陳慧芳，楊鎂楹，吳志勝，張守全，白銀山*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528231；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

外泌體（Exosomes，EXs）是由細(xì)胞釋放的直徑在30～100 nm 的細(xì)胞外囊泡，攜帶大量的RNAs、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)，其中miRNA 的含量最豐富，是細(xì)胞間信息交流的主要分子[1]。細(xì)胞外囊泡除了EXs外，還包括膜微粒、微囊泡和凋亡小體，它們的直徑超過(guò)100 nm，有些可以達(dá)到2 μm，成為區(qū)別EXs 的主要標(biāo)志[2]。研究顯示，EXs 大量存在于卵泡液、精液、唾液、血漿、乳汁、汗液和尿液等體液中，廣泛參與動(dòng)物機(jī)體生命活動(dòng)和物質(zhì)代謝調(diào)控[3-4]。EXs 通過(guò)胞膜內(nèi)陷、融合的方式形成磷脂雙分子層膜包裹的囊泡體，膜上結(jié)合組織特異性蛋白，普遍包括跨膜蛋白超家族（CD9、CD63 和CD81 等）、熱休克蛋白家族、浮艦蛋白-1、葡萄糖新陳代謝酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、融合蛋白以及翻譯延伸因子等，這些蛋白成為了識(shí)別和鑒定EXs 的分子標(biāo)志[5-7]，EXs 通過(guò)與受體細(xì)胞黏附、融合和被內(nèi)吞等方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，完成物質(zhì)的運(yùn)輸[8]。

研究顯示卵泡液、附睪液和副性腺液內(nèi)中含有豐富的EXs，這些EXs 攜帶大量的miRNA 分子[10-13]，其中一些miRNA 的數(shù)量和種類(lèi)的改變會(huì)導(dǎo)致配子發(fā)育停滯、精卵受精障礙和各種生殖系統(tǒng)疾病產(chǎn)生，顯示了EXs攜帶的miRNA 在配子發(fā)育和生殖器官功能維持中的重要作用[14]。目前，不同物種生殖器官來(lái)源的EXs 的形態(tài)、大小、數(shù)量及更多潛在的生物學(xué)機(jī)制仍然不清楚[15-17]。本文將重點(diǎn)綜述卵泡液、附睪液和副性腺液內(nèi)中EXs的來(lái)源及其攜帶的miRNA 在卵母細(xì)胞發(fā)育、精子成熟和受精過(guò)程中的調(diào)控作用，為治療人類(lèi)不孕不育癥和提高畜禽繁殖力等方面的研究提供參考。

1 外泌體的研究歷史

早在1978 年，Ronquist 等[18]發(fā)現(xiàn)前列腺膜狀結(jié)構(gòu)的小囊泡，稱(chēng)為前列腺小體，是最早被檢測(cè)到與生殖相關(guān)的小囊泡；1980 年，Jones 等[19]和Davis[20]分別在豬和兔的精子膜上發(fā)現(xiàn)膜狀結(jié)構(gòu)的小囊泡，但在當(dāng)時(shí)卻被認(rèn)為是由于固定不當(dāng)引起的假象；1985 年，研究發(fā)現(xiàn)倉(cāng)鼠附睪頭部的精子膜表面附有30～100 nm 的小囊泡，并僅附于頂體區(qū)域，附睪尾精子頂體膜上的小囊泡數(shù)量卻顯著減少，當(dāng)時(shí)把這類(lèi)小囊泡定義為附睪小體[21]。隨后，在倉(cāng)鼠[22]、小鼠[23]、牛[24]、羊[25-26]和人類(lèi)[27]精子中均被證實(shí)存在附睪小體，并推斷附睪小體可以將生物調(diào)節(jié)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)骄禹旙w表面，與精子成熟加工有關(guān)[28]，后來(lái)在副性腺和雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)也鑒定出了大量小囊泡。1983 年，Johnstone 等[29]首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中，證實(shí)了納米級(jí)細(xì)胞外囊泡的存在，并命名為EXs；直到2007 年，Valadi 等[30]才鑒定出EXs 中富含生物活性調(diào)節(jié)物質(zhì)，其中miRNA 含量最豐富。miRNA 作為基因表達(dá)調(diào)控的重要分子，在生命活動(dòng)和生理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2 外泌體miRNA 在卵母細(xì)胞發(fā)育中的調(diào)控作用

