廖豪峰?龐夢(mèng)雅?張政?葛緬

【摘要】 目的 探討p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（PUMA）是否參與調(diào)節(jié)高脂飲食（HFD）所致糖尿病小鼠脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性腎損傷。方法 將24只小鼠隨機(jī)均分為普食（Chow）組與HFD組，分別以普通飼料或者高脂飲食喂養(yǎng)12周，飲食干預(yù)結(jié)束后分別再分為L(zhǎng)PS組與Con組，LPS組小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg制備膿毒癥急性腎損傷模型，Con組給予等體積磷酸鹽緩沖液腹腔注射，24 h后檢測(cè)小鼠腎病理損傷、血清肌酐、血尿素氮、PUMA蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)水平以及腎臟凋亡情況。結(jié)果 與Chow組相比，HFD組小鼠體質(zhì)量增加、隨機(jī)血糖升高（P均< 0.05），產(chǎn)生胰島素抵抗。與Con組相比，LPS組血清肌酐和血尿素氮升高（P均< 0.05），出現(xiàn)腎上皮細(xì)胞形態(tài)異常、上皮細(xì)胞壞死和炎癥浸潤(rùn)等病理損傷，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)染色顯示腎組織出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，PUMA蛋白水平及Caspase-3蛋白表達(dá)增高（P均< 0.05）。與Chow+LPS組相比，HFD+LPS組上述表現(xiàn)更為明顯（P均< 0.05）。結(jié)論 HFD通過上調(diào)PUMA表達(dá)，促進(jìn)了LPS誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷以及凋亡。

【關(guān)鍵詞】 p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子;高脂飲食;糖尿病;脂多糖;急性腎損傷

Effect of PUMA on LPS-induced acute kidney injury and apoptosis in high-fat diet-fed mice Liao Haofeng， Pang Mengya， Zhang Zheng， Ge Mian. Department of Anesthesiology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Ge Mian， E-mail： gemiansums@ 163. com

【Abstract】 Objective To investigate whether p53 upregulated modulator of apoptosis （PUMA） participates in regulating the acute kidney injury induced by lipopolysaccharide （LPS） in high-fat diet （HFD）-fed mice. Methods Twenty-four mice were randomly divided into the Chow and HFD groups， and fed with regular chow or HFD for 12 weeks， respectively. Subsequently， the animals were further divided into the control and LPS groups. Mice in the LPS group were injected with LPS 10 mg/kg intraperitoneally to establish the mouse models of acute kidney injury， whereas an equivalent amount of PBS was administered in the control group. The expression levels of serum creatinine， urea nitrogen， PUMA protein and Caspase-3 protein were detected and the pathological kidney injury and apoptosis were observed 24 h later. Results Compared with the Chow group， mice in the HFD group had significantly higher body weight （P < 0.05）， elevated random blood glucose （P < 0.05） and insulin resistance. Compared with the control group， the serum levels of creatinine and urea nitrogen of mice in the LPS group were significantly increased （both P < 0.05）， and presented with obvious pathological damages， such as morphological abnormality of renal epithelial cells， epithelial cell necrosis and inflammatory infiltration. Meanwhile， in situ terminal deoxynucleotidyl transferase revealed a large quantity of apoptotic cells and higher PUMA protein and Caspase-3 protein levels were observed in the renal tissues of mice in the LPS group （both P < 0.05）. Compared with the Chow+LPS group， the findings above in the HFD + LPS group were more pronounced （all P < 0.05）. Conclusion HFD can aggravate LPS-induced acute kidney injury and apoptosis probably by up-regulating the expression level of PUMA.

【Key words】 p53 upregulated modulator of apoptosis（PUMA）;High-fat diet;Diabetes mellitus;

Lipopolysaccharide;Acute kidney injury

近年來，由于超重和肥胖率的上升以及體育活動(dòng)的減少，我國(guó)的2型糖尿病發(fā)病率迅速上升，已經(jīng)成為公共衛(wèi)生的主要挑戰(zhàn)[1-2]。多項(xiàng)研究表明，肥胖以及2型糖尿病患者在臨床及圍術(shù)期中發(fā)生感染性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)更高，這可能導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生率增高以及ICU膿毒癥相關(guān)患者的病死率增加[3-5]。膿毒癥是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[6]。腎臟是膿毒癥發(fā)展過程中最容易受損的器官[4-5， 7]。膿毒癥相關(guān)急性腎損傷（S-AKI）在ICU較為常見，同時(shí)AKI會(huì)導(dǎo)致膿毒癥患者病死率增高。與ICU其他損傷相比，S-AKI病死率更高[8-9]。此外，有研究表明糖尿病是術(shù)后感染、S-AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10-11]。因此，關(guān)注糖尿病患者的S-AKI成為急需解決的臨床問題，然而目前研究并不多。

