張濤

（中國藥科大學 生命科學與技術學院，江蘇南京 211198）

顆粒酶（GZMs）是絲氨酸蛋白酶的一個亞家族，目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有5種人類顆粒酶（A、B、H、K和M）和11種小鼠顆粒酶。人類顆粒酶基因分別位于3組染色體，其DNA同源性在57%～61%[1]。這些顆粒酶不僅可以在細胞毒性T淋巴細胞（CTL）和自然殺傷細胞（NK）中表達，在嗜中性粒細胞、肥大細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞中也有表達[2]。研究發(fā)現(xiàn)，顆粒酶B在膀胱癌中表達，影響樣本的上皮間質轉化和侵襲能力[3]；顆粒酶M在白血病細胞和實體瘤細胞系（Hela）中表達，促進了腫瘤的生長和轉移，誘導癌細胞上皮間質轉化[4]；顆粒酶A在CTL和NK細胞中表達，主要介導穿孔素依賴的細胞毒性作用，該途徑通過將細胞毒性顆粒的內容物遞送至靶細胞表面來發(fā)揮作用。盡管已經(jīng)對淋巴細胞中顆粒酶A介導的細胞死亡進行了深入研究，但近年來的相關研究也表明了顆粒酶A可以在卵巢顆粒細胞等非淋巴細胞中表達[5]，具有區(qū)別于細胞毒性的其他作用。

1 顆粒酶A概述

顆粒酶A是細胞中含量最多的一種顆粒酶，人們對其的表達加工、晶體結構和底物特異性等已經(jīng)有了較為清晰的了解。人顆粒酶A基因位于人類的第5號染色體5q11～q12處，表達的顆粒酶A有α和β兩種亞型，α亞型由262個氨基酸組成，分子量為29 kD，前26個氨基酸為N端信號肽，第27和28個氨基酸為活化肽[6]；β亞型由245個氨基酸組成，分子量為27 kD。顆粒酶A的特異性主要取決于4個位點的氨基酸，即Leu217、Glu218、Asn219-A和Gly226[7]，在蛋白精氨酸（Arg）或賴氨酸（Lys）位點后裂解底物。與顆粒酶B不同，顆粒酶A以含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）非依賴的方式殺傷病毒感染細胞和腫瘤細胞。

2 顆粒酶A的表達

顆粒酶的表達通常僅限于淋巴譜系的細胞，CTL和NK是已知的組成性合成和存儲顆粒酶的免疫細胞。顆粒酶在嗜中性粒細胞、肥大細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等細胞中也表達，但此類細胞可能需要刺激才可誘導表達。CTL細胞和NK細胞中合成加工后的顆粒酶被儲存在pH為5.5的分泌性顆粒（SGs）中[8]，確保其在殺傷細胞內沒有活性，以保護其不破壞宿主細胞。

近年來的研究表明，在某些形式的刺激下，顆粒酶也可以在非淋巴細胞中表達。受到卵泡刺激素的刺激后，卵巢顆粒細胞中的顆粒酶A表達上調。在IL-3刺激的嗜堿性粒細胞和IgE激活的體外肥大細胞、紫外線A和紫外線B照射的角質形成細胞以及人的胎盤和睪丸支持細胞中均檢測到顆粒酶B的mRNA[9]。有實驗表明，顆粒酶甚至在多種腫瘤細胞中有所表達，如顆粒酶B在乳腺癌、肺癌、尿路上皮癌和口腔鱗狀細胞癌中均有表達；顆粒酶M在白血病細胞和實體瘤細胞系（Hela）中表達。顆粒酶A在乳腺癌細胞中切割了SET蛋白以及PARP-1蛋白，推測腫瘤細胞可能微量表達顆粒酶A，但這一推測還有待試驗驗證。

