李 敏 ，劉海兵，劉 冰，尹桂軍，吳帥帥，于 杰，李 楠，李雪賢*

（1.國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東東阿 252201；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

德州驢原產(chǎn)于山東省濱州市、德州市沿渤海各縣，是中國(guó)五大優(yōu)良驢種之一，體型高大，是我國(guó)傳統(tǒng)的役肉兼用驢品種。然而隨著農(nóng)業(yè)和運(yùn)輸業(yè)迅速發(fā)展，驢的役用功能減弱，存欄量驟減[1]，德州驢也面臨著種質(zhì)資源退化和數(shù)量逐漸降低的嚴(yán)峻形勢(shì)，目前已被列為國(guó)家級(jí)種質(zhì)資源保護(hù)對(duì)象[2]。近年來(lái)隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)驢皮制品（阿膠）、驢肉、驢奶的需求也逐年增加。大力發(fā)展德州驢的人工繁殖技術(shù)對(duì)解決供需矛盾，保護(hù)種質(zhì)資源，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，具有重要意義。已有研究發(fā)現(xiàn)，公畜的精液品質(zhì)受季節(jié)變化影響較大。夏季高溫會(huì)導(dǎo)致種公畜精液質(zhì)量暫時(shí)性下降[3-4]，而在冬季采集的精子密度最低，但其具有最佳的解凍活力，適宜進(jìn)行凍精生產(chǎn)[5]。研究表明，品種、年齡、采精頻率[6-7]等多種因素對(duì)種公驢精液品質(zhì)和繁殖力均會(huì)產(chǎn)生深刻影響。但是關(guān)于季節(jié)對(duì)種公驢精液質(zhì)量影響的研究鮮有報(bào)道。據(jù)此，本試驗(yàn)在常規(guī)飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，通過(guò)對(duì)比德州黑毛驢在不同季節(jié)的采精量、原精密度、精子活率及冷凍復(fù)蘇率的變化，分析德州驢精液質(zhì)量的季節(jié)性變化規(guī)律，為實(shí)際生產(chǎn)中合理使用種公驢（常規(guī)配種和凍精生產(chǎn)）提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)動(dòng)物 選取東阿國(guó)家黑毛驢繁育中心的9 頭種公驢，對(duì)其2016—2019 年春季（3—5 月）、夏季（6—8 月）、秋季（9—11 月）和冬季（12 月—次年2 月）的采精狀況及生產(chǎn)性能指標(biāo)進(jìn)行跟蹤與統(tǒng)計(jì)。所有種公驢均單欄飼養(yǎng)，圈舍干凈整潔，定時(shí)運(yùn)動(dòng)保健。每頭種公驢每周采精不超過(guò)3 次。

1.2 試驗(yàn)材料與試劑 電熱恒溫水浴鍋（DK-8B；上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、顯微鏡、精子密度測(cè)定儀（RS232；法國(guó)卡蘇科技股份有限公司）、程序冷凍儀（德國(guó)米尼圖Minitube 公司）、計(jì)算機(jī)輔助精子活力分析儀（AndroVision ?；德國(guó)米尼圖Minitube 公司）、假陰道、集精杯、載玻片、蓋玻片、液氮罐等儀器設(shè)備。試劑配置所需青霉素、鏈霉素購(gòu)自Amresco 公司，葡萄糖、果糖、檸檬酸、甘油等均購(gòu)自Sigma 公司。

1.3 精液樣品的采集、測(cè)定及冷凍 通過(guò)假陰道刺激法采集種公驢精液，將消毒后的采精筒加入45～50℃溫水保溫，采集的精液收集至底部集精杯中，紗布過(guò)濾至37℃預(yù)熱的玻璃量筒中，記錄原精體積。移液槍取7 μL原精，滴至預(yù)熱的載玻片上，壓片后，顯微鏡下觀察精子形態(tài)，并使用計(jì)算機(jī)輔助精子活力分析儀（CASA）檢測(cè)精子活率，記錄精子快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)活力。吸取120 μL原精加入3 mL 生理鹽水中，混勻，使用精子密度儀測(cè)量原精密度。按1:1 的比例將原精與預(yù)熱基礎(chǔ)液（含Trizma Base、葡萄糖、檸檬酸、青霉素、鏈霉素）混勻[8]，23℃靜置10 min。然后600 g×離心10 min，去掉上清液。用冷凍保存液（含葡萄糖、Trizma Base、檸檬酸、卵黃、甘油）重懸精子，調(diào)整密度至1×108個(gè)/mL，灌裝入0.5 mL凍精細(xì)管中，將其置于4℃平衡柜中恒溫約3 h。隨后使用全自動(dòng)程序冷凍儀快速冷凍細(xì)管凍精，進(jìn)行三步降溫（從4℃到-10℃降速為-5℃/min；從-10℃到-100℃降速為-40℃/min；從-100℃到-140℃的降速為-20℃/min），冷凍程序結(jié)束后，將細(xì)管凍精投入液氮保存。每批細(xì)管凍精均抽樣并在37℃水浴鍋中迅速解凍30 s，檢測(cè)精子解凍活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0 軟件中的單因素方差分析（One-Way ANOVA）以及Duncan's 多重比較對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析。當(dāng)P＜0.05 時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 東阿縣2016—2019 年各月份的平均氣溫 由表1可知，國(guó)家黑毛驢繁育中心所在的東阿縣6—8 月的平均高溫均超30℃，足以引起種公驢的熱應(yīng)激，而12 月至次年2 月的平均低溫持續(xù)在0.5℃以下，易造成種公驢的冷應(yīng)激。

