孫大林，金保方，蔡濱，鄧偉民

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，南京 210009)

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個(gè)核苷酸的RNA，因其缺乏開放性閱讀框而不具備編碼蛋白質(zhì)功能，但能以RNA 的形式通過多種方式調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與多種生理活動(dòng)。H19是人類最早發(fā)現(xiàn)的lncRNA分子，位于人類染色體11p15.5，全長2.3 kb，包括5個(gè)外顯子及4個(gè)內(nèi)含子，是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有基因印跡功能的lncRNA[1]。H19在胚胎發(fā)育期主要集中表達(dá)于內(nèi)胚層及中胚層來源的組織，出生后主要在心肌、骨骼肌、乳腺、子宮、卵巢和睪丸中表達(dá)。既往關(guān)于H19的研究多集中在生長發(fā)育、糖代謝和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面，近期越來越多的研究表明H19在生殖系統(tǒng)多種疾病中發(fā)揮重要作用。本文就H19在生殖道腫瘤、性激素合成、生精功能、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)和輔助生殖技術(shù)(ART)中的作用作一綜述。

一、H19與生殖道腫瘤

H19的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切有關(guān)，并且與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后生存等相關(guān)。近期研究證實(shí)，H19與生殖道腫瘤有著不同程度的相關(guān)性。

1.卵巢癌(Ovarian cancer，OC)：OC是死亡率最高的生殖道惡性腫瘤，Mizrahi等[2]對(duì)OC患者的腹水細(xì)胞進(jìn)行原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)，90%患者的腹水細(xì)胞中可檢測到H19 RNA。Zhu等[3]使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，OC組織中H19的表達(dá)量是正常卵巢組織的2倍以上，4種OC細(xì)胞系中H19的表達(dá)量較正常卵巢細(xì)胞系均明顯升高，尤其是SKOV3細(xì)胞中H19的表達(dá)量是正常卵巢細(xì)胞的5倍之多。抑制OC模型鼠局部H19表達(dá)，腫瘤生長可降低40%[3]。Medrzycki等[4]過表達(dá)OC細(xì)胞系中組蛋白變體H1.3，降低H19表達(dá)，造成細(xì)胞增殖及生長速率均顯著低于對(duì)照組；而降低H1.3表達(dá)，增加H19基因的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖及生長速率顯著增高。Yan等[5]研究還證實(shí)，過表達(dá)OC細(xì)胞系H19基因，細(xì)胞的侵襲力及遷移力均明顯升高；降低H19基因表達(dá)，細(xì)胞侵襲力及遷移力均較空載體組明顯下降。這都提示H19可能與OC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.子宮內(nèi)膜癌(Endometrial cancer，EC)：EC發(fā)病率居女性腫瘤第4位，全世界每年有18.9萬新增病例，約有4.5萬例患者死亡[6]。Lottin等[7]采用原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，EC組織中H19的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織。Tanos等[8]發(fā)現(xiàn)H19在正常子宮內(nèi)膜上皮中的表達(dá)水平較低，但在增生性子宮內(nèi)膜和EC組織中水平較高，并且隨著腫瘤組織的持續(xù)去分化會(huì)進(jìn)一步增加，提示H19可能參與EC的發(fā)病和進(jìn)展。Zhang等[9]使用RT-PCR檢測4種EC細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)H19可能是通過靶向miR-612調(diào)節(jié)靶基因HOXA10的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而影響EC的發(fā)展。Zhu等[10]發(fā)現(xiàn)H19還可通過miR-20b-5p/AXL/HIF-1a信號(hào)通路促進(jìn)EC的形成，從而為EC的診治提供了新靶點(diǎn)。Zhao等[11]通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)H19通過調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(EMT)過程，促進(jìn)EC的侵襲性。Peng等[12]在TCGA數(shù)據(jù)集中研究了H19在子宮內(nèi)膜癌中的預(yù)后價(jià)值，表明H19表達(dá)較高患者的總生存期明顯低于H19表達(dá)較低的患者。說明H19對(duì)EC的轉(zhuǎn)移和預(yù)后均有一定的作用價(jià)值。

