周小丹，梅憶媛，漆倩榮，鐘方圓，謝青貞

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060)

卵巢過度刺激綜合征(OHSS)是使用促排卵藥物后發(fā)生的醫(yī)源性并發(fā)癥，其主要特征為卵巢增大、毛細(xì)血管通透性增加、胸腹腔積水，嚴(yán)重時(shí)可能危及患者生命。目前，卵巢高反應(yīng)患者中、重度OHSS的發(fā)生率高達(dá)20%[1]。因此，如何有效防治OHSS的發(fā)生是臨床密切關(guān)注的問題。根據(jù)OHSS發(fā)生時(shí)間分為早發(fā)型和遲發(fā)型[2]，早發(fā)型OHSS病程短、癥狀輕，多在月經(jīng)來潮前消退；而遲發(fā)型OHSS多在妊娠后發(fā)生，往往病程長、癥狀重，催經(jīng)、促黃體溶解作用可能防治OHSS發(fā)生。有研究表明，OHSS高?；颊唿S體期單獨(dú)應(yīng)用促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant)、來曲唑或米非司酮治療后，中重度OHSS發(fā)生率(18.03%、25.0%、2.33%)分別低于對(duì)照組(37.14%、45.1%、12.77%)，其作用機(jī)制可能是通過促進(jìn)黃體溶解、降低血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平[3-5]。但也有研究認(rèn)為，GnRH-ant、來曲唑及米非司酮并不能有效降低臨床OHSS發(fā)生率[6]。黃素化顆粒細(xì)胞是構(gòu)成黃體的主要類固醇激素分泌細(xì)胞，其產(chǎn)生的VEGF被公認(rèn)為OHSS發(fā)生的關(guān)鍵因子[7]。因此，本研究選擇通過體外分離獲得的人原代卵巢顆粒細(xì)胞(Human granulosa cells，hGCs)及人卵巢顆粒細(xì)胞系KGN，探討GnRH-ant、來曲唑、米非司酮及三組藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)顆粒細(xì)胞功能及VEGF表達(dá)的影響，旨在為臨床OHSS的防治提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人卵巢顆粒細(xì)胞系KGN購自ATCC細(xì)胞典藏中心。實(shí)驗(yàn)所用的人原代卵巢顆粒細(xì)胞來源于2018年3～10月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖中心行IVF-ET治療的不孕患者的卵泡液?；颊叩募{入標(biāo)準(zhǔn)：年齡21～35歲，因輸卵管炎或男方因素導(dǎo)致不孕。

本實(shí)驗(yàn)獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.人原代顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)及分組：采用Percoll梯度離心法提純獲取人原代顆粒細(xì)胞，具體方法見文獻(xiàn)[8]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定所選藥物的干預(yù)濃度，利用GnRH-ant(思則凱，默克雪蘭諾，瑞士)、來曲唑(Letrozole，大連美侖生物)、米非司酮(大連美侖生物)及聯(lián)合用藥分別處理細(xì)胞：原代顆粒細(xì)胞及KGN細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h后分別加入10 nmol/L GnRH-ant、10 μmol/L來曲唑、1 μmol/L米非司酮及聯(lián)合用藥(10 nmol/L GnRH-ant+10 μmol/L來曲唑+1 μmol/L米非司酮)干預(yù)24 h；并設(shè)立空白對(duì)照組。

2.細(xì)胞活力檢測(cè)：將原代顆粒細(xì)胞、KGN細(xì)胞分別按1×105/孔、3×103/孔密度接種于96孔板，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，藥物處理同前。干預(yù)24 h后每孔加入10 μl CCK-8液(同仁化學(xué)，日本)，孵育2 h后，置酶標(biāo)儀上于450 nm波長處測(cè)OD值，對(duì)照調(diào)零后取各組復(fù)孔均值。

3.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：原代顆粒細(xì)胞及KGN細(xì)胞分別按2×106/ml、2×105/ml密度接種于6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，分組及藥物處理同前。消化、重懸細(xì)胞后，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD，美國)操作說明在各組500 μl細(xì)胞懸液中分別加入5 μl Annexin V-FITC與PI避光孵育30 min，流式上機(jī)檢測(cè)。

4.細(xì)胞分泌水平檢測(cè)：收集不同藥物干預(yù)細(xì)胞24 h后的上清液，1 000 rpm離心5 min，吸取上清，根據(jù)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特)操作說明書對(duì)各組E2、孕酮(P)、VEGF分泌水平進(jìn)行檢測(cè)。

5.細(xì)胞VEGF基因表達(dá)水平檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。按標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取顆粒細(xì)胞總RNA，日本Takara試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)試劑盒說明書冰上配制反應(yīng)體系，RT-PCR儀檢測(cè)。引物購于上海生工生物公司，序列如表1所示。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△Ct法對(duì)基因表達(dá)的相對(duì)水平進(jìn)行計(jì)算。