2.2 采精季節(jié)對(duì)種公驢精液量的影響 如圖1 所示，種公驢精液采集量在春季與夏季達(dá)到最大值，平均射精量均超過(guò)56 mL，二者之間不存在顯著差異，但均顯著高于秋季和冬季的采精量。種公驢采精量在夏季后開始顯著下降并在冬季達(dá)到最低值，冬季平均射精量?jī)H為42.5 mL，顯著低于其他三季，與射精量最大的夏季相比，下降幅度超過(guò)25%。

圖1 不同季節(jié)種公驢總精液量的變化

2.3 采精季節(jié)對(duì)種公驢精子密度的影響 如圖2 所示，種公驢原精中精子密度在春季時(shí)最?。?.04×108/mL），且顯著低于其他季節(jié)；在秋季達(dá)到最大值（3.81×108/mL），顯著高于春、夏、冬3 個(gè)季節(jié)；另外，夏季和冬季采集精液中的精子密度介于春季與秋季之間，但二者之間差異不顯著。

圖2 不同季節(jié)種公驢精液中精子密度的變化

2.4 采精季節(jié)對(duì)種公驢精子活力的影響 如表2 所示，秋季原精活力最高，平均活力超過(guò)0.88，高于其他季節(jié)（P＜0.05），夏季種公驢原精活力最低。

而經(jīng)過(guò)冷凍再解凍后，種公驢精子凍后活力由春季的0.63 下降至夏季的0.57（P＜0.05）。與夏季相比，秋季精子凍后活力提升（P＜0.05），接近于春季水平，但進(jìn)入冬季后，種公驢精子的凍后活力再次急劇下降，僅為0.49，且低于其他各個(gè)季節(jié)（P＜0.05），與凍后活力最佳的春季相比，活力降低約22%。

2.5 采精季節(jié)對(duì)種公驢細(xì)管凍精成品率的影響 如圖3 所示，種公驢精子冷凍復(fù)蘇率在夏季時(shí)最低，僅為73.8%，顯著低于其他季節(jié)。而春、秋兩季，冷凍復(fù)蘇率均處在較高水平（超過(guò)78.7%），且二者之間無(wú)顯著差異。進(jìn)入冬季后，隨著氣溫降低，冷凍復(fù)蘇率再次下降，低于春季（P＜0.05）和秋季而高于夏季（P＜0.05）。

表1 東阿縣2016—2019 年各月份的平均氣溫 ℃

表2 不同季節(jié)對(duì)采集種公驢精子活力的影響

圖3 不同季節(jié)種公驢精子冷凍復(fù)蘇率的變化

3 討 論

季節(jié)變化對(duì)公畜繁殖性能的影響已在許多動(dòng)物上得到驗(yàn)證。眾多研究表明，炎熱季節(jié)造成的熱應(yīng)激對(duì)種公畜的繁殖機(jī)能產(chǎn)生巨大影響，嚴(yán)重影響公畜的精液品質(zhì)，降低種公畜的利用效率[9-10]。而另有研究證實(shí)，寒冷環(huán)境導(dǎo)致的冷應(yīng)激也會(huì)對(duì)精子的發(fā)生和活率產(chǎn)生干擾，從而影響公畜的繁殖性能[11-12]。本研究試圖描述出種公驢精液質(zhì)量的季節(jié)性變化，明確季節(jié)對(duì)公畜精液各項(xiàng)指標(biāo)的具體影響。

