金倩儀

（中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東中山 528437）

在微生物的試驗(yàn)過程中，培養(yǎng)基的質(zhì)量直接影響檢驗(yàn)結(jié)果，這其中包含了培養(yǎng)基自身質(zhì)量的優(yōu)劣、配制和使用方法是否正確、保存是否符合條件等過程[1-2]。沙門氏菌檢驗(yàn)是食源性微生物檢測(cè)的常規(guī)項(xiàng)目，該項(xiàng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基為亞硫酸鉍（BS）瓊脂培養(yǎng)基，檢測(cè)中一般購(gòu)買商品化的BS瓊脂平板直接進(jìn)行菌種檢測(cè)，也可購(gòu)買BS瓊脂干粉制作平板用于檢測(cè)（現(xiàn)用現(xiàn)配），培養(yǎng)基中的亞硫酸鉍指示劑可以抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群生長(zhǎng)，但不影響沙門氏菌的生長(zhǎng)。

在沙門氏菌檢驗(yàn)中，BS瓊脂平板培養(yǎng)基的質(zhì)量關(guān)系到沙門氏菌檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，選擇傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌和糞腸球菌4種菌株對(duì)BS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性和生長(zhǎng)率的檢驗(yàn)，探究影響B(tài)S瓊脂平板培養(yǎng)基驗(yàn)收結(jié)果的相關(guān)因素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傷寒沙門氏菌[CMCC(B)50071]，廣東省微生物菌種保藏中心提供；鼠傷寒沙門氏菌[ATCC 14028]、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、糞腸球菌（ATCC 29212），美國(guó) MicroBioLogics ATCC。

Quintix2102-1CN電子天平，賽多利斯貿(mào)易有限公司；KB400生化培養(yǎng)箱，賓德亞太有限公司；SG603A-HE生物安全柜，美國(guó)BAKER公司。

1.2 檢驗(yàn)環(huán)境

遵循無菌操作原則在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 平板制作

稱取適量的亞硫酸鉍瓊脂干粉加水進(jìn)行煮沸滅菌，待冷卻至40 ℃后傾注平板（直徑90 mm的平皿，通常要加入15～25 mL瓊脂培養(yǎng)基），放到水平平面待瓊脂凝固。需要在使用前一天配置，可常溫放置于生物安全柜到第2天直接使用。

1.3.2 接種方法

傷寒沙門氏菌（菌株T1）和鼠傷寒沙門氏菌（菌株T2）作為目標(biāo)菌，采用目標(biāo)菌半定量方法。如圖1a所示，用1 μL的接種環(huán)分A、B、C、D四個(gè)區(qū)進(jìn)行劃線，A、B、C三個(gè)區(qū)按0.5 cm的間隔劃4條平行線，D區(qū)內(nèi)劃一條連續(xù)的曲線[3]。大腸埃希氏菌（N1）和糞腸球菌（N2）作為非目標(biāo)菌，采用非目標(biāo)菌半定量方法。如圖1b所示，用1 μL的接種環(huán)取1環(huán)工作懸液在待測(cè)培養(yǎng)基表面劃6條平行線。接種后的平板倒置培養(yǎng)于（36±1）℃培養(yǎng)箱中40～48 h。

圖2 目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌半定量劃線法接種模式圖

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)置

選用同一生產(chǎn)廠家兩個(gè)批號(hào)的BS瓊脂干粉配制新鮮培養(yǎng)基并制作BS瓊脂平板（命名為BS1、BS2）和另一生產(chǎn)廠家兩個(gè)批號(hào)的商用BS瓊脂平板（BS3、BS4），分別使用4種菌株（T1、T2、N1、N2）的新、舊菌株進(jìn)行劃線和菌種培養(yǎng)。

1.3.4 接種結(jié)果評(píng)價(jià)

培養(yǎng)后，評(píng)價(jià)菌落的形狀、大小和生長(zhǎng)密度，并計(jì)算生長(zhǎng)指數(shù)G。每條有比較稠密菌落生長(zhǎng)的劃線則G為1；如果僅有一半的線有稠密菌落生長(zhǎng)則G為0.5；如果沒有菌落生長(zhǎng)、生長(zhǎng)量少于劃線的一半或菌落生長(zhǎng)微弱則G為0[4]。記錄每個(gè)平板的得分總和便是G值，目標(biāo)菌的G值一般是≥6，非目標(biāo)菌的G值一般≤1。

