羅 程 朱利民 張元斌 孫 奇 胡柏松 鮑榮華 陳學(xué)強(qiáng)

骨質(zhì)疏松性骨折是指因骨量丟失后骨密度降低、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)被破壞而引起的一種脆性骨折，是骨傷科臨床多發(fā)病與常見病[1]。該類骨折損傷重且復(fù)雜，骨折不穩(wěn)定，多發(fā)老年女性等骨質(zhì)疏松人群，常合并多種內(nèi)科疾病等。臨床上，因處理不合理不及時，存在較高骨折延遲愈合、骨折不愈合發(fā)生率，甚至導(dǎo)致殘疾與死亡[2]。鑒于這類骨折的特殊性，在合理處理骨折的同時還需結(jié)合進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松治療。研究發(fā)現(xiàn)，中藥促進(jìn)骨折愈合的同時還可改善骨質(zhì)疏松[3-4]?；钛?，補(bǔ)腎益精是中醫(yī)治療骨折的原則，制狗脊為臨床上治療骨質(zhì)疏松癥常用補(bǔ)腎中藥。實驗研究發(fā)現(xiàn)，狗脊可抑制破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)成骨，具有抗骨質(zhì)疏松作用[5]。本研究擬通過骨密度檢測、Micro-CT 等方法觀察制狗脊對大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響，并通過檢測鈣、磷、血清TGF-β1、IL-1β 水平初探其作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 藥物及制備 取制狗脊5kg（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥廠）10 倍純水浸泡1h，煎煮1h，提取2 次，過濾后藥液旋蒸儀濃縮至濃度104.2g/L 備用[6]。七厘散膠囊（華頤藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.5g/粒，國藥準(zhǔn)字Z10940041），脫膠囊后用生理鹽水稀釋配制成濃度0.3/mL 的混懸液備用。七厘散膠囊給藥劑量依人與動物等效劑量換算得出[7]。

1.2 動 物 32 只SPF 級SD 雌性大鼠，體質(zhì)量200～250g，生產(chǎn)許可：SCXK（滬）2013-0016；使用許可：SYXK（浙）2013-0184，于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心訂購，且飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下12h 晝12h夜循環(huán)，溫度恒定20℃，濕度48%，采用標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)。實驗動物處置符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 儀器及試劑 PVP 碘（杭州朗索醫(yī)用消毒劑有限公司，批號20160720）；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGFβ1）試劑盒（批號20160722）和白介素-1β（IL-1β）試劑盒（批號20160715）均購自艾博抗上海生物有限公司、Micro-CT、骨密度掃描儀（BRUKER MICROCT N.V，型號Skyscan1176）。

2 實驗方法

2.1 大鼠骨質(zhì)疏松模型 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，32 只SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表分成對照組與觀察組，各組按2、6 周時間點再分為兩個亞組，每組8 只。1%戊巴比妥鈉麻醉（4mL/kg）后備皮、消毒、鋪巾后摘除雙側(cè)卵巢，制備去卵巢骨質(zhì)疏松模型[8]。備皮、消毒、鋪巾、切開，行股骨中段橫行骨折造模[5]，并以1mm 克氏針固定，消毒縫合切口皮膚。

2.2 骨折模型與干預(yù) 骨質(zhì)疏松造模6 周后經(jīng)骨密度檢測確定造模成功，再經(jīng)備皮、常規(guī)消毒鋪巾后切皮行脛骨骨折造模，骨折造模完成后再予克氏針固定[9]，檢查穩(wěn)定性后予縫合。

2.3 藥物干預(yù)與樣本處理 骨折造模后均需行X線檢測，骨折造模術(shù)后24h 開始干預(yù)，觀察組大鼠予制狗脊水提物灌胃（濃度104.2g/L，劑量10mL/kg，1天1 次）[6]，對照組大鼠予七厘散膠囊藥液灌胃（濃度0.3g/mL，劑量17mL/kg，1 天1 次），干預(yù)2、6 周后，兩組大鼠麻醉后抽取主動脈血經(jīng)靜置、離心后制備血清于-20℃冰箱備用，并于骨折部位上下關(guān)節(jié)處離斷，小心剔除肌肉組織（注意保護(hù)骨折處骨痂），骨痂上下0.5cm 再次修裁組織，置于固定液72h 待后續(xù)處理。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 骨密度檢測 骨質(zhì)疏松造模后6 周，所有大鼠均行骨密度檢測。干預(yù)2、6 周后大鼠收樣固定72h后均行骨密度檢測。

