梁藝馨，李潔，劉康書，蔡秋，朱明，戴唯，王緬，王興寧

（貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州貴陽 550081）

有機(jī)錫化合物用途十分廣泛，常用作聚乙烯薄膜的穩(wěn)定劑、室溫硫化過程的催化劑和船底的防污劑等[1]。有機(jī)錫類化合物因其高效、持效期長的特點(diǎn)作為殺菌和殺螨農(nóng)藥也廣泛用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，目前有機(jī)錫類農(nóng)藥主要有三唑錫、三環(huán)錫、薯瘟錫（三苯基乙酸錫）、毒菌錫（三苯基氫氧化錫）和苯丁錫等，例如三唑錫可用以柑桔的殺螨劑，防治全爪螨等，薯瘟錫可用于防治馬鈴薯的晚疫病，提升產(chǎn)量，苯丁錫用于防治山楂、桃、蘋果等水果蔬菜種植過程中的各種植食性螨類害蟲。同時，有機(jī)錫類化農(nóng)藥也會對生物體造成損害，屬劇烈神經(jīng)毒物，會導(dǎo)致中樞系統(tǒng)腦白質(zhì)水腫，使細(xì)胞能量利用中氧化磷酸過程受障，對胸腺和淋巴系統(tǒng)進(jìn)行影響，甚至還會引起糖尿病和高血脂等疾病[2]。若經(jīng)由呼吸道、消化道和皮膚黏膜進(jìn)入人體內(nèi)，還會誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，減弱機(jī)體對抗腫瘤和抗病毒感染[3]。鑒于有機(jī)錫類農(nóng)藥對人體和環(huán)境造成的不良影響，國內(nèi)外相關(guān)部門已對其殘留量做出限制甚至禁用，我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2019中對水果和蔬菜中有機(jī)錫類化合物殘留量有明確規(guī)定，其中三唑錫限量范圍為0.1～2 mg/kg，三環(huán)錫0.1～0.3 mg/kg，薯瘟錫（三苯基乙酸錫）0.1～5 mg/kg，毒菌錫（三苯基氫氧化錫）0.1 mg/kg，苯丁錫0.5～10 mg/kg。國際方面，以日本為例，食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表規(guī)定，三苯錫在食物中的最大殘留限量為 0.02～0.2 mg/kg，苯丁錫限量0.05～20 mg/kg；歐盟農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，薯瘟錫和毒菌錫最大殘留量為0.1 mg/kg。

目前國內(nèi)外有關(guān)食品中有機(jī)錫類化合物的分析方法較多，常用的檢測方法主要有液相色譜法[4-6]、氣相色譜法[7-10]、液相色譜-質(zhì)譜法[11-14]及氣相色譜-質(zhì)譜法[15-17]等。相較于液相色譜法和氣相色譜法，液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，目前也是較為廣泛使用的檢測方法，但測定有機(jī)錫類化合物時，能與液相色譜聯(lián)用的靈敏檢測器相對較少，不能有效克服因霧化引起的稀釋效應(yīng)從而使信號下降，而氣相色-譜質(zhì)譜法具有很好的靈敏度，且能分析多種有機(jī)錫形態(tài)，選擇性較好。與氣相色譜-單四極桿質(zhì)譜法（GC-MS）相比，對于基質(zhì)相對復(fù)雜的食品，氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法具有更好的抗干擾性。目前有很多研究均采用外標(biāo)法檢測有機(jī)錫類化合物，但尚未見到使用內(nèi)標(biāo)法測定食品中有機(jī)錫類農(nóng)藥殘留的文章，由于內(nèi)標(biāo)物與被測組分的峰面積比值不受進(jìn)樣量波動的影響，使用同位素內(nèi)標(biāo)法測定能在一定程度上消除了前處理方法所引起的誤差及基質(zhì)效應(yīng)，因此結(jié)果更為準(zhǔn)確。本文以四乙基硼化鈉作為衍生試劑，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法測定果蔬食品中三環(huán)錫、薯瘟錫、苯丁錫等有機(jī)錫類農(nóng)藥的殘留。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

7890B/7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；Allegra X-30R高速離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；Turbo Vap LV氮吹儀，美國Biotage公司；230Volt振蕩器，美國Talboys公司；Milli-Q去離子發(fā)生器，美國Millipore公司；PB1502-L電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：三環(huán)錫（純度98%）、薯瘟錫（純度98%），購自德國 Dr.Ehrenstorfer公司，苯丁錫標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL，純度≥97%），購自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，三苯基錫-d15（純度 98.1%），購自加拿大 C/D/N Isotopes公司。

