，有研究表明，凍結速率越快，凍品的品質越好[11]。譚明堂等[12]對比研究了冰箱凍結、平板凍結、螺旋凍結和超溫冷庫凍結4種凍結方式對魷魚品質的影響。目前關于牛乳的凍結研究，主要集中在冷凍貯藏期間牛乳的品質變化，而不同凍結方式對牛乳品質影響的研究鮮有報道。

為研發(fā)冷凍牛奶的新工藝，評估濃縮和凍結工藝對牛乳品質的影響，本實驗以牛乳為研究對象，研究牛乳在濃縮后色度、粒度、熱穩(wěn)定性、乙醇穩(wěn)定性等理化性質的變化，及不同凍結方式對其品質的影響，為牛乳的濃縮工藝的優(yōu)化及凍結方式的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳(蛋白質3.13%，脂肪3.54%，總固形物11.83%)，上海奉賢某奶牛場；無水乙醇,生物工程(上海)股份有限公司；尼羅紅、低熔點瓊脂糖，美國Sigma公司；NaOH(分析純)、丙酮(色譜純)、酚酞，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設備

JW-Y-2540-08有機膜實驗裝置，江蘇久吾高科技有限公司；Fluke 2640A 網絡型多點溫度采集儀，美國福祿克電子儀器儀表公司；螺旋式速凍機、平板速凍機，煙臺冰輪股份有限公司；CR-400 型色彩色差計，日本柯尼卡美能達公司；MS2000激光粒度儀，馬爾文儀器公司

1.3 實驗方法

1.3.1 濃縮牛乳的制備

將牛乳用有機膜實驗裝置在進口壓力為3.0 MPa，流量為1.5 m3/h的條件下進行膜分離濃縮，最終得到總固形物(total solids，TS)含量分別為14.94%，17.61%和23.01%(相當于2份牛乳變?yōu)?份)的濃縮乳樣，TS測定采用在105 ℃烘箱中直接烘干法[13]?？刂茲饪s過程中溫度不超過40 ℃。

1.3.2 凍結曲線的測定

將鮮牛乳和不同TS的濃縮牛乳分裝于無菌袋，每袋2 L，分別采用-20 ℃冰箱、-30 ℃平板速凍機、-30 ℃螺旋速凍機及-30 ℃冷庫進行凍結處理。將多點溫度采集儀測溫端用橡木塊固定置于樣品中心，記錄牛乳中心溫度的變化，待牛乳中心溫度達到-18 ℃時取出樣品，置于-20 ℃冰箱凍藏3 d；凍結牛乳在流水解凍后進行指標測定，以未經過凍結處理的鮮牛乳和濃縮牛乳為對照組。

1.3.3 色度測定

牛乳解凍后用色差計測定色差值L*、a*和b*，在測定牛乳色度前先進行白板校正，每個樣品測3次。根據(jù)公式(1)計算總色差：

(1)

1.3.4 pH值的測定

將30 mL牛乳樣品置于燒杯中，用經過校準的pH計測定其pH值。每個樣品測定3次。

1.3.5 酸度的測定

參考GB 5009.239—2016[14]的方法進行測定。

1.3.6 粒度的測定

參考TRIBST等[15]的方法，采用MS2000型激光粒度分析儀測定牛乳樣品的粒徑分布。在粒度分析中D10、D50、D90分別表示粒徑小于它的直徑的顆粒占10%、50%、90%。分布寬度=(D90-D10)/D50，表示較大顆粒與較小顆粒直徑差與平均直徑的相對變化率。

1.3.7 乙醇穩(wěn)定性的測定

參考張光地等[16]的方法，將使牛乳沉淀的最小乙醇溶液體積分數(shù)作為實驗結果，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.8 熱穩(wěn)定性的測定

參考CROWLEY等[17]的方法，測定并記錄牛乳樣品自放入油浴鍋至開始出現(xiàn)絮凝沉淀掛壁時所需要的時間，即牛乳的熱凝固時間(heat coagulation time，HTC)，每個樣品平行3次。