2.4.2 Micro-CT 檢測 Micro-CT 掃描完成后，選取骨折端周圍400 層圖像進(jìn)行重建分析。觀察指標(biāo)：骨體積分?jǐn)?shù)BV/TV、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（structure model index，SMI）[10]。

2.4.3 血清檢測 解凍各組大鼠血清，分別檢測血清TGF-β1、IL-1β 水平與鈣、磷水平，各試劑常溫后經(jīng)加樣、育溫、甩干等步驟后經(jīng)酶標(biāo)儀檢測后記錄數(shù)據(jù)，具體操作步驟參照各試劑盒說明書。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，組間行獨立樣本t 檢驗，檢驗水準(zhǔn)為P<0.05。

3 實驗結(jié)果

3.1 兩組大鼠脛骨中段骨密度比較 與對照組比較，觀察組大鼠2、6 周時脛骨中段骨密度顯著增加（P 均<0.05），見表1。

表1 兩組大鼠脛骨中段骨密度比較（g/cm2，）

表1 兩組大鼠脛骨中段骨密度比較（g/cm2，）

注：觀察組予制狗脊水提物灌胃；對照組予七厘散膠囊藥液灌胃；與對照組比較，aP＜0.05

3.2 截面圖 選取各組各時間點矢狀、冠狀截面圖，依圖可見兩組大鼠骨折端骨痂逐漸增多，骨折逐漸趨于愈合。干預(yù)2 周后可見觀察組大鼠骨痂量、密度及連續(xù)性均明顯優(yōu)于對照組。干預(yù)6 周后兩組間差異明顯，雖然觀察組骨痂量少于對照組，但其骨痂爬過骨折線，斷端骨折線不明顯，骨痂塑形。見圖2-3。

圖2 脛骨中段矢狀截面圖

圖3 脛骨中段冠狀截面圖

3.3 三維重建 兩組各時間點脛骨中段骨折端骨痂三維重建（見圖4）。兩組骨質(zhì)密度、小梁形態(tài)逐漸變強(qiáng)變粗，骨折后2 周觀察組骨痂骨量多于對照組；而骨折6 周后對照組骨痂網(wǎng)狀、板狀小梁參半，反觀觀察組骨痂密實，小梁規(guī)則呈板狀，骨折線消失，小梁質(zhì)量較對照組更優(yōu)。

表2 各組Micro-CT 檢測參數(shù)比較（）

表2 各組Micro-CT 檢測參數(shù)比較（）

注：觀察組予制狗脊水提物灌胃；對照組予七厘散膠囊藥液灌胃；BV/TV 為相對骨體積；Tb.N 為骨小梁數(shù)量；Tb.Th 為骨小梁厚度；SMI 為結(jié)構(gòu)模型指數(shù)；與對照組同期比較，aP＜0.05

表3 各組大鼠血清TGF-β1、IL-1β 及鈣、磷水平比較（）

表3 各組大鼠血清TGF-β1、IL-1β 及鈣、磷水平比較（）

注：觀察組予制狗脊水提物灌胃；對照組予七厘散膠囊藥液灌胃；TGF-β1 為轉(zhuǎn)化生長因子-β1；IL-1β 為白介素-1β；與對照組同期比較，aP＜0.05

圖4 骨折端骨痂三維重建

3.4 Micro-CT 參數(shù) Micro-CT 掃描參數(shù)[6]顯示，干預(yù)2 周后觀察組Tb.N、SMI 參數(shù)均優(yōu)于對照組（P＜0.05），兩組BV/TV 與Tb.Th 參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)6 周后，觀察組BV/TV、Tb.N、Tb.Th、SMI 參數(shù)均優(yōu)于對照組（P 均＜0.05）。見表2。