正己烷、丙酮（色譜純），德國CNW公司；乙腈（色譜純），德國默克公司；四乙基硼化鈉（NaBEt4，純度98%），美國Stem chemicals公司；甲醇（色譜純），德國默克公司；冰醋酸（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PC/NH2-SPE固相萃取柱（1000 mg/6 mL），天津博納艾杰爾科技有限公司；無水硫酸鈉（農(nóng)殘級），北京百靈威科技有限公司；氯化鈉（農(nóng)殘級），成都西亞化工股份有限公司。

雪桃、油桃、柑桔、茄子、洋蔥等樣品購于市面。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取三環(huán)錫、薯瘟錫有機(jī)錫類標(biāo)準(zhǔn)品各0.1000 g，用丙酮溶解并定容至100 mL容量瓶，即配制成1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；量?.0 mL苯丁錫標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用丙酮稀釋并定容至10 mL容量瓶中，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取0.1000 g三苯基錫-d15于100 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)工作液：取1.0 mL三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用丙酮稀釋成1.0 mg/L備用。

基質(zhì)混合-三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)校正溶液：用丙酮稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入到1.0 mL樣品空白基質(zhì)提取液中，使系列標(biāo)準(zhǔn)校正液濃度分別為 50、100、200、500、1000 μg/L（含三苯基錫-d15500 μg/L）。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

稱取5 g（精確到0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入500 μL濃度為1.0 mg/L三苯基錫-d15內(nèi)標(biāo)溶液，加入15 mL冰醋酸-乙腈（1:99，V/V），均質(zhì)提取2 min，加入5 g氯化鈉，振蕩30 min，5000 r/min離心5 min，取上清液于試管中，再加入15 mL冰醋酸-乙腈（1:99，V/V），重復(fù)上述操作，合并提取液，于35 ℃水浴中減壓濃縮至近干。加入1 mL甲醇溶解殘留物，氮?dú)獯抵? mL，轉(zhuǎn)移至15 mL試管中待衍生。

1.3.2 衍生

向上述提取液中加入 5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）及1 mL四乙基硼化鈉溶液（2 g/100 mL），手動搖勻后旋渦器振振蕩衍生反應(yīng)25 min，加入2 mL正己烷提取衍生產(chǎn)物，混勻，5000 r/min離心5 min后取上清液，待凈化。

1.3.3 凈化

先用6 mL正己烷預(yù)淋洗PC/NH2-SPE固相萃取柱（柱內(nèi)填好約1.5 cm無水硫酸鈉），待溶液面降至無水硫酸鈉層時，將上述衍生的提取液轉(zhuǎn)移至PC/NH2-SPE柱，再用15 mL正己烷-丙酮（99:1，V/V）溶液洗脫，收集全部流出液，35 ℃下氮吹至近干，用正己烷溶解并經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾定容至1 mL，進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)校正液的衍生

分別取不同濃度相同體積的混合-三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)校正溶液于15 mL離心管中，加入5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）及1 mL四乙基硼化鈉溶液（2 g/100 mL），手動搖勻后振蕩衍生反應(yīng)25 min，然后加入2 mL正己烷提取衍生產(chǎn)物，混勻，5000 r/min離心5 min后取上清液，進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-5色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：260 ℃，不分流進(jìn)樣；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；進(jìn)樣量：1.0 μL；程序升溫：初始溫度為 80 ℃，保持 1 min，以 20 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持 1 min，再以 5 ℃/min的速率升溫至280 ℃，保持10 min。

1.4.2 串聯(lián)質(zhì)譜條件

電子轟擊電離源（EI源）：傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；碰撞氣體：氬氣；采用 MRM模式，每個化合物檢測兩對母離子-子離子。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采 用 MassHunter GC/MS Acquisition B.070.01.1805軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，采用 MassHunter Workstation Software B.07.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，圖表采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化試劑的選擇