1.3.9 乳脂肪球顯微結構的測定

參考遲雪露等[18]的方法進行測定。

1.3.10 SDS-PAGE蛋白質凝膠電泳的測定

將牛乳在4 ℃、8 000 r/min條件下離心20 min，除去上層脂肪，用蒸餾水稀釋到合適濃度，與蛋白質上樣緩沖液按體積比4∶1混合均勻，沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫后進行上樣。分離膠濃度為8%～20%，濃縮膠濃度為4%。電泳開始時，調節(jié)電壓為120 V。電泳結束后進行考馬斯亮藍染色2 h，脫色至背景清晰。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)為平行實驗3次取平均值，曲線使用origin 2018軟件繪制，數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0進行分析。顯著性分析中，“組內”表示總固形物含量相同時處理方式不同(小寫字母表示)，“組間”表示處理方式相同時總固形物含量不同(大寫字母表示)。

2 結果與分析

2.1 不同凍結方式下的牛奶凍結曲線

分裝于無菌袋的牛乳在不同凍結方式下，其中心溫度從4 ℃降至-18 ℃的變化曲線如圖1所示。在不同的凍結方式下牛乳經過最大冰晶生成帶(-1～-5 ℃)的時間有明顯差異，通過最大冰晶生成帶的時間越短，形成的冰晶越小，分布越均勻，越利于保存其品質。

由圖1-a可知，鮮牛乳在冰箱凍結、冷庫凍結、螺旋凍結和平板凍結時通過最大冰晶生成帶的時間分別為368、149、85和27 min。冷庫溫度比冰箱溫度低10 ℃，因此冷庫凍結時間明顯少于冰箱凍結。螺旋速凍機和平板速凍機內溫度同為-30 ℃，螺旋速凍機內置風機使空氣強制對流，提高了換熱效率，比冷庫凍結縮短了凍結時間。在平板速凍機中，裝于無菌袋的牛乳平鋪在平板上，樣品與平板進行熱傳導來交換熱量，因此平板凍結的時間最短，凍結速率最快。

在凍結方式相同的條件下，濃縮牛乳的凍結曲線走勢與鮮牛乳的相類似，中心溫度降至-18 ℃的凍結時間隨著牛乳濃縮倍率的增加而下降。TS為23.01%的濃縮牛乳的凍結時間最短，由圖1-d可知，其冰箱凍結、冷庫凍結、螺旋凍結和平板凍結的時間分別為526、194、119和44 min。

a-TS 11.83%(鮮牛乳)；b-TS 14.94%；c-TS 17.61%；d-TS 23.01%圖1 乳樣在不同凍結方式下的凍結曲線Fig.1 Freezing curves of milk with different TS under different freezing methods

2.2 色度

不同濃縮程度與凍結方式下牛乳的色度變化見表1。其中L*、a*和b*分別表示黑白度、紅綠度和黃藍度。牛乳濃縮后隨著TS的升高，L*值顯著增加(P<0.05)，其原因可能是牛乳濃縮后隨著TS的升高，蛋白含量增加，有研究表明牛乳蛋白質含量越高牛乳越白[19]。凍結后乳樣的L*有下降趨勢，可能是由于乳樣凍結過程中酪蛋白膠束結構的變化引起。TS相同時，不同凍結方式對乳樣L*值的影響較小。對照組中乳樣的-a*值隨著TS的升高呈增大趨勢，經過凍結后-a*值顯著降低(P<0.05)，且-a*值隨著不同凍結方式凍結速率的增加出現(xiàn)上升趨勢，這可能是由于蛋白質聚集而引起。牛乳濃縮后b*值顯著增加(P<0.05)，其原因可能是隨著TS的升高，牛乳脂肪含量增加，有研究表明牛乳的黃度與乳脂肪含量密切相關[18]。經過凍結后牛乳的b*值顯著增加，且隨著不同凍結方式凍結速率的提高，b*值呈下降趨勢，這是因為牛乳在凍結過程中乳脂球遭到破壞，且凍結速率越慢破壞程度越高，在解凍后易發(fā)生聚集，因而造成乳樣的b*值增大。牛乳經濃縮后ΔE*顯著增大(P<0.05)，TS相同時，冰箱凍結的ΔE*顯著高于另外3種凍結方式，由于冰箱凍結時間長，通常對牛乳整體色度的影響也較大。TS為23.01%時，不同凍結方式對乳樣的ΔE*影響較小，可能是由牛乳的濃縮倍率過高引起。牛乳中通常含有核黃素等天然色素，也會在一定程度上影響牛乳的色度。