既往研究顯示，多種因素參與了S-AKI的發(fā)病機(jī)制，比如炎癥損傷、氧化應(yīng)激、凋亡等，其中凋亡被證明起了重要作用[12-13]。p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（PUMA）是近年發(fā)現(xiàn)的一種具有促凋亡作用的p53靶基因，既往研究發(fā)現(xiàn)其與缺血再灌注、腫瘤及膿毒血癥等病理生理過程有密切聯(lián)系[14-15]。然而PUMA與2型糖尿病關(guān)系研究較少，其是否參與糖尿病患者S-AKI的發(fā)生發(fā)展目前仍未清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在探討PUMA誘導(dǎo)的凋亡與糖尿病膿毒癥小鼠AKI的聯(lián)系，從而進(jìn)一步尋找糖尿病患者S-AKI的防治方法。

材料與方法

一、材 料

24只6～8周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心，體質(zhì)量19 ～ 23 g，飼養(yǎng)于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)期間保持動(dòng)物房室溫25℃、相對(duì)濕度60%及12 h人工日光燈管照射，小鼠自由飲水和進(jìn)食。普通飼料及高脂飼料分別購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心及美國(guó)Research Diets公司，Optium Xceed 血糖儀購(gòu)自美國(guó)Abbott Diabetes Care公司，4%甲醛緩沖溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，蘇木素染色液及伊紅染液購(gòu)自武漢塞維爾公司，蛋白酶抑制劑、乙二胺四乙酸、RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó) Thermo Scientific 公司，PUMA及Caspase-3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司，DAB顯色劑購(gòu)自丹麥DAKO公司。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：IACUC-F3-161002）。

二、方 法

1. 模型制備與造模

待小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，采用隨機(jī)數(shù)表法分成普食（Chow）組和高脂飲食（HFD）組，每組各12只小鼠，分別給予普通嚙齒動(dòng)物飼料（熱量百分比為：70%碳水化合物、10%脂肪、20%蛋白質(zhì)）和高脂肪飼料（熱量百分比為：20%碳水化合物、60%脂肪、20%蛋白質(zhì)）喂養(yǎng)。每2周評(píng)估體質(zhì)量和每日食物攝入量，飲食干預(yù)12周后進(jìn)行OGTT和胰島素耐受性試驗(yàn)（IPITT），利用GraphPad Prism 8軟件計(jì)算OGTT及IPITT曲線的曲線下面積（AUC）。飲食干預(yù)結(jié)束后，分別再分為對(duì)照組（Con組）和LPS干預(yù)組（LPS組）。LPS組給予LPS 10 mg/kg腹腔注射制備小鼠S-AKI模型，Con組給予等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）腹腔注射。注射后24 h給予安樂死，通過眼球取血和收集腎組織標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

2. HE染色

取小鼠新鮮腎臟組織去除包膜，長(zhǎng)軸方向?qū)η?。?jīng)4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋切片。常規(guī)行HE染色，放大200倍，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

3. 蛋白免疫印跡法

取腎臟組織30 mg于200 μl預(yù)冷含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg樣品蛋白于10%分離膠和5%濃縮膠行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶200兔抗PUMA或者Caspase-3抗體4℃過夜孵育。次日TBS、TBST交替洗膜后加入1∶10 000 紅外熒光染料標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。TBS、TBST 交替洗膜，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)曝光，Image-Pro Plus軟件灰度分析，用目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

4. TUNEL檢測(cè)及凋亡指數(shù)計(jì)算

取石蠟包埋的小鼠腎組織切片，根據(jù)Roche公司的TACS TdT原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)腎臟組織凋亡細(xì)胞，DAB顯色后細(xì)胞核呈棕褐色為陽性反應(yīng)。每張切片隨機(jī)選取20個(gè)視野（放大400倍），于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像計(jì)數(shù)，利用Image J軟件定量陽性標(biāo)記的細(xì)胞;計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)和腎臟細(xì)胞總數(shù)，凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/腎臟細(xì)胞總數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0分析所有數(shù)據(jù)。使用Kolmogorov- Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，Levene檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)方差齊性。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，2組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量資料使用重復(fù)測(cè)量方差分析分析交互效應(yīng)、主效應(yīng)或單獨(dú)效應(yīng);析因設(shè)計(jì)資料使用析因設(shè)計(jì)方差分析。α= 0.05。