3.宮頸癌(cervical cancer，CC)：CC是全世界婦女的主要死因之一，每年約有53萬新增病例和27.5萬死亡病例，且發(fā)病率有上升趨勢[13]。人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是CC發(fā)病的最主要因素。Vidal等[14]通過檢測148例正常對(duì)照和38例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、48例CC患者的宮頸活檢標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)CIN和CC組的H19甲基化水平較低，處于高表達(dá)狀態(tài)，會(huì)提高HPV易感性，增加浸潤性CC和CIN的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Iempridee[15]研究發(fā)現(xiàn)，CC細(xì)胞系HeLa、MS751、SiHa和C33A中H19的表達(dá)均顯著高于人原代成纖維細(xì)胞，并通過體外過度表達(dá)和敲除實(shí)驗(yàn)，證明H19可促進(jìn)CC細(xì)胞增殖和腫瘤形成，但對(duì)細(xì)胞凋亡和遷移無明顯影響。Ou等[16]通過體外細(xì)胞研究證實(shí)，H19可以通過結(jié)合miR-138-5p作用于靶基因SIRT1，進(jìn)而調(diào)控CC細(xì)胞的增殖和凋亡，影響腫瘤進(jìn)展。Roychowdhury等[17]通過臨床病理分析發(fā)現(xiàn)，印度CC患者中H19基因缺失或啟動(dòng)子甲基化，導(dǎo)致基因的低表達(dá)，多預(yù)后不良。而Huang等[18]的研究表明，雖然H19中TT基因型rs2839698和rs3741219中GG基因型與CC的一些不良臨床病理參數(shù)有關(guān)，但只有盆腔淋巴結(jié)狀態(tài)才能顯著預(yù)測患者5年生存率，并認(rèn)為 H19單核苷酸與中國臺(tái)灣婦女CC沒有明顯關(guān)聯(lián)。

4.前列腺癌(Prostate cancer，Pca)：Pca是中老年男性最常見的惡性腫瘤之一，在美國居男性癌癥致死的第3位[19]。我國Pca的發(fā)病率由1990年的4/100 000增長至2017年的20/100 000[20]。孫士成等[21]通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，H19在Pca組織中的表達(dá)水平較前列腺增生組織顯著增高，且低分化癌中的表達(dá)水平明顯高于高、中分化癌。在Pca細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染H19 siRNA后，細(xì)胞生長和糖代謝能力均顯著下降。Zhu等[22]發(fā)現(xiàn)H19以及其產(chǎn)物miR-675在轉(zhuǎn)移性PcaM12細(xì)胞系中的表達(dá)顯著低于無轉(zhuǎn)移性Pca上皮細(xì)胞系P69；過表達(dá)H19后，Pca細(xì)胞系P69和PC3 的細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力受到顯著抑制；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-675可以與轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)mRNA3′端結(jié)合，并且能抑制其翻譯和促細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)功能。這說明H19可以通過miR-675調(diào)控靶基因TGF-β1的表達(dá)，從而抑制Pca的轉(zhuǎn)移。這提示H19可作為診斷和治療晚期Pca的潛在靶標(biāo)。Bacci等[23]通過研究發(fā)現(xiàn)，H19在不同的Pca微環(huán)境中發(fā)揮不同的作用，在缺氧或單獨(dú)雌激素條件下，H19水平增加，并通過減少鈣黏蛋白(CDH1)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，顯示致癌特性，促進(jìn)Pca的轉(zhuǎn)移；相反，在缺氧和雌激素聯(lián)合刺激下，H19水平轉(zhuǎn)錄水平降低，CDH1和β整合素表達(dá)釋放，將腫瘤傳播轉(zhuǎn)向內(nèi)聚表型，具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

二、H19與性激素合成

男性的主要生殖器官是睪丸，95%的睪酮(T)是在睪丸間質(zhì)(Leydig)細(xì)胞內(nèi)合成的。女性的主要生殖器官是卵巢，產(chǎn)生卵母細(xì)胞和分泌雌激素、孕激素。H19在出生后可在卵巢和睪丸中表達(dá)，對(duì)激素合成具有調(diào)節(jié)作用。

