王歲樓 張 沛

（中國藥科大學(xué)工學(xué)院，江蘇南京 211198）

類胡蘿卜素作為一種重要的生理活性物質(zhì)，在食品、醫(yī)藥和保健品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。類胡蘿卜素種類繁多，廣泛存在于水果蔬菜中。水芹是人們經(jīng)常食用的水生蔬菜，含有芹菜素、黃酮、氨基酸、類胡蘿卜素等功能成分，在其功能成分含量以及活性判定等方面仍具有很大的研究空間。本試驗旨在探究水芹類胡蘿卜素粗提物分離純化的最優(yōu)條件，并對其進(jìn)行抗氧化活性判定，以期為水芹及其類胡蘿卜素的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

水芹，購自南京農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)預(yù)處理和榨汁、有機(jī)溶劑提取，制得粗提物，供進(jìn)一步分離純化。

丙酮、石油醚、水楊酸、Tris、抗壞血酸、二苯代苦味肼基（DPPH）、鄰苯三酚（焦性沒食子酸） 等，均為分析純；硅膠，100 目～200 目、200目～300 目，青島海洋化工廠產(chǎn)品；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KH-100B 型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；754N 紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；TGL-16G 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；全波長酶標(biāo)儀Mutiskan GO，奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 β-胡蘿卜素含量的測定

稱取適量β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解定容于10 mL 棕色容量瓶中，得到系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。利用紫外分光光度計測定各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm 最大吸收波長處的吸光度值，根據(jù)質(zhì)量濃度與吸光度值的對應(yīng)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），線性方程為y=0.098 8x+0.004 8，R2=0.999 1。在線性方程的輔助下計算樣品中β-胡蘿卜素含量。

圖1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度-吸光度值關(guān)系曲線

1.4 柱層析分離純化

將填充用的硅膠G（100 目～200 目、200 目～300 目） 于110 ℃烘箱中烘干1 h 活化備用。稱取適量的硅膠G，用丙酮與石油醚比例為1:20 的混合溶液溶解，進(jìn)行濕法填柱，填柱過程中用吸耳球輕輕敲打柱身，柱子不能出現(xiàn)氣泡以及裂縫，并保持填充劑上表面平整。沿管壁環(huán)形從柱頂慢慢加樣，洗脫劑同樣使用丙酮與石油醚比例為1∶20 的混合溶液進(jìn)行洗脫，整個過程保證填充劑始終浸在洗脫劑中，不能使洗脫劑流干。維持適當(dāng)?shù)牧魉?，對分離的黃色組分進(jìn)行收集并鑒定成分。

1.5 類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)鑒定

1.5.1 薄層色譜層析

取活化后鋪好的薄層板，在離底邊約1 cm～2 cm處用鉛筆畫一條基線，在基線上用毛細(xì)管分別點上β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品和分離純化后的水芹類胡蘿卜素樣品。因樣品濃度較低可以適當(dāng)多點幾次，每次點完要晾干后再繼續(xù)點樣，以避免點樣直徑過大。將點好樣的薄層板置于層析缸中在暗處展開，展開劑選用體積比為2∶1 的石油醚-丙酮混合液。在自然光下觀察樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的展開狀況。

1.5.2 紫外-可見光吸收光譜

利用酶標(biāo)儀在200 nm～500 nm 區(qū)域內(nèi)對分離純化后的樣品進(jìn)行波長掃描，得到水芹類胡蘿卜素分離純化產(chǎn)物的紫外-可見光吸收光譜。

1.6 抗氧化活性測定

1.6.1 水楊酸法羥自由基清除率的測定

依參考文獻(xiàn)［4］［5］進(jìn)行，略有調(diào)整，按下式計算：

其中，A0、Ax、Ax0分別為空白組、樣品組和對照組的吸光度值。

1.6.2 DPPH·自由基清除率的測定

依參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行，略有調(diào)整，按下式計算：

其中，A樣品、A空白、A對照分別為樣品組、空白組和對照組的吸光度值。

1.6.3 超氧負(fù)離子自由基清除率的測定

依參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行，略有調(diào)整，按下式計算：

其中，A1為以丙酮為參比溶液測定的不同濃度水芹類胡蘿卜素提取液反應(yīng)溶液的吸光度值，A0為空白對照組的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 水芹類胡蘿卜素粗提物的分離純化