表1 PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組藥物干預(yù)對(duì)細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組比較，GnRH-ant、來曲唑、米非司酮及聯(lián)合用藥均顯著抑制原代顆粒細(xì)胞(hGCs)及KGN細(xì)胞的活力(P<0.05)。其中原代顆粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，米非司酮組的細(xì)胞活力顯著低于GnRH-ant組，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞活力顯著低于其他單一用藥組(P<0.05)。KGN細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞活力顯著低于GnRH-ant和來曲唑組(P<0.05)(圖1)。

二、各組藥物干預(yù)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，GnRH-ant、來曲唑、米非司酮及聯(lián)合用藥組均促進(jìn)顆粒細(xì)胞(hGCs)及KGN細(xì)胞凋亡，其中米非司酮組及聯(lián)合用藥組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KGN細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，米非司酮組細(xì)胞凋亡率高于GnRH-ant、來曲唑組(P<0.05)，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率最高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與GnRH-ant組比較，#P<0.05；與來曲唑組比較，&P<0.05；與米非司酮組比較，￥P<0.05圖1 不同藥物干預(yù)對(duì)細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與GnRH-ant組比較，#P<0.05；與來曲唑組比較，&P<0.05；與米非司酮組比較，￥P<0.05圖2 不同藥物干預(yù)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

三、各組藥物干預(yù)對(duì)細(xì)胞E2、P分泌水平的影響

原代顆粒細(xì)胞(hGCs)實(shí)驗(yàn)中，GnRH-ant、來曲唑及聯(lián)合用藥組上清液E2水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合用藥組均低于單一用藥組(P<0.05)；KGN細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，來曲唑和聯(lián)合用藥組上清液E2水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。原代顆粒細(xì)胞(hGCs)實(shí)驗(yàn)中，來曲唑、米非司酮及聯(lián)合用藥組上清液P水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中聯(lián)合用藥組低于GnRH-ant和來曲唑組(P<0.05)。KGN細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合用藥組上清液P水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與GnRH-ant組比較，#P<0.05；與來曲唑組比較，&P<0.05；與米非司酮組比較，￥P<0.05圖3 不同藥物干預(yù)對(duì)細(xì)胞E2、P分泌水平的影響

四、各組藥物干預(yù)對(duì)細(xì)胞VEGF表達(dá)水平的影響

原代顆粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，GnRH-ant、來曲唑及聯(lián)合用藥組VEGF mRNA水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；GnRH-ant、來曲唑、米非司酮及聯(lián)合用藥組VEGF分泌水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中聯(lián)合用藥組VEGF分泌水平還顯著低于GnRH-ant和米非司酮組(P<0.05)。KGN細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，GnRH-ant及聯(lián)合用藥組VEGF mRNA水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合用藥組VEGF分泌水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與GnRH-ant組比較，#P<0.05；與來曲唑組比較，&P<0.05；與米非司酮組比較，￥P<0.05圖4 不同藥物干預(yù)對(duì)細(xì)胞VEGF表達(dá)水平的影響

討 論

OHSS是不孕患者使用促排卵藥物后發(fā)生的醫(yī)源性并發(fā)癥，嚴(yán)重者可危害患者生命。目前OHSS發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，研究認(rèn)為可能與HCG反應(yīng)下多個(gè)黃體釋放大量血管活性物質(zhì)如VEGF、卵巢腎素-血管緊張素和其他細(xì)胞因子有關(guān)[1，7]。本課題組的臨床研究顯示，OHSS高?；颊唿S體期早期聯(lián)合使用GnRH-ant、來曲唑和米非司酮可較單一用藥更能有效縮短黃體期天數(shù)、降低OHSS發(fā)生，原因可能與三種藥物協(xié)同作用降低雌孕激素水平、加速黃體溶解有關(guān)[9]，但具體機(jī)制尚未明確。黃體主要由排卵后卵巢黃素化顆粒細(xì)胞構(gòu)成，可以分泌類固醇激素及其他細(xì)胞因子；促進(jìn)黃體細(xì)胞凋亡、抑制類固醇激素分泌，可以導(dǎo)致黃體功能性和結(jié)構(gòu)性退化，提前出現(xiàn)黃體溶解[10-11]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GnRH-ant、來曲唑、米非司酮分別抑制原代顆粒細(xì)胞及KGN細(xì)胞活力，降低顆粒細(xì)胞E2、孕激素分泌水平，但聯(lián)合用藥組作用最為顯著。

GnRH-ant通過與垂體GnRH受體競(jìng)爭性結(jié)合，可直接使黃體失去Gn支持，從而影響黃體活性和激素水平[12-13]。臨床研究表明，GnRH-ant可能直接作用于卵巢促進(jìn)黃體溶解，導(dǎo)致VEGF、雌激素水平降低，OHSS癥狀快速消退[14]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GnRH-ant可顯著抑制顆粒細(xì)胞活力、降低E2分泌水平，但對(duì)細(xì)胞凋亡率及孕激素分泌水平并無明顯影響。研究表明，GnRH-ant西曲瑞克可以降低人顆粒細(xì)胞生存活性，但對(duì)類固醇激素生成作用較小并呈劑量依賴性；GnRH-ant可能是通過與顆粒細(xì)胞中GnRH受體結(jié)合后激活Gi蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞活力[13]。OHSS患者體內(nèi)血清E2水平常高于非OHSS患者，臨床上常將其作為預(yù)測(cè)OHSS發(fā)生的重要指標(biāo)之一。