類固醇快速調(diào)節(jié)蛋白(StAR)調(diào)控膽固醇由線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，是多種性激素生物合成的步驟限速。Men等[24]通過在人KGN、HEK293和小鼠MLTC-1細(xì)胞系行H19過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)H19可以結(jié)合miRNA Let-7，促進(jìn)靶基因StAR的表達(dá)。隨后Chen等[25]通過在KGN細(xì)胞系中過表達(dá)H19后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞合成孕酮的濃度顯著增高。體外培養(yǎng)H19 KO雌鼠的卵巢顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其StAR的表達(dá)和孕酮的合成均顯著低于野生型雌鼠。這說明H19可以通過結(jié)合Let-7，促進(jìn)StAR合成，來調(diào)控性激素的合成功能。

抗苗勒管激素(AMH)主要由次級(jí)卵泡、竇前和竇狀卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)，可調(diào)節(jié)卵泡的生長發(fā)育，能準(zhǔn)確評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能。AMH還可抑制卵泡的募集、選擇，對(duì)生殖內(nèi)分泌疾病如多囊卵巢綜合征(PCOS)和卵巢儲(chǔ)備功能下降(DOR)的發(fā)病機(jī)制及診斷有重要價(jià)值。Xia等[26]通過檢測DOR患者(AMH<1.1 ng/ml，竇卵泡數(shù)<5枚)的血清和卵丘細(xì)胞H19表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其血清H19表達(dá)水平顯著低于卵巢功能正常組人群，且血清H19與血清AMH呈中度正相關(guān)，體外受精患者卵丘細(xì)胞中H19的表達(dá)比促性腺激素低應(yīng)答者高3.7倍。因此認(rèn)為血清和卵丘細(xì)胞中H19的下調(diào)與卵巢儲(chǔ)備減少密切相關(guān)，并能通過AMH水平和取卵時(shí)的卵母細(xì)胞數(shù)量來衡量H19的表達(dá)。Qin等[27]通過動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H19基因敲除小鼠生育能力下降，卵巢內(nèi)AMH mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，卵泡募集加速，次級(jí)卵泡、竇前卵泡和竇性卵泡的自動(dòng)發(fā)育增加；并且在促排卵時(shí)，E2明顯增高，卵母細(xì)胞增多。表明H19具有抑制卵泡成熟，促進(jìn)E2合成和促排卵的功能。提示H19/Let-7軸可以調(diào)控AMH的部分功能，是建立和維持卵泡池的重要調(diào)節(jié)因子。

三、H19與生精功能

精原干細(xì)胞(SSCs)是睪丸生精發(fā)生的起始細(xì)胞，是一群位于生精上皮基底部，具有高度自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。Bao等[28]使用基因芯片對(duì)lncRNAs在雄性生殖系統(tǒng)重新編程和出生后發(fā)育過程中的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)包括H19在內(nèi)大量的lncRNAs在生精過程中發(fā)揮功能，并且特定的lncRNAs可能調(diào)控著關(guān)鍵的發(fā)育階段。

精子發(fā)生過程中，以基因組印記、DNA甲基化、組蛋白改變和染色體重組為特點(diǎn)的表觀遺傳學(xué)改變對(duì)精子的發(fā)生有著重要的調(diào)節(jié)作用。人胰島素樣生長因子2(IGF2)基因和H19基因?yàn)檠芯枯^早的一對(duì)相互毗鄰的印跡基因，在生精過程中的調(diào)節(jié)作用，較早就得到研究。Santi等[29]薈萃分析了18項(xiàng)臨床研究，共納入879例男性不育患者和562例正常生育能力男性，發(fā)現(xiàn)不育患者的精液中H19甲基化平均水平顯著低于正常對(duì)照，提示H19可能在生精過程中發(fā)揮重要作用。Song等[30]通過建立宮內(nèi)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物2，2-二 (4-氯苯基) -1，1-二氯乙烯(p，p’-DDE)暴露跨代大鼠模型，觀察p，p’-DDE對(duì)雄性子代的生殖毒性，發(fā)現(xiàn)F1～F3代雄性仔鼠數(shù)量和活力下降，精子細(xì)胞Igf2基因印跡控制區(qū)(DMR2)區(qū)域低甲基化，Igf2轉(zhuǎn)錄下調(diào)，H19轉(zhuǎn)錄上調(diào)，認(rèn)為p，p’-DDE誘導(dǎo)的跨代雄性大鼠生殖毒性是通過Igf2/H19甲基化改變發(fā)揮作用的。Zhang等[31]通過實(shí)驗(yàn)把雄性小鼠暴露于苯并芘(BaP)，發(fā)現(xiàn)BaP暴露改變了父系精子H19、Meg3的甲基化水平，提示印記基因易受環(huán)境毒物的影響。此外，在F1～F2代中觀察到類似的改變，盡管在F2代的甲基化減弱，但顯示出了潛在的跨代效應(yīng)。Lei等[32]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，SiRNA干擾牛雄性生殖干細(xì)胞(mGSCs)中H19表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)IGF-1信號(hào)通路能夠被抑制，細(xì)胞增殖顯著下降，說明H19通過IGF-1信號(hào)通路調(diào)控mGSCs的增殖與凋亡，進(jìn)而影響生精功能。