2.1.1 洗脫劑對分離純化的影響

采用洗脫劑和裝柱溶劑一致的條件（采用常規(guī)方法，預(yù)試驗用乙醇填充硅膠并不能很好的出現(xiàn)分離條帶，因此選用一致的洗脫劑和裝柱溶劑），進(jìn)行丙酮與石油醚1∶10、1∶20、1∶30 的試驗，發(fā)現(xiàn)以1∶10 的溶劑比為洗脫條件，不能出現(xiàn)黃色條帶即不能分離出目標(biāo)產(chǎn)物；1∶20、1∶30 的分離效果好，出現(xiàn)綠色和黃色條帶且分離程度好，分離時間短。

2.1.2 填充物對分離純化的影響

硅膠的分離效果比氧化鋁的分離效果好，氧化鋁分離速度慢，色素條帶不清晰，需要高濃度的色素溶液上樣才能出現(xiàn)清晰的條帶。對硅膠的孔徑大?。?00 目～200 目、200 目～300 目） 進(jìn)行比較試驗，發(fā)現(xiàn)200 目～300 目硅膠做填充物時由于孔徑較大，樣品組分在柱中停留時間長，分離效率不高；而100 目～200 目孔徑硅膠做填充物時能夠以相對較快的速率完成組分分離。因此，100 目～200目孔徑硅膠填充物分層效果更好。

2.1.3 柱徑高比對分離純化的影響

在對柱徑高比的試驗研究中，發(fā)現(xiàn)柱徑高比為1∶3 時色素條帶分離程度不夠，與柱徑高比為1∶4、1∶5 的分離柱相比柱長略短；柱徑高比1∶5 時，葉綠素與類胡蘿卜素的黃色與綠色條帶分離明顯，但是由于柱長過長，分離時間長，相比而言柱徑高比為1∶4 時分離效果最好。

2.1.4 上樣量對分離純化的影響

在對上樣量的試驗研究中，采用1 mL、2 mL、3 mL 的梯度進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過柱層析分離后的類胡蘿卜素成分含量相差不大。1 mL 上樣量顏色較淺，對比度不高；2 mL 上樣量適中，能夠有效的進(jìn)行分層判定；3 mL 上樣量分層清晰，顏色明顯。但由于分離后含量相差不大，說明上樣量為3 mL 時，組分在柱子中與填充物結(jié)合較多，得到的產(chǎn)物量相對較少，而上樣量為1 mL 時，顏色區(qū)分不明顯不能滿足操作要求，因此上樣量2 mL 時分離效果最好。

2.1.5 最優(yōu)分離純化條件的確定

綜合上述試驗結(jié)果，最優(yōu)分離純化條件組合初步確定如下：選用孔徑100 目～200 目硅膠G，填充柱徑高比1∶4，上樣量2 mL，洗脫劑與填充劑皆為丙酮：石油醚體積比1∶20，此時提取物類胡蘿卜素含量均值可達(dá)3.39 μg/mL，純化倍數(shù)為4.255 8/ 2.783 8=1.53，其中2.783 8、4.255 8 為樣品在分離純化前、后的β-類胡蘿卜素含量。

2.2 水芹類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)的鑒定

2.2.1 薄層色譜層析結(jié)果

展開劑選擇石油醚與丙酮體積比為2:1 的混合溶劑，極性較低。由于水芹色素中的類胡蘿卜素極性低，而葉綠素的極性高，根據(jù)相似相溶原理，類胡蘿卜素在該展開劑中會被很快推到薄層板的前端。由于點樣的樣品是經(jīng)過柱層析分離后的類胡蘿卜素溶液，因此葉綠素的含量更少，在板中未出現(xiàn)多個斑點，只有黃色的β-胡蘿卜素的斑點。在水芹色素粗提物中由于葉綠素含量多，β-胡蘿卜素為占比較小的組分，因此先經(jīng)分離純化再進(jìn)行薄層色譜層析，排除葉綠素的干擾。同時也可檢測柱層析是否起到良好的分離效果。

