沈開元，黃芬，羅江霞，韋靜，陳春艷，羅平，黃彥妮

(柳州市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學科，柳州 545006)

卵巢儲備功能通常直接反映女性的生育潛能，近年來隨著不孕人群的增加，卵巢儲備功能減退(Diminished ovarian reserve，DOR)患者的比例也逐年升高，并且患者年齡呈下降趨勢。DOR患者最明顯的表現(xiàn)是竇卵泡數(shù)(AFC)的急劇下降、基礎FSH升高以及卵泡數(shù)目和質(zhì)量下降。而卵母細胞能否正常完成減數(shù)分裂、受精、早期胚胎發(fā)育，是影響體外受精-胚胎移植(IVF-ET)結(jié)局的主導因素[1]。

外泌體(exosome)是一類可由多種細胞分泌、直徑約為 30～150 nm 的膜性囊泡，能夠參與免疫應答、抗原提呈、胞間通訊、蛋白質(zhì)和RNA 轉(zhuǎn)運等多種生理過程，是一種重要的細胞之間物質(zhì)和信息交流的工具[2]。microRNA(miRNA)是一類長度為 18～25個核苷酸組成的小分子RNA，研究證實miRNA對哺乳動物的生育能力起到重要的調(diào)控作用[3]，而外泌體能夠攜帶miRNA轉(zhuǎn)移至遠端細胞參與細胞生理活動調(diào)節(jié)，并且其雙層膜結(jié)構能夠保證miRNA在體液中的穩(wěn)定性，因此適合作為疾病的診斷標志和發(fā)病機制的研究。目前，有文獻指出外泌體miRNA與女性卵巢功能疾病相關，例如外泌體miRNA參與卵巢癌增殖、凋亡和遷移過程[4]。研究表明卵泡液同樣存在大量的外泌體，其外泌體miRNA參與卵母細胞減數(shù)分裂恢復、卵泡閉鎖凋亡以及表觀遺傳修飾等生物學事件[5]；由于卵泡液能夠與血液、顆粒細胞發(fā)生大量的物質(zhì)交換，為卵母細胞提供維持發(fā)育的微環(huán)境，所以卵泡液外泌體相比血清或者其他體液的外泌體更能反映卵泡的生理變化。然而目前DOR卵泡液外泌體miRNA的功能研究鮮有報道，因此本實驗通過研究卵巢功能正常和DOR患者卵泡液外泌體miRNA差異表達譜，尋找可能導致DOR相關的重要候選miRNAs，為今后進一步闡明DOR患者卵母細胞數(shù)量和質(zhì)量下降機制提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象

收集2019年12月至2020年3月于柳州市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學科進行輔助生殖治療的患者的卵泡液，根據(jù)常規(guī)檢查結(jié)果將患者分為卵巢功能正常組(對照組)和卵巢功能減退組(DOR組)。

納入標準：(1)對照組患者要求年齡≤35歲，均有排卵證據(jù)，基礎激素水平正常，月經(jīng)第 2～3天AFC在7～20個之間，因輸卵管梗阻或男方因素導致不孕；(2)DOR組患者要求符合DOR診斷標準[6-7]，年齡≤35歲，均有排卵證據(jù)，并且月經(jīng)第3天AFC≤5～7個、抗苗勒管激素(AMH)<0.5～1.1 ng/ml、基礎FSH>10 U/L，以上3項符合2項并排除輸卵管梗阻或男方因素導致不孕的患者納入研究。排除標準：(1)合并有其他女性內(nèi)外科疾病如PCOS、高泌乳素血癥和盆腔輸卵管炎癥等；(2)存在不良生活習慣(抽煙、酗酒等)和體重超重(體重指數(shù)BMI≥25 kg/m2)的患者。

共納入30例患者，其中對照組15例，DOR組15例。所有患者均簽署知情同意書。本研究通過柳州市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查(審批號：2020(KY-E-18-01))。