結(jié) 果

一、12周HFD飲食對(duì)小鼠體質(zhì)量、血糖和胰島素的影響

1. 12周HFD飲食對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

小鼠平均體質(zhì)量變化曲線提示飲食干預(yù)與時(shí)間之間存在交互作用（F = 102.885，P < 0.001）。與Chow組小鼠相比，HFD組的小鼠在飲食干預(yù)2周開始出現(xiàn)體質(zhì)量增加（t2周 = 6.275，P < 0.001;t4周= 10.200，P < 0.001;t6周 = 12.560，P < 0.001;t8周 = 9.846，P < 0.001;t10周 = 19.830，P < 0.001;t12周 = 18.370，P < 0.001），該現(xiàn)象這一直持續(xù)到12周，見圖1A。各組小鼠平均每日食物攝入量在組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 1.304，P = 0.217），見圖1B。

2. 12周HFD對(duì)小鼠血糖和胰島素的影響

OGTT與時(shí)間效應(yīng)之間不存在交互作用（F = 0.803，P = 0.552）;時(shí)間主效應(yīng)（F = 57.831，P < 0.001）和處理主效應(yīng)（F = 28.829，P < 0.001）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HFD組小鼠在測(cè)試的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖水平均高于Chow組，同時(shí)AUC升高[（2714±378）mm2 vs.（1844±210）mm2，t = 5.319，P = 0.002）]，表明HFD飲食干預(yù)后小鼠的葡萄糖耐受性變差，見圖2A、B。此外，IPITT與時(shí)間之間不存在交互作用（F = 1.060，P = 0.386）;時(shí)間主效應(yīng)（F = 19.690，P < 0.001）和處理主效應(yīng)（F = 47.536， P < 0.001）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; HFD組小鼠在測(cè)試的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖水平均高于Chow組， HFD組小鼠AUC也較Chow組增加[（1193±94）mm2 vs.（823±122）mm2，t = 6.335，P < 0.001]，表明HFD飲食干預(yù)后小鼠對(duì)胰島素治療的反應(yīng)性變差，見圖2C、D。上述數(shù)據(jù)表明HFD組小鼠符合2型糖尿病的特征。

二、HFD對(duì)LPS導(dǎo)致AKI的影響

HE染色顯示，Chow+Con組小鼠腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)正常;HFD+Con組可見腎小管區(qū)域空泡，腎小球囊腔擴(kuò)大;經(jīng)LPS腹腔注射的Chow+LPS組與HFD+LPS組小鼠可見腎上皮細(xì)胞變平失去正常形態(tài)，上皮細(xì)胞壞死和炎癥浸潤(rùn)，部分腎上皮細(xì)胞核染色部分甚至完全缺失，同時(shí)腎小管腔出現(xiàn)中重度膨脹。其中，HFD飲食干預(yù)組小鼠腎病理損傷更為明顯，見圖3A。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表明，飲食因素與LPS處理間的交互作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（血清肌酐F = 1.534，P = 0.244;血尿素氮F = 3.038，P = 0.112）;與各自對(duì)照組相比，LPS干預(yù)后的小鼠血清肌酐和血尿素氮均升高（LPS因素的主效應(yīng)檢驗(yàn)P均< 0.001）。HFD+LPS組血清肌酐和血尿素氮均高于Chow+LPS組（血清肌酐t = 5.430，P = 0.006;血尿素氮t = 4.881，P = 0.003），見圖3B、C。上述提示LPS對(duì)于小鼠腎組織結(jié)構(gòu)及腎功能有不同程度的損傷，在HFD組損傷表現(xiàn)得更為明顯。

三、HFD對(duì)LPS干預(yù)后腎組織PUMA蛋白水平的影響

使用蛋白免疫印跡法研究了不同組小鼠間PUMA表達(dá)水平存在差異。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表明，飲食因素與LPS處理間的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 7.594，P = 0.025），與對(duì)照組相比，LPS干預(yù)后的小鼠腎臟PUMA蛋白表達(dá)均升高（飲食因素固定時(shí)，LPS單獨(dú)效應(yīng)P < 0.001）;而與Chow+LPS組相比，HFD會(huì)明顯加劇LPS導(dǎo)致的PUMA蛋白水平增加（LPS干預(yù)時(shí)，HFD的單獨(dú)效應(yīng)P < 0.001），見圖4。