3 顆粒酶A的激活與抑制

與其他絲氨酸蛋白酶相似，顆粒酶的加工通過兩步過程激活，所有的顆粒酶最初都被合成為無活性的前體分子。（1）根據(jù)顆粒酶A前體分子上的前導序列將前體分子運輸至內質網(wǎng)和高爾基體，除去前導序列，保留該蛋白氨基末端的一個二肽[10]。（2）無活性的顆粒酶A被運送至分泌性顆粒中經(jīng)二肽基肽酶I（DPPI）裂解二肽轉化成有活性的顆粒酶A。DPPI又稱組織蛋白酶C，負責在顆粒酶A的激活過程中裂解二肽，是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶超家族。研究發(fā)現(xiàn)，DPPI在多種惡性腫瘤中表達上調，包括鱗癌、胰腺癌和乳腺癌[11]。

顆粒酶蛋白水解活性受絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員的調節(jié)。絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpins）是一個大的蛋白酶抑制劑家族，可以通過共價不可逆的方式結合到酶活性位點上，或者通過形成非常緊密的非共價復合物來使其靶向失活。絲氨酸蛋白酶抑制劑B12（Serpin B12）是人類細胞內源性絲氨酸蛋白酶抑制劑之一[12]，也是顆粒酶A的緩慢結合抑制劑，該機制依賴于Serpin B12結構中RSL（Reactive-Site Loop）反應中心的Arg和絲氨酸（Ser），顆粒酶A在Arg和Ser位點后切割RSL，使得Serpin B12折疊的張力減弱，導致主要的構象發(fā)生重排，進而使得顆粒酶A活性位點被扭曲，并將其困在與抑制劑共價的復合物中。

此外，顆粒酶A被兩種胰蛋白酶抑制劑α-2巨球蛋白和抗凝血酶Ⅲ結合并不可逆地抑制。第3種顆粒酶A抑制劑是胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑（PSTI）[13]，在患有炎癥和組織破壞的患者血液中被發(fā)現(xiàn)。整體上來看，主要是在CTL細胞和多種靶標細胞中鑒定了顆粒酶A的抑制劑，鑒定其在表達顆粒酶的腫瘤細胞和非淋巴細胞中的表達需要盡早完成。

4 顆粒酶A在腫瘤細胞中潛在的生理功能

研究表明，腫瘤細胞中有各種蛋白酶的表達，如基質金屬蛋白酶（MMPs）、組織蛋白酶、尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）等己經(jīng)被證明在腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮了重要作用。這些蛋白酶類參與了腫瘤對基底膜的降解并促進了腫瘤從原發(fā)部位的脫離進而導致腫瘤的侵襲和轉移。但關于顆粒酶在非淋巴細胞內和腫瘤細胞中表達的研究并不多，對于其功能的探討更是少之又少。目前，對于顆粒酶A的功能研究，主要集中于其在淋巴細胞中表達所具有的細胞毒性作用以及可能的促炎作用。顆粒酶A通過對NDUFS3、SET復合物組成部分等底物的切割，誘導染色體DNA產(chǎn)生不可修復的損傷，最終導致靶標細胞死亡[14]。淋巴細胞表達顆粒酶A時，顆粒酶A底物非常豐富且具有特異性，對底物的切割是顆粒酶發(fā)揮作用的主要機制。在核內其可以裂解SET復合物中的多種組分，如核小體組裝蛋白、剪切相關蛋白、多種轉錄因子以及組蛋白。

4.1 與腫瘤遷移相關

顆粒酶A在腫瘤細胞中的表達可能與腫瘤的上皮間質轉化（EMT）和侵襲遷移有關。2010年，Donatella等[3]發(fā)現(xiàn)膀胱癌中表達的顆粒酶B與樣本的上皮間質轉化相關，而且能促進尿道癌細胞的侵襲能力。另外，2015年有研究表明顆粒酶M在白血病細胞和實體瘤細胞系（Hela）中表達，促進了腫瘤的生長和轉移，誘導癌細胞上皮間質轉化，并與STAT3的激活相關[4]。