四、H19與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)

RSA是指與同一配偶發(fā)生連續(xù)2次或2次以上的自然流產(chǎn)。流產(chǎn)的已知病因有染色體異常、生殖道解剖異常、內(nèi)分泌失調(diào)、感染性因素、血栓前狀態(tài)、自身免疫因素等。但是，臨床上還有40%～80%患者找不到明確病因，稱為不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)(URSA)。近年來，基因表觀遺傳調(diào)節(jié)與URSA的關(guān)系日益受到重視。

基因芯片的研究表明，RSA患者的絨毛和蛻膜組織中多種lncRNAs與人工流產(chǎn)患者有顯著差異[33]，這些lncRNAs可參與調(diào)控感染、炎癥、內(nèi)分泌、免疫等多種生理病理過程。胡煉等[34]通過檢測自然流產(chǎn)患者和正常早孕行人工流產(chǎn)婦女對(duì)照者的絨毛組織中H19、E盒鋅指結(jié)合蛋白1(ZEB1)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)組絨毛組織中H19的表達(dá)有下降趨勢，受H19調(diào)控的ZEB1的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組。Hanna等[35]通過對(duì)比RSA患者與單次流產(chǎn)患者妊娠早期絨毛中的DNA甲基化芯片分析，發(fā)現(xiàn)RSA患者的H19/IGF2的印跡控制區(qū)域1(ICR1)平均甲基化水平降低。Ankolkar等[36]對(duì)比研究URSA患者配偶與已育男性的精子H19 ICR甲基化水平，發(fā)現(xiàn)URSA組的H19-ICR甲基化水平顯著降低，說明DNA甲基化異常是除核型異常外，導(dǎo)致URSA的重要病因之一，而H19甲基化異常是其主要候選靶點(diǎn)之一。

整合素β3(ITGB3)介導(dǎo)細(xì)胞和基質(zhì)黏附，從而控制細(xì)胞和基底膜的結(jié)合，以及細(xì)胞的游走，與子宮內(nèi)膜植入窗開放和子宮內(nèi)膜容受性，滋養(yǎng)細(xì)胞粘附入侵，以及胚胎著床密切相關(guān)。Zeng等[37]通過RT-PCR法檢測H19和整合素β3的表達(dá)在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)或冷凍胚胎移植(FET)反復(fù)植入失敗(RIF)患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，RIF組H19和整合素β3表達(dá)均顯著降低，推測H19/Let-7可以調(diào)控整合素β3的表達(dá)，進(jìn)而影響胚胎的植入。He等[38]利用HTR-8/SVneo細(xì)胞系，探討H19/Let-7/ITGB3軸在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞球體粘附和體外侵襲能力中的作用，結(jié)果表明，體外敲除H19導(dǎo)致ITGB3的表達(dá)降低，其粘附和侵襲能力減弱，并在RSA患者胚胎絨毛組織中，發(fā)現(xiàn)H19和ITGB3的表達(dá)均下降；最后通過Let-7挽救實(shí)驗(yàn)，以及細(xì)胞黏附和侵襲實(shí)驗(yàn)，證實(shí)H19/Let-7/ITGB3軸可以調(diào)控滋養(yǎng)層球體與子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的黏附，影響胚胎植入和妊娠結(jié)局。但崔進(jìn)等[39]的研究卻得到相反結(jié)果，顯示RSA組患者胚胎組織中H19的表達(dá)顯著高于對(duì)照組人工流產(chǎn)手術(shù)患者。因此，關(guān)于H19的表達(dá)變化與RSA的關(guān)系，還有待于大樣本的數(shù)據(jù)證實(shí)。