二、主要試劑和儀器

1.主要試劑：外泌體提取純化試劑盒(UR52141，上海宇玫博生物)；抗CD63鼠源單克隆一抗(ab193349)、抗TSG101鼠源單克隆一抗(ab83)(Abcam，英國)；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，美國)；測序試劑盒HiSeq 4000 SBS Kit(300 cycles)(Illumina，美國)。

2.主要儀器：離心機(Eppendorf，德國)；IVF工作站(K-system，丹麥)；倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)；ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀(Particle Metrix，德國)；Illumina Hiseq4000高通量測序儀(Illumina，美國)。

三、卵泡液的收集和保存

對照組主要使用黃體期長方案促排卵，DOR組主要使用微刺激或拮抗劑方案促排卵。當患者血清E2達到550.5～734.0 pmol/L、B超監(jiān)測顯示至少有一個卵泡直徑>18 mm時，肌肉注射HCG 10 000 U。注射 HCG 34～36 h后進行經(jīng)陰道超聲引導下取卵，并收集第一管澄清無血染卵泡液移入15 ml 離心管中[8]，常溫條件下3 000g離心10 min，去除雜質(zhì)，取上清迅速移入干凈的離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、外泌體的提取和鑒定

1.卵泡液外泌體的提取和純化：使用外泌體提取純化試劑盒制備外泌體樣本，根據(jù)說明書進行如下操作：將保存?zhèn)溆玫穆雅菀荷锨逶?0 000g、4℃離心20 min后去除細胞和組織碎片，每2 ml上清液加入對應的外泌體提取試劑(ECS溶液)0.5 ml；將混合物渦旋震蕩后在4℃孵育2 h，隨后在10 000g、4℃離心60 min獲得外泌體顆粒沉淀，用1×磷酸緩沖液(PBS)重懸顆粒沉淀，移入外泌體純化柱子中，在3 000g、4℃離心純化10 min；最后按照每20 ml樣本起始量添加200 μl 1×PBS的比例對外泌體顆粒進行重懸，并將重懸液移入無菌EP管中，立即-80℃保存，留待后續(xù)分析使用。

2.外泌體的鑒定：①透射電鏡鑒定外泌體形態(tài)：將提取的卵泡液外泌體固定在載物銅網(wǎng)上，經(jīng)過負染色和干燥處理后，透射電鏡下拍攝外泌體照片；②Western blot方法檢測外泌體特異標記蛋白CD63和TSG101的表達情況：按照常規(guī)操作方法，外泌體蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)過15% SDS-PAGE膠電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉1 h后分別加入CD63和TSG101 的鼠源單克隆一抗，4℃過夜孵育；孵育結(jié)束后TBST清洗3遍，加入二抗室溫孵育50 min，TBST清洗3遍，使用ECL+plusTMWestern blotting system試劑盒進行顯色，蛋白條帶顯示清晰后進行拍攝；③納米粒子軌跡分析(NTA)檢測外泌體顆粒大小和濃度：外泌體樣本用1×PBS緩沖液進行稀釋以適用于顆粒大小和濃度的測量。在溫度23℃～37℃條件下，使用ZetaView pmx110分析儀記錄并分析11個位置外泌體的測量值，測量數(shù)據(jù)使用110 nm的聚苯乙烯粒子進行校準。檢測報告和原始數(shù)據(jù)通過ZetaView系統(tǒng)生成導出。

五、外泌體miRNA高通量測序與分析

1.小RNA的文庫構建、測序與分析：各組隨機取5例患者卵泡液2 ml混勻為10 ml的均一樣本并提取純化外泌體作為測序用的生物學重復樣本；共進行3次重復。使用TRIzolReagent Invitrogen試劑盒提取外泌體總RNA(包括miRNA)，對外泌體總RNA進行質(zhì)檢，樣本濃度≥1 ng/μl且樣本總量≥10 ng滿足建庫要求。隨后利用Illumina TruSeq Small RNA試劑盒構建小RNAs文庫，首先將總RNA進行第一鏈cDNA的合成和純化，通過長距離PCR(LD-PCR)將第一鏈cDNA擴增為全長的雙鏈cDNA(ds cDNA)；ds cDNA經(jīng)過純化分析、定量檢測以及文庫回收后，用HiSeq 4000 PE Cluster Kit Illumina試劑盒進行聚類分析最終生成小RNAs文庫。