有機(jī)錫類農(nóng)藥極性較大、不易揮發(fā)，難以直接使用氣相色譜分析，因此需要先將其衍生為易氣化的全有機(jī)取代的化合物再進(jìn)行測定。常用的衍生方法主要有三種，一種是在酸性條件下利用硼氫化鈉或硼氫化鉀進(jìn)行氫化反應(yīng)[18]，缺點(diǎn)是衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定且容易揮發(fā)；第二種是采用格氏試劑在無水有機(jī)溶中進(jìn)行[19,20]，但該方法會產(chǎn)生有害氣體且需要分解多余的衍生試劑，操作較為繁瑣；第三種則是在水溶液中加入四乙基硼酸鈉直接進(jìn)行乙基化衍生[21,22]，該方法無需分解過量的衍生試劑，反應(yīng)過程也相對簡單，形成的衍生物性質(zhì)也穩(wěn)定。本文分別使用了乙基溴化鎂和四乙基硼酸鈉作為衍生化試劑進(jìn)行比較，按1.4條件對5種相同濃度的有機(jī)錫進(jìn)行衍生，在相同條件下考察它們對衍生物峰面積的響應(yīng)，結(jié)果見圖 1。結(jié)果表明使用四乙基硼酸鈉作為衍生劑時衍生物的峰面積更大，響應(yīng)積極，因此本實(shí)驗選用四乙基硼酸鈉作為衍生劑，該條件下三唑錫會先水解成三環(huán)錫，三環(huán)錫的衍生物為三環(huán)己基乙基錫，內(nèi)標(biāo)物三苯基錫-d15與毒菌錫、薯瘟錫主要官能團(tuán)相同，水解成三苯錫，三苯錫的衍生物為三苯基乙基錫[23]，苯丁錫的衍生物為三（2-甲基-2-苯基丙基）乙基錫。

圖1 兩種不同衍生劑對衍生物響應(yīng)的峰面積Fig.1 Peak areas of different derivatization reagents on the derivatization products

2.2 四乙基硼化鈉配制溶液的優(yōu)化

四乙基硼化鈉成本較高，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易水解，一般用甲醇或水配制，因此有必要使用合適的配制方法。盧大勝[24]等研究表明 2%四乙基硼化鈉四氫呋喃溶液在半個月內(nèi)不會出現(xiàn)降解和活性降低的情況，因此該配制方法得以廣泛使用，朱萌萌[25]等研究對比發(fā)現(xiàn)，三環(huán)錫、三唑錫和苯丁錫經(jīng) 2%四乙基硼化鈉水溶液衍生后的應(yīng)比經(jīng) 2%四乙基硼化鈉四氫呋喃溶液衍生的更高。由于三環(huán)錫和三唑錫的衍生物均為三環(huán)己基乙基錫，本實(shí)驗在此基礎(chǔ)上加入了三苯基錫的對比情況，結(jié)果如圖2。結(jié)果表明，經(jīng)2%四乙基硼化鈉水溶液衍生的6種有機(jī)錫類化合物的響應(yīng)值全面高于經(jīng) 2%四乙基硼化鈉四氫呋喃溶液衍生的衍生物，有利于提高本次分析檢測的靈敏度。因此本實(shí)驗選用2%四乙基硼化鈉水溶液作為衍生劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

圖2 四乙基硼化鈉溶劑對衍生化效率的影響Fig.2 Effect of NaBEt4solvents on derivatization efficiency of organo-tin compounds

2.3 衍生時間的選擇

圖3 有機(jī)錫化合物衍生時間對衍生效率的影響Fig.3 Effect of derivatization time on derivatization efficiency of organo-tin compounds

反應(yīng)時間太長會使有機(jī)錫分解，時間太短則會導(dǎo)致反應(yīng)不夠完全。按照1.4條件對同一濃度的3種有機(jī)錫化合物使用四乙基硼酸鈉作為衍生劑進(jìn)行衍生，研究不同衍生時間下它們峰面積的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖3。結(jié)果表明衍生時間為 25 min時，除了苯丁錫不明顯外，其余2種有機(jī)錫衍生物的峰面積最大，衍生效果最好，因此本實(shí)驗選擇衍生時間為25 min。

2.4 固相萃取柱的選擇

目前大多數(shù)食品中有機(jī)錫類化合物的檢測方法中，選擇Florisil柱對試樣進(jìn)行凈化，考慮到果蔬食品基質(zhì)中干擾物大多是烷基酚類小分子干擾物、脂肪酸和色素等大分子干擾物，結(jié)合PC/NH2-SPE柱凈化效果，特別是對于蔬菜水果等色素較高的樣品的前處理有良好凈化效果的特性，與Florisil柱凈化效果進(jìn)行對比。向雪桃試樣中加入1 mg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，提取并經(jīng)四乙基硼化鈉溶液衍生后，分別使用PC/NH2-SPE固相萃取柱和Florisil固相萃取柱進(jìn)行凈化，研究兩種不同固相萃取柱對三種衍生產(chǎn)物的峰面積響應(yīng)情況，結(jié)果如圖4。

圖4 不同固相萃取柱對凈化效果的影響Fig.4 Effect of cleanupfororgano-tin compounds between PC/NH2-SPE and Florisil