Gomes等人[15]對乳腺癌等腫瘤的最新研究表明，在腫瘤發(fā)生過程中，組蛋白變體H3.3作為腫瘤細胞命運的主要調節(jié)因子被整合到染色質中，誘導促轉移的轉錄重編程，是腫瘤進展和侵襲中至關重要的組分。有研究表明，在星狀孢子素誘導的淋巴瘤細胞（Raji細胞）死亡過程中，組蛋白H3在體內被顆粒酶A裂解[16]。組蛋白變體H3.3作為顆粒酶A的底物，則可能在這一過程中被調節(jié)，從而影響腫瘤的進程和侵襲表型。SET是一種參與多種細胞過程的多功能癌蛋白，在腫瘤發(fā)生和轉移中起著重要作用。NM23H1是一種DNA酶和腫瘤轉移抑制因子，而SET能夠與NM23H1結合，并抑制其活性。SET的蛋白水解或拮抗將逆轉對NM23H1的抑制，所以顆粒酶A對于SET的切割同樣可能影響腫瘤的遷移。

4.2 影響腫瘤細胞的基因表達

組蛋白是細胞染色質中的堿性蛋白質，和DNA共同組成核小體結構，是染色質的主要蛋白質組分，并在基因表達調控中發(fā)揮非常重要的作用。顆粒酶A的眾多底物中則包括組蛋白H1、H2B、H3和H4，其中顆粒酶A對組蛋白H3和H4的切割也已經(jīng)在Raji細胞中被證實[17]。顆粒酶A對組蛋白的切割通常被認為是誘導靶細胞凋亡的機制，但其在腫瘤細胞中所扮演的角色可能并非僅僅如此。顆粒酶A對組蛋白底物的切割可能會改變染色質的開放狀態(tài)，進而影響基因的表達調控。

顆粒酶A對于SET復合物的切割是顆粒酶A介導caspase非依賴的凋亡途徑的主要機制，這一過程涉及眾多底物，包括SET復合物的組成成分SET、pp32、Ape1和參與SET復合物組裝和轉錄激活的HMG2等。SET同時也是激素受體介導的基因表達的重要調節(jié)劑，與糖皮質激素受體（GR）、甲狀腺激素受體（TR）和雌激素受體（ER）相互作用。此外，核小體組裝蛋白、剪切相關蛋白以及多種轉錄因子等眾多參與基因表達的蛋白都是顆粒酶A的底物?；谝陨险J識，可以推測如果腫瘤細胞中表達顆粒酶A，很可能通過對眾多影響基因表達來調控底物的切割，從而影響腫瘤細胞基因表達的情況。

4.3 增強腫瘤細胞對細胞毒性作用的耐受性

腫瘤免疫編輯這一理論認為，免疫系統(tǒng)能夠在某個階段清除異常的轉化細胞。顆粒酶A介導的細胞毒性作用能夠靶向轉化腫瘤細胞。腫瘤細胞中微量表達顆粒酶A可能有助于其對免疫細胞產(chǎn)生的細胞毒性作用的耐受，協(xié)助腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視，并且這一過程可能是通過腫瘤細胞提高顆粒酶A的蛋白酶抑制劑的表達量來實現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞會通過表達蛋白酶抑制因子-9來保護其免受顆粒酶B介導的細胞毒作用，作為一種免疫逃避機制，這一功能隨著肺癌分期的增加而增強[18]。

5 結語

以往認為顆粒酶由淋巴細胞產(chǎn)生，且所有種類顆粒酶主要是參與細胞毒性作用以及促炎作用，作為免疫細胞的子彈來殺傷靶細胞。基于顆粒酶B以及顆粒酶M腫瘤細胞中表達并影響腫瘤進程的研究，提出了腫瘤細胞可能表達微量顆粒酶A的觀點。對現(xiàn)有顆粒酶A的研究進行了總結，提出腫瘤細胞中微量表達的顆粒酶A可能通過調控基因表達和對底物蛋白的切割影響腫瘤細胞的遷移、增強腫瘤細胞對細胞毒性作用的耐受性并影響腫瘤進程最終促進腫瘤逃逸。本文為今后顆粒酶A的研究提供了全新的思路，對于腫瘤中顆粒酶A作用和機制的研究也可為今后腫瘤的治療提供新的觀點和干預策略。