表1 濃縮與凍結方式對牛乳色度的影響Table 1 Effect of concentrating and freezing methods on color of milk

2.3 pH和酸度

由圖2可知，凍結前TS為11.83%的乳樣pH值為6.75，經過濃縮處理后pH值顯著降低。pH值反映了乳中處于電離狀態(tài)的活性氫離子的濃度[20]，在牛乳TS升高時，乳樣中離子平衡發(fā)生變化，使電離狀態(tài)的活性氫離子濃度增大，乳樣pH值降低。牛乳在凍結后pH值出現(xiàn)下降趨勢，可能是由于在凍結過程中水分結晶析出，離子強度增加，使得鈣離子與酪蛋白膠體結合的平衡向磷酸鈣沉淀轉移[21]。有研究表明巴氏殺菌水牛奶在冷凍前后及冷凍貯藏期內pH值呈下降趨勢[22]。TS相同的乳樣經不同方式凍結后，其pH值無顯著變化(P>0.05)。

圖2 濃縮與凍結方式對牛乳pH值的影響Fig.2 Effect of concentrating and freezing methods on pH of milk 注：不同小寫母表示組內差異顯著(P<0.05)， 不同大寫字母組間差異顯著(P<0.05)(下同)

酸度是衡量牛乳新鮮程度的重要指標，主要受到牛乳中酪蛋白、磷酸鹽、檸檬酸鹽以及碳酸鹽等物質的影響[23]。濃縮與凍結方式對牛乳酸度的影響見圖3。

圖3 濃縮與凍結方式對牛乳酸度的影響Fig.3 Effect of concentrating and freezing methods on titratable acid of milk

由圖3可知，隨著TS的增加，乳樣的酸度顯著增大(P<0.05)，這是由于隨著牛乳濃縮倍率的提高，乳樣中酪蛋白、磷酸鹽、檸檬酸鹽以及碳酸鹽等酸性物質濃度增加。乳樣在濃縮處理時，隨著濃縮倍率提高，濃縮所需要的時間增加，這也會導致乳樣中的乳糖在乳酸菌的作用下降解產生有機酸[7]，導致乳樣的pH值下降，酸度增加。在TS相同時，凍結方式對乳樣的酸度無顯著影響(P>0.05)。

2.4 粒度

牛乳的粒度分布呈雙峰特征，由乳中蛋白質與乳脂肪球粒徑不同引起。由表2可知，鮮牛乳中90%的顆粒粒徑小于0.767 μm，50%的顆粒粒徑小于0.188 μm，在牛乳經過濃縮處理后，比表面積顯著減小，而隨濃縮程度進一步提高,比表面積減小趨勢變緩，表面積平均粒徑和體積平均粒徑均顯著增大(P<0.05)，粒徑的分布寬度有增大趨勢。乳樣經過不同方式凍結后，比表面積出現(xiàn)減小趨勢，體積平均粒徑顯著增大(P<0.05)，其中在TS為23.01%時，冰箱凍結的乳樣其表面積平均粒徑(0.168 μm)和體積平均粒徑(0.906 μm)顯著高于另外3種凍結方式。同時，在乳樣經過凍結后，粒徑分布寬度出現(xiàn)隨牛乳的濃縮程度提高而增大的趨勢，即TS越高凍結對其粒徑分布的影響越大。濃縮與不同凍結方式對乳樣的D10值影響不顯著(P>0.05)。牛乳在濃縮之后，乳樣中的酪蛋白膠束間距變小，促進了酪蛋白膠束結構相互聚集[24]，同時密集分布的乳脂肪球也更容易凝聚[25]，這導致了牛乳在濃縮后平均粒徑的增加。在凍結過程中，乳樣中的水結晶析出，造成酪蛋白膠束及乳脂肪球的分布更加密集，促使酪蛋白膠束和乳脂肪球進一步的聚集和凝聚，因此凍結后乳樣的平均粒徑增加，由于冰箱凍結速率慢，酪蛋白膠束和乳脂肪球聚集和凝聚增加更加顯著。