圖2 水芹類胡蘿卜素與β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品薄層色譜圖

由圖2 可見，水芹類胡蘿卜素斑點與β-類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液同行展開，比移值時刻保持相同，因此可定性分離純化后的水芹類胡蘿卜素溶液為β-胡蘿卜素。

2.2.2 紫外-可見光吸收光譜圖

水芹類胡蘿卜素溶液與丙酮的紫外可見光吸收光譜，見圖3。

圖3 水芹類胡蘿卜素溶液與丙酮紫外可見光吸收光譜圖

由圖3 可知，兩條譜線在200 nm～300 nm 之間大部分重合，因為樣品溶解于丙酮中，排除溶液對樣品吸收光譜的干擾；在440 nm～460 nm 處水芹類胡蘿卜素溶液的吸收峰明顯高于丙酮。參考β-胡蘿卜素的特征吸收峰，可判斷水芹類胡蘿卜素溶液中的主要成分是β-胡蘿卜素。

2.3 抗氧化活性的測定

2.3.1 水楊酸法羥自由基清除率的測定

不同質(zhì)量濃度水芹類胡蘿卜素Vc對羥自由基清除率如下頁圖4 所示。從圖4 可看出，水芹類胡蘿卜素質(zhì)量濃度與羥自由基清除率總體上呈正相關(guān)，即β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度越高其羥自由基清除率就越高。但通過與抗壞血酸對比，在相同質(zhì)量濃度時，抗壞血酸的自由基清除率高于水芹β-胡蘿卜素。在較高質(zhì)量濃度時，水芹β-胡蘿卜素也具有較高的自由基清除率，這為水芹的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

圖4 水芹類胡蘿卜素和Vc 對羥自由基的清除率

2.3.2 DPPH·自由基清除率的測定

DPPH·自由基的清除率可反應(yīng)水芹β-胡蘿卜素的抗氧化能力，根據(jù)公式計算，得到水芹β-胡蘿卜素樣品的清除率可達(dá)9.42%，說明在β-胡蘿卜素這種自由基清除劑存在下，DPPH·的孤對電子與其配對顏色降低，證明水芹β-胡蘿卜素具有較好的抗氧化活性。

2.3.3 超氧負(fù)離子清除率的測定

不同質(zhì)量濃度水芹類胡蘿卜素對超氧負(fù)離子的清除率見圖5。

圖5 水芹類胡蘿卜素對超氧負(fù)離子的清除率

由圖5 水芹類胡蘿卜素對超氧負(fù)離子的清除率的關(guān)系可得出，隨著β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度的增加，其對超氧負(fù)離子的清除率也逐漸增加，且清除率在40%水平以上。這表明水芹對超氧負(fù)離子具有很強(qiáng)的清除作用。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，采用柱層析技術(shù)對水芹類胡蘿卜素粗提物進(jìn)行分離純化是可行的，當(dāng)硅膠G 孔徑大小為100 目～200 目，填充物柱徑高比為1∶4，上樣量2 mL，洗脫劑與填充劑皆為丙酮石油醚混合液（體積比1∶20），此時物質(zhì)分層顏色對比清晰，分離效果較佳，純化倍數(shù)可達(dá)1.53。

對分離純化液進(jìn)行薄層色譜層析以及紫外可見光吸收光譜檢測，確定水芹中類胡蘿卜素主要是β-胡蘿卜素。同時3 種體外抗氧化活性試驗皆表明水芹類胡蘿卜素對不同自由基有不同清除能力，其中對超氧負(fù)離子清除效果最好，這為水芹類胡蘿卜素的開發(fā)利用提供了依據(jù)。