在雌性動(dòng)物卵泡內(nèi)，卵泡液EXs 主要來(lái)源于顆粒細(xì)胞、壁細(xì)胞和卵母細(xì)胞，通過(guò)遞送分泌的蛋白質(zhì)和miRNA 等生物活性物質(zhì)，建立細(xì)胞間的聯(lián)系，構(gòu)成了卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞生存的微環(huán)境[31]，促使卵泡發(fā)育有規(guī)律的進(jìn)行和完成[32-34]。Machtinger 等[17]研究顯示，EXs 攜帶大量miRNA 介導(dǎo)關(guān)鍵基因和信號(hào)通路的調(diào)控，調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞增殖凋亡、激素合成、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和成熟等，促進(jìn)卵泡發(fā)育。

人類(lèi)卵泡液中EXs 攜帶的miR-99、miR-100、miR-218、miR-212、miR-214、miR-29a 和miR-132參與了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和成熟發(fā)育的調(diào)控過(guò)程[14]；與人血漿中EXs 攜帶的miRNA 相比，miR-218、miR-503 和miR-654-3p 在卵泡液中是特異性表達(dá)的，另外還有10 個(gè)miRNA 表達(dá)水平比較高，這些miRNA 對(duì)Wnt 通路、絲裂原活化蛋白激酶、表皮生長(zhǎng)因子受體和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路等進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)了卵母細(xì)胞發(fā)育[35]；在牛生長(zhǎng)期和成熟期卵泡液EXs 中均富含miR-654-5p、miR-640 和miR-373 3 個(gè)miRNAs，它 們?cè)诼涯讣?xì)胞成熟和物質(zhì)代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用[36-37]。卵泡液中miR-23a 通過(guò)抑制ERK1/2 信號(hào)通路，調(diào)控SIRT1蛋白表達(dá)，促使顆粒細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)卵泡閉鎖[38]；miR-143 可以調(diào)控大量的細(xì)胞周期基因，抑制顆粒細(xì)胞增殖和促進(jìn)卵泡閉鎖[39]；miR-320a 靶向顆粒細(xì)胞E2f1/Sf-1基因，抑制顆粒細(xì)胞增殖和雌二醇的產(chǎn)生，促進(jìn)孕酮的合成[40]；在體外培養(yǎng)山羊卵巢顆粒細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加山羊卵泡液EXs 時(shí)，能顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖[41]；卵泡液中EXs 攜帶miRNA 參與調(diào)控顆粒細(xì)胞類(lèi)固醇激素代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因，miR-17-5p 和miR-20a 可以調(diào)節(jié)DMRT1 表達(dá)水平、miR-138、miR-338 和miR-200a調(diào)節(jié)CYP17A2的表達(dá)水平及miR-456 和miR-138 調(diào)控AMH的表達(dá)水平，完成了顆粒細(xì)胞激素的生成和卵泡發(fā)育[42-43]。

EXs 攜帶的miRNA 表達(dá)水平與年齡也具有相關(guān)性[44]。研究發(fā)現(xiàn)老齡馬卵泡液中miR-181A、miR-375和miR-513a-3p 的表達(dá)水平明顯高于性成熟小馬，這些miRNA 被卵母細(xì)胞攝取后，可以抑制卵母細(xì)胞中TGF-β 信號(hào)通路，導(dǎo)致卵泡發(fā)育受阻[45]；對(duì)比38 歲以上和31 歲以下的女性卵泡液EXs 中miRNA 的表達(dá)水平，發(fā) 現(xiàn)miR-21-5p、miR-99b-3p、miR-134 和miR-190b 等4 個(gè)miRNA 表達(dá)存在顯著差異，它們涉及細(xì)胞外基質(zhì)受體表達(dá)調(diào)控、p53 信號(hào)通路等的調(diào)控、肝素硫酸鹽和碳水化合物的合成及代謝等促使卵泡提前發(fā)育和閉鎖[46]，這些研究均表明了雌生殖道內(nèi)的卵泡液中EXs 所攜帶的miRNA 在卵母細(xì)胞發(fā)育、代謝、顆粒細(xì)胞增殖和激素分泌等過(guò)程中的重要作用（表1）。