四、HFD加劇LPS導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡

TUNEL染色顯示，Chow組小鼠腎臟組織未見細(xì)胞凋亡;而LPS處理后小鼠腎組織尤其是腎小管部分可見大量凋亡細(xì)胞。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表明，飲食因素與LPS處理間的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 19.779，P < 0.001）并且HFD+LPS組小鼠較Chow+LPS 組凋亡細(xì)胞數(shù)量增加（HFD的單獨(dú)效應(yīng)P < 0.001），見圖5。

五、HFD加劇LPS導(dǎo)致的腎組織Caspase-3蛋白水平增加

析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表明，飲食因素與LPS處理間的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 13.644，P = 0.006）。與Chow+Con組相比，LPS干預(yù)后的Chow+LPS組小鼠腎組織Caspase-3表達(dá)水平升高（LPS的單獨(dú)效應(yīng)P < 0.001）;與Chow+LPS組相比，HFD+LPS組小鼠腎組織Caspase-3表達(dá)水平亦升高（HFD的單獨(dú)效應(yīng)P < 0.001），見圖6。

討 論

肥胖與糖尿病的預(yù)防和管理將成為我國(guó)面臨的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，二者關(guān)系密切并且會(huì)增加患者圍術(shù)期感染性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)以及病死率。本研究通過HFD喂養(yǎng)C57BL/6J雄性小鼠構(gòu)建2型糖尿病模型，隨后給予LPS干預(yù)誘導(dǎo)S-AK，初步探討HFD對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠S-AKI的影響[16-18]。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS干預(yù)的小鼠均表現(xiàn)出AKI癥狀，而HFD喂養(yǎng)的小鼠腎組織損傷比普通飼料喂養(yǎng)的小鼠更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為腎臟結(jié)構(gòu)破壞、血清肌酐和血尿素氮升高，同時(shí)腎小管及其他腎組織細(xì)胞凋亡數(shù)量增多、PUMA和Caspase-3表達(dá)升高。

目前肥胖與糖尿病已成為我國(guó)的重要衛(wèi)生問題。一項(xiàng)全國(guó)調(diào)查表明，2010年中國(guó)20 ～ 59歲成年人的超重（23.0 kg/m2≤ BMI < 27.5 kg/m2）患病率高達(dá)40.7%，而2014年肥胖（BMI ≥27.5 kg/m2）患病率為12.9%[19]。另一項(xiàng)于2015至2017年由滕衛(wèi)平教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行的全國(guó)性橫斷面研究顯示，中國(guó)成年居民的糖尿病患病率為12.8%，糖尿病前期患病率高達(dá)35.2%[1]。飲食引起的肥胖正是代謝并發(fā)癥（如胰島素抵抗、2型糖尿病和心血管疾?。┑闹饕ｋU(xiǎn)因素[20]。此外，研究表明肥胖和2型糖尿病不僅會(huì)增加患者感染的風(fēng)險(xiǎn)，還是S-AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但目前的治療手段仍非常有限[3-5]。高脂喂養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致小鼠肥胖，由于胰島的補(bǔ)償不足，進(jìn)一步導(dǎo)致高胰島素血癥和葡萄糖穩(wěn)態(tài)改變[16]。因此，該模型被認(rèn)為能準(zhǔn)確地模擬人類生理狀態(tài)[21]。本研究顯示，12周HFD喂養(yǎng)的小鼠體質(zhì)量較普通飼料喂養(yǎng)小鼠增長(zhǎng)更快且胰島素耐量、葡萄糖耐量降低，表明在C57BL/6小鼠上成功構(gòu)建了HFD誘導(dǎo)的糖尿病模型并可將其作為合適的模型進(jìn)行研究。

LPS作為革蘭陰性細(xì)菌的外膜成分，是敗血癥的主要刺激因子，可通過刺激細(xì)胞釋放大量的炎癥細(xì)胞因子和自由基誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[22]。在S-AKI 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[23]。腎臟是由LPS引起膿毒癥中最脆弱的靶器官之一，高達(dá)60%的膿毒癥患者患有AKI[7]。同時(shí)Hsu等[11]證實(shí)糖尿病是S-AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。既往研究表明，腎功能迅速下降為AKI臨床特征，包括腎小球?yàn)V過率下降、尿量減少以及血清肌酐水平升高等[24]。本研究結(jié)果與其一致，LPS干預(yù)后小鼠的血清肌酐和血尿素氮水平明顯升高，腎病理損傷加重，而且HFD喂養(yǎng)小鼠腎損傷更為明顯，證明2型糖尿病會(huì)加重S-AKI。

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（收稿日期：2020-06-20）

（本文編輯：林燕薇）