使用Illumina Hiseq4000高通量測序儀進行測序，上機樣本最終濃度為10 pmol/L。對獲得的原始數(shù)據(jù)進行去接頭、去除含未知堿基序列、去低質(zhì)量堿基序列、長度篩選處理，獲得 clean small RNA 序列；對clean reads進行長度分布統(tǒng)計和堿基偏好性分析；對clean reads去冗余后與 Rfam、miRBase數(shù)據(jù)庫和基因組序列比對，鑒定出已知和新miRNA、siRNA以及piRNA等各類 sRNA分子，分別獲得各自的表達量，進行差異表達分析、樣本特異表達miRNA分析和PCA分析；將去除非miRNA的序列后的reads與miRBase數(shù)據(jù)庫(miRBase 21，http：//www.mirbase.org/)中miRNA前體及成熟體序列進行比對，統(tǒng)計 map 到成熟體區(qū)域的序列數(shù)，并預測其二級結(jié)構。對各樣本已知miRNA進行表達量統(tǒng)計分析，利用TPM法進行表達量的均一化處理，以差異倍數(shù)(Fold Change)的絕對值 |FC|≥1.0且P值<0.05作為篩選標準，用DEseq2 軟件篩選差異表達的miRNA并進行層次聚類分析。文庫的構建、測序與分析均由上海宇玫博生物科技有限公司和上海美吉生物有限公司完成。

2.miRNAs的靶基因預測及功能分析：使用miRanda與TargetScanS軟件共同預測結(jié)果作為miRNA的候選靶基因。分別使用軟件Goatools (https：//github.com/tanghaibao/GOatools)和KOBAS(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)對預測的靶基因進行GO功能和KEGG信號通路富集分析，方法為Fisher精確檢驗；為控制計算的假陽性率使用4種多重檢驗方法 (Bonferroni，Holm，Sidak和false discovery rate)對P值進行校正；P值≤0.05作為顯著靶基因的閾值。

結(jié) 果

一、卵泡液外泌體鑒定結(jié)果

納米粒子軌跡分析(NTA)結(jié)果顯示，檢測的粒子直徑大小在30～200 nm之間，峰值主要集中在112.9 nm(圖1A)；使用蛋白免疫印跡檢測外泌體特異表達蛋白CD63和TSG101的結(jié)果顯示，所提取的外泌體的蛋白條帶與陽性對照條帶分子量相同，證實表達CD63和TSG101(圖1B)；透射電鏡觀察可見DOR卵泡液來源的外泌體的外形呈橢圓形或者茶托狀(圖1 C)。以上特性表明，分離的囊泡體是外泌體。

A：卵泡液外泌體顆粒直徑和濃度分布的NTA分析結(jié)果；B：外泌體CD63和TSG101蛋白表達情況；C：透射電鏡下外泌體的形態(tài)圖1 卵泡液外泌體的鑒定

二、卵泡液外泌體miRNA的表達差異情況

測序結(jié)果顯示，與對照組相比，DOR卵泡液外泌體中存在80個有明顯表達差異的miRNAs，其中31個表達上調(diào)，49個表達下調(diào)(圖2)。表1分別列出上調(diào)和下調(diào)表達差異倍數(shù)前10位的miRNAs。