3 外泌體miRNA 對(duì)精子發(fā)育的調(diào)控作用

雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)中EXs 來(lái)源于睪丸、附睪和副性腺等多個(gè)組織，根據(jù)在生殖道內(nèi)的不同位置分別命名為附睪小體（Epididymosome）和前列腺小體（Prostasome）[6]。而精液中的EXs 主要來(lái)源于睪丸、附睪和副性腺器官分泌的液體混合物，即精漿外泌體（seminal plasma EXs，spEXs）。睪丸和附睪分泌的液體約占精液總體積的60%，前列腺分泌的液體約占30%，其他副性腺約占10%，這些EXs 攜帶的生物活性調(diào)節(jié)分子（研究最多的是miRNA）參與精子發(fā)生、修飾加工及受精能力的調(diào)控（圖1）。精子進(jìn)入附睪時(shí)不具備受精能力，經(jīng)歷附睪頭向附睪尾的運(yùn)輸過(guò)程，使精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特征發(fā)生一系列的改變，并逐步走向成熟，再經(jīng)過(guò)雌性動(dòng)物陰道、子宮及輸卵管后抵達(dá)受精部位，與卵母細(xì)胞相遇、穿過(guò)放射冠、透明帶和卵黃膜等，引發(fā)頂體反應(yīng)和卵黃膜反應(yīng)，最終受精完成[47]，在這個(gè)過(guò)程中精子也受到來(lái)自雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)EXs的大量修飾和調(diào)控，顯示了EXs 攜帶的miRNA 在這一系列過(guò)程中參與調(diào)控精子加工和受精的重要作用。

表1 雌生殖道內(nèi)的卵泡液外泌體miRNA

3.1 睪丸來(lái)源的外泌體miRNA 在精子發(fā)生中的調(diào)控作用 雄性生殖干細(xì)胞是位于曲細(xì)精管基底膜上具有維持自我更新和不斷產(chǎn)生精子過(guò)程的干細(xì)胞。支持細(xì)胞（Sertoli Cells，SCs）是生精小管內(nèi)的另外一類(lèi)細(xì)胞，參與生殖干細(xì)胞的自我更新和精子分化的調(diào)節(jié)，為精子發(fā)生提供物質(zhì)保障和結(jié)構(gòu)支持[48]。關(guān)于SCs 釋放EXs對(duì)精子發(fā)育調(diào)節(jié)的研究目前還并不清楚，精子發(fā)生的調(diào)控機(jī)制將進(jìn)一步研究完善和豐富。

3.2 附睪小體miRNA 在精子成熟發(fā)育中的調(diào)控作用附睪是精子運(yùn)輸、成熟和貯存的重要場(chǎng)所，由附睪頭、附睪體和附睪尾3 個(gè)部分組成[49]。附睪內(nèi)精子基因表達(dá)呈高度的區(qū)域化，表明精子在附睪內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程中不斷被加工和修飾，研究顯示附睪不同位置細(xì)胞分泌的EXs攜帶miRNA 數(shù)量和種類(lèi)存在很大差異[50]。牛附睪小體測(cè)序中，發(fā)現(xiàn)附睪液EXs 中的miR-143、miR-214、miR-145，miR-202 和miR-199 等分布在附睪頭部；miR-1224、miR-395 和miR-654 多分布于尾部，miR-18a、miR-1826、miR-662 和miR-3936 分布于附睪體；而miR-449 在附睪頭和附睪尾部均高水平表達(dá)，這些附睪小體攜帶miRNA促進(jìn)了精子的代謝和活力的維持[51]。小鼠附睪小體測(cè)序中，檢測(cè)到附睪液EXs 中含有358個(gè)miRNA，其中miR-10b-5p、miR-10a-5p、miR-143-3p、miR-141-3p 和miR-30a-5p 在附睪中特異性表達(dá)，涉及建立精子表觀(guān)遺傳學(xué)修飾，miR-375、miR-467a、miR-467d 和miR-467e 分布于附睪頭部；發(fā)現(xiàn)miR-34b、miR-34c、miR-139 和miR-196 分布于附睪尾部，而miR-34c 和miR-467e 主要分布于附睪尾和附睪頭部，涉及精子活力和代謝調(diào)控[52]。在人類(lèi)和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物附睪中特異表達(dá)的miR-888 簇均分布在附睪頭和附睪尾部[53]，涉及調(diào)節(jié)精子成熟和精子運(yùn)動(dòng)的能力[52]。也有研究發(fā)現(xiàn)附睪小體中miR-26a-5p 和let-7g-5p 等具有抗凋亡作用，與精子活力調(diào)控密切相關(guān)[54]，這些附睪小體中miRNA 具體的功能還有待進(jìn)一步闡釋?zhuān)壳暗难芯匡@示了附睪小體內(nèi)所含miRNA 可以廣泛參與調(diào)控精子成熟和精子的運(yùn)動(dòng)能力等。此外，附睪小體攜帶的巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）和多元醇途徑中的醛糖還原酶等進(jìn)入精子后，MIF 與外致密纖維進(jìn)行結(jié)合，參與鋅鰲合及二硫鍵的形成；多元醇途徑中的醛糖還原酶則通過(guò)介導(dǎo)精子糖脂類(lèi)能量物質(zhì)代謝來(lái)促進(jìn)精子活力的維持[4]。成熟精子內(nèi)基因組高度甲基化，基因的轉(zhuǎn)錄數(shù)量顯著減少，顯示附睪小體攜帶大量的miRNA，是否均能被精子攝入、是否能夠在精子體內(nèi)結(jié)合到功能基因而發(fā)揮調(diào)控作用等問(wèn)題仍未獲知，這些攝入的miRNA 是否可以在精子體內(nèi)積累，并通過(guò)EXs 方式釋放，并且在受精過(guò)程中發(fā)揮作用等還有待進(jìn)一步研究。