2.5 乙醇穩(wěn)定性

牛乳中乳酪蛋白膠粒具有親水性，在周圍形成結合水層，以穩(wěn)定的膠體結構分散在牛乳中。結合水層在遇到酒精時易被脫去，使酪蛋白凝聚沉淀。因此牛乳的乙醇穩(wěn)定性能一定程度反映牛乳蛋白質的穩(wěn)定性。圖4為牛乳經過濃縮與凍結后，其乙醇穩(wěn)定性的變化。由圖4可知，未經過濃縮與凍結的乳樣具有最高的乙醇穩(wěn)定性(85%)，所有TS為11.83%的乳樣，出現(xiàn)沉淀的最小乙醇體積分數(shù)均不低于75%，說明牛乳在凍結之后仍有較好的乙醇穩(wěn)定性。隨著TS的

表2 濃縮與凍結方式對牛乳粒度的影響Table 2 Effects of concentrating and freezing methods on milk particle size

升高,乳樣出現(xiàn)沉淀的最小乙醇體積分數(shù)顯著減小(P<0.05)，且降低的幅度出現(xiàn)變大趨勢。在TS相同時，乳樣的乙醇穩(wěn)定性在凍結后顯著降低(P<0.05)，且乙醇穩(wěn)定性與凍結速率表現(xiàn)出正相關，其中冰箱凍結乳樣的乙醇穩(wěn)定性最低。TS在11.83%～17.60%時平板凍結的乳樣乙醇穩(wěn)定性和對照組一致，說明平板凍結對牛乳的乙醇穩(wěn)定影響最小。

圖4 濃縮與凍結方式對牛乳乙醇穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of concentrating and freezing methods on ethanol stability of milk

2.6 熱穩(wěn)定性

濃縮與凍結方式對牛乳熱穩(wěn)定性的影響如圖5所示。由圖5可知，對照組中，TS為11.83%乳樣的熱穩(wěn)定性最好,HTC為18.4 min，隨著TS升高,HTC顯著下降(P<0.05)，分別下降了19.0%(TS 14.94%)，49.4%(TS 17.61%)和82.6%(TS 23.01%)。乳樣凍結后熱穩(wěn)定性顯著下降(P<0.05)，冰箱凍結的乳樣的熱穩(wěn)定性最差，冷庫凍結、螺旋凍結和平板凍結的乳樣熱穩(wěn)定性無顯著差異(P>0.05)。在牛乳濃縮過程，乳清中的鈣離子向酪蛋白膠束結構中轉移[26]，改變膠束結構電荷數(shù)，引起膠束間靜電相互作用改變，凍結也會造成游離鈣離子向酪蛋白膠束中轉移[25]，使?jié)饪s、凍結后乳樣的熱穩(wěn)定性降低。

圖5 濃縮與凍結方式對牛乳熱穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of concentrating and freezing methods on heat stability of milk

2.7 乳脂肪球的顯微結構

乳中脂肪以微小球狀或液滴狀分散在乳液體系中[27]。由圖6可知，在相同的凍結條件下，乳樣濃縮后隨著TS的升高，乳脂肪球的數(shù)量和直徑均顯著增加(P<0.05)。在TS相同的條件下，同對照組相比，凍結后乳樣中乳脂肪球直徑顯著增大(P<0.05)，且隨著凍結速率的降低,乳脂肪球直徑變大。牛乳在濃縮過程中隨著TS的升高，脂肪含量也按比例增加，這將會導致乳脂肪球分布更加密集。有研究表明乳脂肪球粒徑與脂肪含量成正相關關系[28]，這也解釋了牛乳平均粒徑在濃縮處理后會變大。在牛乳凍結過程中冰晶的形成，乳脂肪球分布變密，同時乳脂球膜因為滲透壓變大遭到破壞，使得乳脂肪球相互凝聚[29]。由此得出，凍結速率是乳脂肪球直徑變化最重要的原因，同時也證實了牛乳在凍結后平均粒徑會增大。