五、H19與輔助生殖技術(shù)(ART)

ART已成為人類解決生育問題的重要手段，但ART生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)的使用像一把雙刃劍，在為生育帶來福利的同時(shí)也會(huì)帶來一系列風(fēng)險(xiǎn)。

基因印跡屬于表觀遺傳現(xiàn)象，在生殖細(xì)胞中的形成主要發(fā)生于配子發(fā)育和胚胎種植前階段，而這一階段正是ART的干預(yù)階段。由于印跡基因在功能上相當(dāng)于單倍體，暴露于體外ART多種技術(shù)下，容易受突變的影響。因此，ART可能在配子和胚胎培養(yǎng)過程中干擾基因組印跡的正常表達(dá)，導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常。如Beckwith-Wiedemann綜合征(BWS)是由于第11號(hào)染色體短臂15.5區(qū)域(11p15.5)母源或父源性印記基因表達(dá)缺陷所致，與BWS相關(guān)的染色體印跡區(qū)域包括兩個(gè)印跡域：IGF2/H19、CDKN1C/KCNQ1OT1。正常懷孕產(chǎn)出BWS患兒的幾率是1/10 340，而采用ART助孕的母親產(chǎn)出BWS患兒的概率升高至1/1 100[40]。

Market-Velker等[41]的研究表明，與體內(nèi)來源的胚胎相比，所有商業(yè)培養(yǎng)基系統(tǒng)中的胚胎培養(yǎng)都會(huì)導(dǎo)致H19印跡表達(dá)的缺失，并且促排卵和胚胎培養(yǎng)聯(lián)合處理會(huì)加劇影響H19的表達(dá)。這表明多個(gè)ART過程可累積破壞H19基因印跡，進(jìn)而干擾胚胎植入前發(fā)育過程中基因組印跡的保真度。Chen等[42]研究發(fā)現(xiàn)，體外環(huán)境可影響基因印跡H19的維持，體外培養(yǎng)到第3天，被淘汰的低質(zhì)量胚胎中H19基因呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。Nelissen等[43]通過檢測IVF和ICSI方式獲得胚胎的印跡基因甲基化水平，兩組H19基因印跡控制區(qū)均存在明顯低甲基化情況，隨后進(jìn)行的RT-PCR結(jié)果顯示H19基因在IVF和ICSI組中的表達(dá)均有所增加。Cheng等[44]觀察小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍對(duì)體外受精囊胚中3個(gè)印記基因差異甲基化區(qū)(DMRs)的影響，發(fā)現(xiàn)印跡基因H19、Peg3和Snrpn DNA甲基化丟失，其主要原因是卵母細(xì)胞玻璃化后DNA甲基轉(zhuǎn)移酶減少。最新研究還表明，IVF后的胎盤發(fā)育不良與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3β下調(diào)H19表達(dá)，導(dǎo)致miR675上調(diào)，激活胰島素樣生長因子信號(hào)及其下游PI3K/Akt/mTOR通路有關(guān)[45]。由此可見，ART中多個(gè)環(huán)節(jié)，包括促排卵、體外培養(yǎng)、ICSI、配子冷凍等技術(shù)，均可影響H19的表達(dá)，進(jìn)而改變胚胎的質(zhì)量和結(jié)局。

六、結(jié)語

H19在生殖道腫瘤、性激素合成、生精功能、RSA和ART中均發(fā)揮調(diào)控作用，這為生殖系統(tǒng)多種疾病的發(fā)病進(jìn)展和診斷治療提供了新的方向。但目前關(guān)于H19在惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌或致癌作用仍有爭議，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等起雙重作用，這可能與腫瘤類型和腫瘤微環(huán)境中均有關(guān)系，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探索。H19在性激素合成方面的研究總體較少，其具體價(jià)值還需要增加相關(guān)研究。在生精功能和RSA中，H19的研究報(bào)道多集中在相關(guān)性觀察，內(nèi)在分子機(jī)制還需深入探討。H19與ART的關(guān)系明確，但對(duì)于提高胚胎質(zhì)量，改善妊娠結(jié)局的研究不足。但隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，H19在生殖系統(tǒng)中的作用及機(jī)制將更加明確，有望為多種生殖系統(tǒng)常見病的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供可靠的依據(jù)和靶點(diǎn)。