公驢的精子是由位于體表的陰囊內(nèi)的睪丸產(chǎn)生，該處皮膚較薄，容易受到外界環(huán)境干擾，若睪丸所處的環(huán)境溫度過(guò)高或過(guò)低，均會(huì)對(duì)精子的發(fā)生和機(jī)能產(chǎn)生不利影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，夏季高溫會(huì)導(dǎo)致公畜射精量增大，精子密度下降，但進(jìn)入冬季后，公畜總精液量急劇減少，精子密度卻達(dá)到最大，二者之間呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)[4,13]。Carluccio 等[14]研究表明，季節(jié)變化對(duì)公驢睪丸形態(tài)特征并無(wú)顯著影響，但與其他季節(jié)相比，冬季采精，會(huì)產(chǎn)生更多的精液，精液密度更小。在本研究中，德州種公驢的射精量和原精密度受季節(jié)性因素影響明顯，其在冬季射精量最小，夏季射精量最大，與春、秋季差異顯著，種公驢原精密度在秋季時(shí)最高，春季時(shí)最低，均與其他季節(jié)差異顯著。導(dǎo)致德州驢與上述研究結(jié)論差異的原因可能是由于不同品種對(duì)氣溫的適應(yīng)性存在差異。季節(jié)對(duì)種公畜射精量和精子密度的影響可能是由于夏季公畜副性腺分泌液增加導(dǎo)致精液量增加，而高溫影響睪丸的生精機(jī)能，導(dǎo)致原精密度下降[15]，進(jìn)入秋季后，氣溫適宜，睪丸恢復(fù)正常功能，射精量和精子密度趨于正常水平。

已有研究表明，相比于炎熱的夏季和寒冷的冬季，在氣溫適宜的3—5 月，種馬具有更好的原精活力、更高的頂體完整性和線粒體膜電位[9]。Bhakat 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，濕熱和干熱的季節(jié)公牛的原精活力均顯著低于涼爽的秋冬季節(jié)，推測(cè)是由于在高溫環(huán)境下，附睪內(nèi)精子的呼吸作用增強(qiáng)，大量消耗能量物質(zhì)，使精子受損，導(dǎo)致排出的精子活力大大降低。但在非洲驢上的研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)對(duì)于公驢的原精活力并不產(chǎn)生顯著影響，但其在秋冬季節(jié)擁有更低的平均路徑速度（Average path Velocity，VAP）和 曲線速度（Curvilinear Velocity，VCL）[14]。本試驗(yàn)結(jié)果與以上研究相似，種公驢在秋季原精活力最高，而在夏季，雖然原精活力降低，卻與春季、冬季無(wú)明顯差異，說(shuō)明溫度對(duì)公驢原精活力的影響有限。

大量研究表明，極限環(huán)境下，公畜的原精活力、凍精活力均顯著降低[3,16-17]。Wrench 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與非繁殖季節(jié)（9 月和12 月）相比，繁殖季節(jié)（3 月和6月）的種公馬凍后精子活力更高，推薦在北半球的3—6 月進(jìn)行馬精液的冷凍保存。謝莊等[19]測(cè)定結(jié)果表明，夏季生產(chǎn)的凍精解凍活力最低，而冬季的精液耐凍性能較好，解凍活力最高。而Murphy 等[5]研究證明，雖然冬季采集的公牛精子密度最低，但具有最佳的解凍活力，適宜進(jìn)行凍精生產(chǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，種公驢精子的凍后活力在夏季和冬季顯著低于其他季節(jié)，可能與這兩個(gè)季節(jié)極端的氣溫有關(guān)。而計(jì)算冷凍復(fù)蘇率發(fā)現(xiàn)，夏季凍精的復(fù)蘇率依然最低，但在冬季，雖然精子活力不佳，冷凍復(fù)蘇率卻顯著高于夏季，提示精子對(duì)于冷應(yīng)激的耐受度可能高于熱應(yīng)激。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激和冷應(yīng)激均對(duì)公驢的精液質(zhì)量產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響，春季和秋季是優(yōu)質(zhì)精液生產(chǎn)的最有利季節(jié)；冬季較高的冷凍復(fù)蘇率提示，采取相應(yīng)措施后，可在非繁殖季節(jié)采精以提高種公驢利用率。綜上所述，在高溫與嚴(yán)寒時(shí)節(jié)，對(duì)種公驢舍和采精室應(yīng)采取降溫和保溫措施，保證穩(wěn)定的精液質(zhì)量，提高種公驢配種效率，精液的利用率。