3.5 兩組大鼠血清TGF-β1、IL-1β 及鈣、磷水平比較 觀察組干預(yù)后2、6 周TGF-β1 水平均高于對照組（P 均＜0.05），IL-1β 水平低于對照組（P 均＜0.05）。干預(yù)后2 周，觀察組大鼠血清鈣、磷水平明顯高于對照組（P 均＜0.05），兩組大鼠干預(yù)后6 周血清鈣、磷水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

4 討論

骨質(zhì)疏松性骨折是發(fā)生于骨強(qiáng)度降低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞、骨骼脆性增大全身代謝疾病基礎(chǔ)上的骨折[1]，所以其臨床處理既要復(fù)位骨折又要抗骨質(zhì)疏松治療，骨折復(fù)位可通過手法整復(fù)、手術(shù)等方法實現(xiàn)，而骨質(zhì)疏松癥的治療目前多依賴破骨細(xì)胞骨吸收的抑制，雖然骨折愈合需要大量成骨，但也離不開破骨細(xì)胞的塑形作用。

制狗脊作為常用補(bǔ)腎中藥，其性溫味苦、甘，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝、祛風(fēng)濕等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有促成骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞活性的作用。此外，狗脊還被發(fā)現(xiàn)具有抑菌抗炎、抑制血小板聚集、鎮(zhèn)痛等作用[5]。本實驗中，觀察組干預(yù)2、6 周后骨密度檢測結(jié)果均優(yōu)于對照組，而骨密度是評估骨量的有效指標(biāo)，BV/TV 參數(shù)可直接反映骨量多少且更敏感、可靠。本研究中，在干預(yù)6 周后觀察組BV/TV 參數(shù)高于對照組（P＜0.05），提示制狗脊提取物可增加骨質(zhì)疏松性骨折骨痂骨量。Tb.Th、Tb.N 為骨痂骨小梁厚度與數(shù)量，與骨強(qiáng)度密切相關(guān)。本研究中觀察組Tb.N、Tb.Th 指標(biāo)均優(yōu)于對照組（P＜0.05），這提示觀察組大鼠骨痂強(qiáng)度更高。SMI 為結(jié)構(gòu)模型指數(shù)，反映的是骨痂生物力學(xué)性質(zhì)，本研究中觀察組干預(yù)2、6 周后SMI 均優(yōu)于對照組，這進(jìn)一步印證了制狗脊改善骨質(zhì)丟失、增強(qiáng)骨強(qiáng)度的作用。制狗脊作用機(jī)制可能與其提取物可有效抑制破骨細(xì)胞活性，降低骨鈣素、脫氧吡啶啉水平，抑制骨吸收有關(guān)；另一方面，還可能與制狗脊可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及上調(diào)ALP 活性成分有關(guān)[11]。

鈣磷是成骨過程中不可或缺的組分，在干預(yù)后2、6 周觀察組血清鈣、磷水平均高于對照組，兩組在兩觀察時間點TGF-β1 水平也存在顯著差異，提示制狗脊可有效上調(diào)TGF-β1 水平，而TGF-β1 水平對成骨分化具有至關(guān)重要的作用，可有效促進(jìn)其增殖、分化[12]，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合，觀察組大鼠骨量更優(yōu)可能與其有關(guān)。另外，對照組兩時間點IL-1β 水平均高于觀察組，而IL-1β 可通過NF-κB 等信號通路參與破骨細(xì)胞活性調(diào)控[13]。一定水平的IL-1β 有利于骨痂重塑，然而對于骨質(zhì)疏松性骨折患者而言，這可能引發(fā)成骨-破骨體系中的破骨優(yōu)勢。因此，可以認(rèn)為制狗脊一方面可有效上調(diào)TGF-β1 水平從而促進(jìn)成骨分化，另一方面還可抑制IL-1β 分泌而部分抑制破骨優(yōu)勢，共同促進(jìn)骨折愈合。

綜上所述，制狗脊提取物可增加骨質(zhì)疏松性骨折骨痂骨量，并增強(qiáng)其強(qiáng)度，促進(jìn)骨痂生成與塑形，進(jìn)而促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合，且其機(jī)制可能與其對血清IL-1β、TGF-β1 水平的調(diào)節(jié)有關(guān)。