圖2 對照組和DOR組卵泡液外泌體表達差異miRNA聚類分析熱圖

miRNAP值差異倍數(shù)(log2FC)調(diào)控方向miRNAP值差異倍數(shù)(log2FC)調(diào)控方向hsa-miR-47920.000 23714.90uphsa-let-7c-3p0.007 59214.25uphsa-miR-1840.000 3244.50uphsa-miR-331-3p0.003 5173.97uphsa-miR-150-5p0.001 2283.61uphsa-miR-425-5p0.008 8303.44uphsa-miR-675-3p3.46E-053.41uphsa-miR-483-3p2.89E-343.39uphsa-miR-505-5p0.001 8633.31uphsa-miR-625-3p0.001 1052.37uphsa-miR-136-3p0.002 395-15.28downhsa-miR-296-3p4.62E-05-15.25downhsa-miR-337-5p0.002 162-14.93downhsa-miR-369-3p0.003 806-14.79downhsa-miR-361-5p0.006 732-14.65downhsa-miR-77040.009 032-14.22downhsa-miR-22-3p1.49E-06-4.46downhsa-miR-378a-3p0.003 346-3.20downhsa-miR-122-5p2.55E-44-3.14downhsa-miR-145-3p0.006 631-2.97down

三、兩組差異表達miRNA的生物信息學分析

通過miRanda與TargetScanS軟件對差異表達的已知miRNA 進行靶基因預測，一共預測到17 159個靶基因。對差異表達miRNA靶基因進行GO分析，可見靶基因參與的生物學功能比較廣泛，富集的生物學功能包括電離型谷氨酸受體信號通路(Ionotropic glutamate receptor signaling pathway)、氨基酸轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)(Regulation of amino acid transport)、脂多糖介導信號通路(Lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)及發(fā)育相關的凋亡過程(Apoptotic process involved in development)(圖3A)。通過進一步Pathway分析發(fā)現(xiàn)，富集相對顯著的信號通路有：趨化因子信號通路(Chemokine signaling pathway)、環(huán)磷酸腺苷信號通路(cAMP signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)及絲裂原活化蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)等(圖3B)。

A：GO分析；B：KEGG pathway分析圖3 差異表達miRNA靶基因的GO和KEGG Pathway分析

討 論

卵巢儲備功能減退(DOR)是一類多因素誘導疾病，異常血管化、氧化應激、自由基失衡、毒性和遺傳學改變都可以促使卵母細胞質(zhì)量下降，進而導致異常受精和胚胎質(zhì)量低下。化學藥物和放射治療也會促進患者原始卵泡的消耗，此外DOR的病因還包括自身免疫疾病、醫(yī)源性損傷以及不良生活習慣等[9]。在輔助生殖治療中，DOR患者常常出現(xiàn)周期取消率高、獲卵數(shù)少、臨床妊娠率和活產(chǎn)率低而流產(chǎn)率高等臨床結(jié)局?，F(xiàn)在臨床上常用激素類藥物來治療DOR，例如脫氫表雄酮(DHEA)、生長激素等能夠改善患者的臨床結(jié)局[10-11]。此外，在促排卵過程中促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)和拮抗劑(GnRH-ant)的使用能夠有效避免內(nèi)源性LH峰，防止卵泡萎縮或早排，從而提高卵母細胞質(zhì)量和內(nèi)膜容受性。然而，這些研究缺乏對于修復改善卵巢儲備功能以及DOR發(fā)病機理的深入研究。

DOR患者卵巢功能異常主要是由于過氧化物增加、顆粒細胞的異常凋亡和增殖導致卵泡發(fā)育阻滯和卵母細胞凋亡。研究表明卵泡液中的成分能夠反映卵母細胞質(zhì)量和臨床結(jié)局，例如卵泡液的激肽酶譜與PCOS合并代謝綜合征患者優(yōu)質(zhì)胚胎形成有關[12]，卵泡液中25-羥維生素D低水平的患者的胚胎種植率和臨床妊娠率顯著低于高水平的患者[13]。此外在卵泡液中存在不同形式的miRNA調(diào)控卵泡發(fā)育的生理狀態(tài)[14-16]，參與到始基卵泡形成、優(yōu)勢卵泡募集、黃體形成和排卵以及卵泡閉鎖等過程。近年的研究發(fā)現(xiàn)卵泡液中外泌體miRNA與卵巢功能障礙疾病聯(lián)系緊密，一項多囊卵巢綜合征(PCOS)的研究指出，卵泡液外泌體介導miRNA在細胞間的傳遞可能是導致PCOS的重要發(fā)病機理之一[8]。這提示我們，卵泡液外泌體miRNAs是研究DOR發(fā)病機理的重要切入點。