結(jié)果表明，相同條件下，試樣經(jīng)PC/NH2-SPE柱凈化，三環(huán)己基乙基錫、三苯基乙基錫和三(2-甲基-2-苯基丙基)乙基錫的峰面積響應(yīng)均大于經(jīng) Florisil凈化的結(jié)果，因此本次試驗采用PC/NH2-SPE柱進(jìn)行凈化。

表1 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法差異比較Table 1 Comparison of external standard method and internal standard method

2.5 內(nèi)標(biāo)法定量和外標(biāo)法定量差異比較

準(zhǔn)確稱取5 g（精確到0.01 g）雪桃試樣于50 mL離心管中，分別加入500 μL濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)工作液，另取5 g（精確到0.01 g）試樣于50 mL離心管中，只加入500 μL濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。兩組試樣均按照1.3提取、衍生和凈化后上機(jī)測定，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，相較于外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)法測定試樣的回收率更好。使用加入三苯基錫-d15內(nèi)標(biāo)溶液，能夠反應(yīng)出有機(jī)錫類化合物在前處理過程中的損失，因此本實(shí)驗采用內(nèi)標(biāo)法測定。

2.6 質(zhì)譜特征離子對的選擇

圖5 雪桃加標(biāo)MRM模式色譜圖Fig.5 MRM Chromatograms of three derivatization products

3種有機(jī)錫衍生物用電離源進(jìn)行 Q1全掃描（50～580m/z），得到全掃質(zhì)譜圖，選擇豐度較高，質(zhì)荷比合適的碎片離子作為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，從二級質(zhì)譜圖中選擇響應(yīng)較高的碎片離子作為子離子，最后改變碰撞電壓來進(jìn)行碰撞能量優(yōu)化。3種有機(jī)錫衍生物的專利質(zhì)譜條件見表2。

在選定的儀器條件下，3種有機(jī)錫化合物的衍生物可以得到良好的分離效果，見圖5。

2.7 方法的線性范圍、檢出限和定量限

取50、100、200、500、1000 μg/L 5個質(zhì)量濃度的混合-三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)校正溶液，按2.5中條件設(shè)定進(jìn)樣1 μL，以標(biāo)準(zhǔn)校正液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。以S/N=3確定檢出限，以S/N=10確定定量限，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示3種有機(jī)錫衍生物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998，三環(huán)錫、三苯基錫和苯丁錫衍生物的響應(yīng)在50～1000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，檢出限分別為0.03×10-1、0.03×10-1和 0.12×10-1mg/kg，均能滿足國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)限量要求。

表2 3種有機(jī)錫衍生物的保留時間、監(jiān)測離子對和碰撞能量Table 2 Retention time, monitoring ion pairs and collision energy of three derivatization products

表3 3種有機(jī)錫衍生物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficient, limit of determination (LOD) and limit of quantitation (LOQ) for three derivatization products

2.8 精密度和加標(biāo)回收率

向雪桃樣品中添加0.04、0.10、0.20 mg/kg的混合-三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)校正溶液，每個水平設(shè)置6個平行。將加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理，經(jīng)提取、衍生后凈化進(jìn)行測定，計算加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見表 4。結(jié)果表明，本方法回收率范圍為81.64%～106.23%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.10%～6.30%。

表4 3種有機(jī)錫衍生物的添加回收率和精密度Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of three derivatization products (n=6)

2.9 實(shí)際樣品檢測

取市售水果蔬菜共6個品種，按照1.3中方法處理并進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測定，結(jié)果見表5，均未檢出有機(jī)錫化合物。

表5樣品檢測結(jié)果Table 5 Sample test results

3 結(jié)論

本文采用四乙基硼化鈉衍生，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法測定桃中有機(jī)錫類農(nóng)藥殘留。該方法回收率范圍為 81.64%～106.23%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.16%～6.33%（n=6），三環(huán)錫、三苯基錫和苯丁錫的方法定量限分別為 0.10×10-1、0.09×10-1、0.39×10-1mg/kg，符合分析方法的要求，操作簡單高效，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，且與外標(biāo)法測定有機(jī)錫類農(nóng)藥殘留的方法相比，同位素內(nèi)標(biāo)法定量能在一定程度上消除基質(zhì)效應(yīng)，使測定結(jié)果更為準(zhǔn)確，可用于水果蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)錫類農(nóng)藥殘留的檢測，并為其他食品中有機(jī)錫類農(nóng)藥殘留的檢測提供依據(jù)。