2 結(jié)果與分析

不同類型、不同批號(hào)的亞硫酸鉍瓊脂平板的驗(yàn)收結(jié)果如表1所示。BS1使用鼠傷寒沙門氏菌（T2）舊菌株劃線的平板生長(zhǎng)指數(shù)不符合標(biāo)準(zhǔn)要求，但是用新菌株劃線的平板是符合要求的；BS2的所有菌株劃線的平板都在標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)，因此該批號(hào)的BS瓊脂干粉培養(yǎng)基通過了培養(yǎng)基驗(yàn)證；BS4瓊脂平板使用傷寒沙門氏菌（T1）劃線的平板均沒有生長(zhǎng)，且使用糞腸球菌（N2）舊菌株劃線的平板生長(zhǎng)指數(shù)也超出標(biāo)準(zhǔn)要求；BS3瓊脂平板使用傷寒沙門氏菌（T1）舊菌株劃線其生長(zhǎng)指數(shù)偏低，且糞腸球菌（N2）舊菌株的劃線平板也超出了正常生長(zhǎng)。為此，對(duì)所有菌株進(jìn)行一次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌（N2）的舊菌株受到了污染，有雜菌；同時(shí)，舊菌株活性比新菌株差，因此舊菌株的結(jié)果不可作為培養(yǎng)基驗(yàn)收結(jié)果。由于BS4瓊脂平板的傷寒沙門氏菌（T1）的G值不符合標(biāo)準(zhǔn)要求，判定該批次的平板不合格。

表1 亞硫酸鉍瓊脂驗(yàn)收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

GB 4789.28-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》表明，每次進(jìn)行驗(yàn)收都應(yīng)進(jìn)行菌株的純度和形態(tài)驗(yàn)證，在保存和使用時(shí)應(yīng)注意避免交叉污染，本次實(shí)驗(yàn)可說明使用后的菌株不宜反復(fù)使用，最好是當(dāng)天廢棄銷毀。每次打開后易交叉污染，一旦發(fā)現(xiàn)菌株有污染現(xiàn)象應(yīng)立即處理掉并換新的工作菌株，且舊的菌株即便是不被污染，也可能會(huì)因?yàn)閭鞔螖?shù)過多而失去活力。運(yùn)輸條件和儲(chǔ)存條件對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)量影響也是不可忽視的，對(duì)溫度有要求的培養(yǎng)基應(yīng)在收到后立即轉(zhuǎn)存。生產(chǎn)商在送出時(shí)也應(yīng)該和物流溝通好，確保運(yùn)輸過程中不會(huì)影響到培養(yǎng)基的質(zhì)量。而且平板的配置、儲(chǔ)存也有一定的要求，一般已配置的平板保存不超過4周，且要求保存在2～8 ℃條件下。已配置的平板在使用前也要觀察是否有異常，而BS平板配置與一般培養(yǎng)基不同，需要在使用前一天配置，可常溫放置于生物安全柜至第2天使用。如果培養(yǎng)基購(gòu)置后還未進(jìn)行培養(yǎng)基驗(yàn)證又需要立即使用時(shí)，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基的驗(yàn)收實(shí)驗(yàn)，在用實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)出的菌進(jìn)行平板劃線時(shí)同時(shí)使用陰陽性菌株劃線，通過結(jié)果反饋來驗(yàn)證培養(yǎng)基是否符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，在得到比較準(zhǔn)確的驗(yàn)收結(jié)果的同時(shí)，觀察培養(yǎng)基在日常檢驗(yàn)中的使用狀況。

3 結(jié)論

同一生產(chǎn)商不同批號(hào)、不同狀態(tài)生產(chǎn)的培養(yǎng)基質(zhì)量有優(yōu)劣之分并不穩(wěn)定。因此，培養(yǎng)基驗(yàn)收實(shí)驗(yàn)[5-6]是不可或缺的一個(gè)步驟，這直接影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。不同的培養(yǎng)基應(yīng)參照GB 4789.28-2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》進(jìn)行驗(yàn)收試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室可以多采購(gòu)不同品牌的培養(yǎng)基使用，通過多次驗(yàn)收實(shí)驗(yàn)以及使用心得來選購(gòu)符合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際狀況的培養(yǎng)基。