本研究在外泌體提取過程發(fā)現(xiàn)無論是對照組還是DOR組卵泡液中都存在大量的外泌體，一個值得關注的現(xiàn)象是DOR患者卵泡液外泌體的總含量要明顯低于對照組，提示DOR患者卵泡液中的外泌體含量降低可能與卵泡的異常有關，在后續(xù)研究中可以進一步驗證這一現(xiàn)象。我們通過Illumina Hiseq 4 000測序平臺對對照組和DOR組的卵泡液外泌體進行了高通量測序，對兩組外泌體miRNAs的表達譜進行分析，結(jié)果共篩選出80個差異表達的miRNA，其中hsa-miR-4792、hsa-let-7c-3p、hsa-miR-184等31個miRNA表達上調(diào)，hsa-miR-136-3p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-337-5p等49個miRNA表達下調(diào)。這說明與對照組相比，DOR卵泡液外泌體miRNA表達譜發(fā)生了顯著的表達變化。

miRNA的生物學功能主要是通過靶向調(diào)控一個或者多個靶基因來發(fā)揮的。為了了解外泌體miRNA調(diào)節(jié)DOR的分子機制，我們采用了miRanda與TargetScanS數(shù)據(jù)庫預測差異表達miRNA的靶基因。一些表達上調(diào)的miRNA如預測hsa-miR-150-5p的候選靶基因之一是MMP14，相關研究表明miR-150-5p可以通過靶向MMP14抑制肝癌細胞的遷移和侵入[17]；還有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的神經(jīng)元樣細胞中，hsa-miR-505-5p能夠通過負調(diào)控CREG1促進糖氧剝奪/復氧誘導的神經(jīng)元損傷[18]。本研究預測的結(jié)果與文獻報道相符。因此外泌體 miRNA 通過與靶基因靶向結(jié)合在DOR中發(fā)揮的功能以及涉及的生物學通路值得進一步深入研究。

我們隨后對靶基因功能進行生物信息學分析，GO和KEGG分析的結(jié)果提示這些靶基因參與了脂多糖介導信號通路以及發(fā)育相關的凋亡過程等生物學功能，并且參與了卵泡或者卵母細胞發(fā)育的相關信號通路。例如，cAMP信號通路：cAMP主要維持卵母細胞減數(shù)分裂阻滯，防止未成熟卵母細胞提前減數(shù)分裂和排卵[19]；MAPK通路：參與卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程，包括促進生發(fā)泡破裂、抑制減數(shù)分裂過程中的DNA復制、調(diào)節(jié)染色體的分離、維持MII期阻滯、誘發(fā)第2次減數(shù)分裂恢復等[20]；TNF信號通路：調(diào)控細胞凋亡信號通路之一，研究表明TNF-α參與哺乳動物卵巢顆粒細胞的凋亡調(diào)控[21]，在人的顆粒細胞中也發(fā)現(xiàn)TNF-αmRNA和受體的表達，說明TNF信號通路可能也參與調(diào)控人類顆粒細胞的凋亡進而影響卵母細胞及胚胎發(fā)育[22]。

本研究首次通過比較卵巢功能正?；颊吆虳OR患者卵泡液外泌體所攜帶的miRNA基因表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)DOR卵泡液外泌體miRNA表達譜發(fā)生了明顯的改變；通過對這些差異表達miRNA的靶基因進行GO分析和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)靶基因可能參與調(diào)控MAPK、cAMP、TNF等信號通路，進而影響DOR的病理生理過程。根據(jù)本研究結(jié)果，我們下一步將繼續(xù)篩選出在DOR病程起到重要調(diào)控作用的miRNA，進一步闡明DOR及其他卵巢功能障礙疾病(如PCOS、早發(fā)性卵巢功能不全以及卵巢癌等)的發(fā)生和發(fā)展的分子機制，為找尋新的防治方法的研究提供新的思路和實驗依據(jù)。