3.3 副性腺來(lái)源的EXs 的miRNA 在精子代謝中的調(diào)控作用 副性腺分泌的液體是組成精液的一部分，主要包括前列腺、精囊腺和尿道球腺分泌的液體，其中前列腺分泌的液體比較多，所以其中含有調(diào)控性EXs 所占比例也較高，是組成spEXs 的一部分。目前，副性腺EXs 主要集中在前列腺的研究中，可能是因?yàn)槟虻狼蛳俸途蚁俚确置诘囊后w較少，制約了EXs 的檢測(cè)與分析，隨著EXs 檢測(cè)技術(shù)的提高，未來(lái)可能會(huì)有更多的研究發(fā)現(xiàn)（圖1）。前列腺小體對(duì)精子活力的維持和物質(zhì)代謝調(diào)控也是不可或缺的。研究顯示miR-34c-5p、miR-122、miR-513a-5p 和miR-509-5p 在前列腺小體中高水平表達(dá)，具有促進(jìn)精子成熟、防止過(guò)早獲能等重要作用[55]；前列腺小體中除了攜帶大量的miRNA，還攜帶一些重要的調(diào)節(jié)性蛋白和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[55]，可以促使精子膜受體處于開(kāi)放狀態(tài)，增加Ca2+的內(nèi)流[56]；對(duì)副性腺來(lái)源的EXs 攜帶的其他生物活性物質(zhì)是否還具有更多的潛在功能還有待進(jìn)一步解析。

3.4 精漿外泌體miRNA 在精子發(fā)育中的調(diào)控作用 精液組成的成分可以有效防止精子過(guò)早發(fā)生頂體反應(yīng)，保護(hù)精子抗氧化損傷和精子質(zhì)膜的完整性以及免受雌性免疫系統(tǒng)的侵襲等，其中spEXs 也發(fā)揮著重要作用。

Du 等[57]報(bào)道豬spEXs 對(duì)維持精子活力、精子膜完整性、抗氧化能力和抑制不成熟精子獲能等具有重要的調(diào)控作用；與原精液相比，添加EXs 稀釋劑提高了精子抗氧化能力，降低了丙二醛含量，延長(zhǎng)了體外保存精子的時(shí)間[58]。也有研究顯示spEXs 介導(dǎo)精子多肽磷酸化的降解，可以抑制依賴(lài)性獲能的膽固醇外流，調(diào)控精子受精能力[59]，在性別可反轉(zhuǎn)的半滑舌鰨魚(yú)spEXs測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)dre-miR-141-3p、dre-miR-10d-5p、ssamiR-27b-3p 和ssa-miR-23a-3p 4 個(gè)miRNA 表達(dá)水平與雌雄發(fā)育有關(guān)[60]。此外，研究證明spEXs 可以遞送調(diào)節(jié)蛋白（如富含半胱氨酸的分泌蛋白1）到精子膜表面，保護(hù)精子[61]。spEXs 來(lái)源于附睪和睪丸的數(shù)量最多，其中miRNA 的研究數(shù)據(jù)還很少，因?yàn)榫踊虮磉_(dá)數(shù)量很少，miRNA 是否能夠參與精子基因表達(dá)調(diào)控還并不清楚[62]，對(duì)于畜牧業(yè)大生產(chǎn)上采用稀釋精液和深度輸精的方式是否可有效避免spEXs 稀釋而造成受精過(guò)程的影響等，還缺乏相關(guān)證據(jù)。spEXs 是否能夠參與調(diào)控雌性生殖道細(xì)胞，促進(jìn)精子獲能和保護(hù)精子等并不清楚，目前spEXs 攜帶miRNA 的研究主要集中在改善人的生殖能力或治療精子病理學(xué)等相關(guān)的研究。