2.8 SDS-PAGE

乳蛋白是牛乳中最重要的成分，是人類膳食蛋白質的來源之一[30]。乳蛋白主要包括α-酪蛋白(α-casein, α-CN)，β-酪蛋白(β-casein, β-CN)，κ-酪蛋白(κ-casein, κ-CN)，β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-LG)，α-乳白蛋白(α-lactalbumin, α-LA)，乳鐵蛋白(lactoferrin, LF)，牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)[31-32]。由圖7可知，在相同的凍結條件下，隨著TS的升高，乳樣中蛋白條帶強度顯著增加(P<0.05)，蛋白電泳條帶的強度可反映出蛋白質含量的高低，因此經過濃縮后乳樣中的蛋白質含量顯著增加(P<0.05)，說明了在濃縮過程中有機膜濃縮裝置可有效地實現(xiàn)牛乳蛋白質的截留。TS相同時，乳樣在凍結后分子量在66.2～97.4 kDa的條帶強度顯著增加(P<0.05)，其原因可能是凍結造成蛋白質聚集。在不同方式凍結中，相同TS乳樣的β-LG條帶強度有減弱趨勢，這可能是由于凍結使β-LG與酪蛋白膠束結合，這也解釋了牛乳在凍結對平均粒徑變大的現(xiàn)象。

CK-對照組；A-冰箱凍結；B-冷庫凍結；C-螺旋凍結；D-平板凍結； 1-TS 11.83%；2-TS 14.94%；3-TS 17.61%；4-TS 23.01%圖6 濃縮與凍結對乳脂肪球顯微結構的影響Fig.6 Effects of concentrating and freezing on the microstructure of milk fat globules有研究表明[33]，牛乳在旋轉蒸發(fā)濃縮過程中會形成分子量超過100 kDa且隨濃縮程度增加而增加的蛋白質聚集體，而在本次實驗中未發(fā)現(xiàn)明顯的蛋白質聚集體，一方面可能是蒸發(fā)濃縮的溫度更高所致，另一方面可能是由于旋轉蒸發(fā)儀在旋轉過程中產生的剪切力引起乳蛋白疏水性的變化，從而引起聚集。

CK-對照組；A-冰箱凍結；B-冷庫凍結；C-螺旋凍結；D-平板凍結；1-TS 11.83%；2-TS 14.94%；3-TS 17.61；4-TS 23.01%圖7 濃縮與凍結對牛乳蛋白SDS-PAGE的影響Fig.7 Effects of concentrating and freezing on milk protein SDS-PAGE

3 結論

通過測定牛乳色度、pH值、酸度、粒度等理化指標，結合乳脂肪球微觀結構及乳蛋白SDS-PAGE電泳，對比分析了濃縮程度和不同凍結方式對冷凍牛乳品質的影響。研究表明，經過濃縮后，隨著總固形物含量的升高，牛乳總色差值、酸度、平均粒徑顯著增加(P<0.05)，pH值、乙醇穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性顯著降低(P<0.05)。冰箱凍結、冷庫凍結、螺旋凍結和平板凍結均會對牛乳的理化性質造成不同程度的影響，凍結后牛乳粒度分布寬度、乳脂肪球粒徑顯著增大(P<0.05)，乙醇穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、β-乳球蛋白含量顯著降低(P<0.05)。不同凍結方式對牛乳pH值、酸度的影響不顯著(P>0.05)，但對乳脂肪球直徑的影響明顯，隨凍結速率的降低乳脂肪球直徑增加。冰箱凍結牛乳的平均粒徑及乳脂肪球粒徑均為最大，平板凍結的牛乳在色差、乙醇穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性上最接近鮮牛乳。綜合上述結果，推薦將牛乳濃縮至總固形物含量為23.01%，采用平板凍結對牛乳進行凍結。