來曲唑(Letrozole)是一種芳香化酶抑制劑，可以降低顆粒細(xì)胞P450芳香酶mRNA表達(dá)和E2分泌水平[15]。本文研究顯示，來曲唑抑制原代顆粒細(xì)胞及KGN細(xì)胞活力、降低E2分泌水平。研究表明，雌激素可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，抑制顆粒細(xì)胞凋亡[16]。來曲唑可能通過降低雌激素分泌水平進(jìn)而影響顆粒細(xì)胞活力，但本研究中來曲唑組的顆粒細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比并無顯著差異。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，來曲唑可以抑制原代顆粒細(xì)胞分泌孕激素水平及VEGF表達(dá)。研究顯示，VEGF可促進(jìn)黃體形成及孕激素分泌，當(dāng)VEGF作用受到阻斷時(shí)孕激素水平降低并影響黃體的形成[17]。

孕激素具有保護(hù)黃體細(xì)胞活性的作用，米非司酮作為孕激素拮抗劑，通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞內(nèi)孕激素受體表達(dá)及活性，降低孕激素生成，從而促進(jìn)黃體顆粒細(xì)胞凋亡及黃體退化[18]。本研究中米非司酮可顯著抑制顆粒細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低孕激素分泌水平。且相關(guān)研究表明，米非司酮作用24 h后，顆粒細(xì)胞可出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變，并可通過激活細(xì)胞凋亡因子caspase-3活性導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)雖然GnRH-ant、來曲唑、米非司酮可能通過不同作用機(jī)制不同程度降低顆粒細(xì)胞活性、抑制細(xì)胞類固醇激素分泌功能促進(jìn)黃體結(jié)構(gòu)性和功能性退化，但聯(lián)合用藥組較單一用藥作用更為顯著。

VEGF是一種糖蛋白結(jié)構(gòu)的生長因子，具有促進(jìn)血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞增殖的特性，對(duì)卵巢血管及促黃體血管生成具有重要作用[10]。目前，VEGF常被作為檢測(cè)各種藥物及方案防治OHSS效果的主要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，GnRH-ant、來曲唑均可抑制原代顆粒細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)及VEGF分泌水平。研究發(fā)現(xiàn)，GnRH-ant在體外顯著降低人顆粒細(xì)胞VEGF的分泌，相反GnRH激動(dòng)劑并不能顯著降低VEGF水平，可能與GnRH-ant直接作用于卵巢GnRH受體激活G蛋白途徑有關(guān)[20]。臨床研究顯示黃體期應(yīng)用來曲唑可顯著降低VEGF水平且呈劑量依賴性降低[21]；另有研究表明來曲唑可顯著降低高危OHSS患者中重度OHSS的發(fā)生率，原因主要是通過促進(jìn)黃體溶解而并不降低血清VEGF的水平[3]，可能與患者體內(nèi)各種激素水平相互作用有關(guān)。此外，有研究認(rèn)為，雌激素可能間接作用促進(jìn)黃體細(xì)胞VEGF分泌且芳香化酶抑制劑作用后VEGF水平的降低[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與GnRH-ant、來曲唑不同，米非司酮可顯著降低原代顆粒細(xì)胞VEGF分泌水平，但VEGF mRNA水平與對(duì)照組相比并無顯著差異。動(dòng)物研究表明，隨著米非司酮?jiǎng)┝康脑黾樱殉睼EGF分泌水平呈劑量依賴性降低，但VEGF mRNA表達(dá)水平并無顯著改變[23]。促排卵患者卵泡內(nèi)VEGF水平與血清、卵泡內(nèi)孕激素水平呈正相關(guān)比例關(guān)系[24]，米非司酮降低孕激素水平、抑制VEGF生成，但它們之間的相互作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。結(jié)合原代顆粒細(xì)胞及KGN細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然GnRH-ant、來曲唑及米非司酮不同程度上降低顆粒細(xì)胞VEGF表達(dá)水平，但聯(lián)合用藥組VEGF mRNA表達(dá)及分泌水平最低，且與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，本研究通過人原代顆粒細(xì)胞及KGN細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)GnRH-ant抑制VEGF表達(dá)、來曲唑抑制雌激素分泌、米非司酮促進(jìn)細(xì)胞凋亡并降低孕激素產(chǎn)生，但三組藥物聯(lián)合較單一用藥顯著抑制顆粒細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞E2及孕激素分泌水平，抑制細(xì)胞VEGF表達(dá)，為臨床防治OHSS提供了更多理論依據(jù)。