4 外泌體miRNA 對(duì)精子受精的調(diào)控作用

精子受精過(guò)程是一個(gè)極其復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，包括在雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)EXs 的調(diào)控作用，如陰道小體（Vaginosome）、子宮小體（Uterosome）和輸卵管小體（Oviductosome）等，實(shí)現(xiàn)了對(duì)精子不同程度的加工和修飾，也保護(hù)了精子免受傷害，獲得受精能力[62-63]。很多動(dòng)物精子儲(chǔ)存在雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)，生殖道細(xì)胞來(lái)源的EXs 在精子受精能力維持中發(fā)揮了重要作用[47]。Griffiths 等[59]研究發(fā)現(xiàn)，子宮小體攜帶精子受精必需的跨膜蛋白和糖基磷脂酰肌醇連接蛋白（SPAM1），增強(qiáng)精子穿越卵丘細(xì)胞的能力。輸卵管小體攜帶透明帶相關(guān)的特異性糖蛋白質(zhì)膜Ca2+-ATP 酶4（PMCA4）到精子表面，增加對(duì)抗透明帶水解的能力，硬化透明帶，減少多精子受精，提高精子活力和防止精子過(guò)早獲能[64]。這些證據(jù)顯示了雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)EXs 參與調(diào)控精子受精能力的作用，目前相關(guān)研究還缺乏EXs miRNA 的數(shù)據(jù)。

5 外泌體miRNA 與生殖性疾病

生殖器官細(xì)胞EXs 攜帶的miRNA 異常表達(dá)會(huì)引起嚴(yán)重的生殖系統(tǒng)疾病[40,55]（圖2）。多囊卵巢綜合征（PCOS）患者卵泡液中存在6 種差異性表達(dá)的miRNA，其中高表達(dá)的miR-199 抑制CYP19A1的表達(dá)[65]，促進(jìn)了POCS 的發(fā)生發(fā)展；還有研究顯示POCS 患者卵泡液中的miR-125b/19b/222[31]、miR-1293/551a[66]和miR-16-5p/15b/486-5p/4646-5 等上調(diào)表達(dá)，miR-24-3p/29a/151-3p 等下調(diào)表達(dá)[67]；此外，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-16-5p/15b/486-5p/4646-5p 表達(dá)異常[39]會(huì)引起排卵障礙。

在男性生殖系統(tǒng)疾?。o(wú)精子癥[68]、弱精子癥[68-69]、少精子癥[69]、非阻塞無(wú)精子癥[70-71]和精索靜脈曲張不育癥[72]）患者中，也伴隨spEXs 的miRNA 表達(dá)異常的現(xiàn)象（圖2），但這些miRNA 的相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究還很少，主要集中在測(cè)序階段的弱精子癥患者中，精漿miR-101-3p/let-7b-5p 表達(dá)水平降低，而過(guò)表達(dá)miR-151a-5p 靶向Cytb生產(chǎn)，減少精子細(xì)胞的呼吸和ATP水平，降低精子活力[67,69]；精索靜脈曲張患者精漿中miR-122/181a/34c-5p 表達(dá)水平顯著降低，涉及參與精子活力、形態(tài)、精液谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）、精液凋亡標(biāo)記物BCL2 等的調(diào)控[72]，這些研究揭示了生殖系統(tǒng)疾病miRNA 的異常表達(dá)，其中潛在機(jī)制還并沒(méi)有解析清楚，深入研究生物活性調(diào)節(jié)分子miRNA 介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制和調(diào)控作用，有望成為疾病診斷和治療的靶標(biāo)。

6 展 望

EXs 已成為生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，參與配子發(fā)育和受精過(guò)程的調(diào)控，完善和豐富了生殖生理的調(diào)控機(jī)制，但許多EXs 相關(guān)的功能還并不清楚，需要進(jìn)一步研究。在人類(lèi)生殖系統(tǒng)疾病中顯示EXs 攜帶的miRNA 存在表達(dá)異常，這些miRNA 可能成為治療靶點(diǎn)和分子診斷標(biāo)記，具有潛在的應(yīng)用前景。此外，建立標(biāo)志性的EXs miRNA 與畜禽繁殖力相關(guān)聯(lián)，在提高畜禽繁殖力方面有著重要的臨床意義，生殖系統(tǒng)EXs 研究將成為人類(lèi)生殖醫(yī)學(xué)研究和家畜繁殖育種及篩選的新方向。