戴佳晟，王彥澤，劉 鑫

（哈爾濱醫(yī)科大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150081）

近年來，衰老相關疾病的發(fā)病率不斷增加，如何抗衰老已成為目前研究的熱點［1］。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）是細胞生命活動中的重要輔酶，催化多種代謝及氧化還原反應。多項研究表明，在衰老過程中體內NAD+含量逐漸降低，并且NAD+代謝異常會誘發(fā)多種衰老相關疾病的產生，如中樞神經系統(tǒng)退行性疾病、心血管疾病和腫瘤等，而恢復體內的NAD+水平則可以改善疾病狀況，甚至延長壽命。因此，NAD+目前已經成為抗衰老及相關疾病的“明星靶點”［2］。本文對近年來有關NAD+在衰老及相關疾病中的研究進行綜述，以期為相關疾病的治療提供理論依據與參考。

1 衰老概述及生物標志物

衰老是機體生長發(fā)育達到成熟期以后，各組織、器官隨著年齡增長而發(fā)生退行性變化的過程［3］。隨著生命科學研究的發(fā)展，人們對衰老發(fā)生機制的認知逐漸清晰，端粒酶學說、氧化應激學說、體細胞突變學說、脂褐素學說和內分泌功能減退學說等被人們廣泛接受。然而對于衰老的預防和相關治療藥物的研發(fā)并未取得顯著成效，衰老相關疾病仍是導致死亡的主要原因。這其中包括神經退行性疾病〔帕金森病和阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）等〕、代謝綜合征（冠心病和糖尿病等）、腫瘤（乳腺癌和腎細胞癌等）、年齡相關性疾?。ò變日虾忘S斑病變等）和免疫系統(tǒng)疾病（系統(tǒng)性紅斑狼瘡等）等［4］。

衰老是不可避免、不可逆轉的過程，目前研究已確定了多種與哺乳動物衰老相關的生物標志物，這些標志物伴隨著衰老的發(fā)生而產生，可能參與調節(jié)衰老的病理變化，也可由衰老誘發(fā)。

早期衰老生物標志物是以時間年齡而非生物學年齡作為評判指標和獨立因素來確定。BAI等［5］的最新研究證實，單個生物標志物不可能準確反映機體的衰老狀態(tài)，并從衰老變化的108個指標中選擇了7種與衰老最為相關的生物標志物，并確定生物學年齡得分=0.248×實際年齡+0.195×頸動脈內膜中層厚度-0.196×頸動脈舒張末期血流速率-0.167×左心室舒張早期充盈峰與二尖瓣心房收縮期充盈峰之比-0.166×二尖瓣環(huán)側壁充盈早期峰流速度+0.188×動脈脈壓+0.182×血漿纖維蛋白原濃度+0.193×血清胱抑素C濃度。

隨著生命科學研究的發(fā)展，人們逐漸認識到生物標志物的復雜性和功能多樣性，現(xiàn)有疾病生物標志物的確定均需綜合疾病進展、臨床診斷、藥物治療和個體差異等因素。CARDOSO等［6］的研究較為全面地概括了在研衰老標志物，作者在基因表達數(shù)據庫（GenAge，Longevity Map等）中篩選在壽命和衰老相關疾病中具有異常變化的基因，尤其識別在體液中存在并可被檢測到的基因，作為潛在的衰老生物標志物，最終得到19個候選因子，按衰老的主要病理過程分為7類。①炎癥：CXC趨化因子配體10、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）和C-X3-C基序趨化因子配體1；②線粒體和細胞凋亡：生長分化因子15、纖連蛋白Ⅲ型結構域和波形蛋白；③鈣穩(wěn)態(tài)：鈣調素和鈣網蛋白；④纖維化：尿激酶和血管緊張素原；⑤神經肌肉接頭和神經元：腦源性神經生長因子和顆粒蛋白前體；⑥細胞骨架和激素：α-klotho蛋白、成纖維細胞生長因子23、成纖維細胞生長因子21和瘦素；⑦ 其他：微RNA（micro RNA，miRNA）、腺苷同型半胱氨酸酶和角蛋白18。NAD+及相關代謝因子包括CD38、抗衰老酶（sirtuin，SIRT）和煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT）被認為是衰老的新興標志物。多項研究證實，NAD+隨機體年齡增長表達急速下降，且外源補充NAD+能夠延緩衰老，以NAD+為核心的治療策略已成為對抗衰老及相關疾病的熱門方向（表1）。

表1 NCBI基因庫中人類衰老標志物的基因ID及其在衰老過程中的表達趨勢

2 NAD+概述

人們在20世紀初就發(fā)現(xiàn)了NAD+，并開始著手研究其結構和功能?，F(xiàn)已明確NAD+的化學結構為磷酸核苷酸糖，其主要功能為細胞氧化還原反應所需的重要輔酶，協(xié)助關鍵代謝途徑中的氫轉移［40］，包括糖酵解中的3-磷酸甘油醛脫氫反應，三羧酸循環(huán)中的部分氧化反應，以及線粒體中的脂肪酸和氨基酸氧化等過程。在線粒體中的脂肪酸和氨基酸氧化過程中，NAD+均轉化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），而NADH用于氧化磷酸化及作為ATP合成的電子供體［41］。除此之外，NAD+還作為3類酶〔SIRT、ADP核糖基轉移酶（adenosine diphosphate ribosyl transferase，ADPRT）或聚核糖基聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）以及環(huán)ADP核糖合成酶（CD38和CD157）〕的重要底物，共同參與調控細胞凋亡、腫瘤進展、細胞衰老、DNA修復和線粒體生物合成等過程［42］。

3 NAD+的生物合成

NAD+除了參與線粒體三羧酸循環(huán)以及作為酶的底物而被降解，還會在糖酵解等其他的分解代謝途徑中被消耗［42］。因此生物體需要依賴幾種合成途徑來維持細胞內NAD+的水平。NAD+前體有4種：煙酸、煙酰胺、色氨酸和煙酰胺核糖（nicotinamide ribose，NR）。

第一種合成途徑是通過Preiss-Handler途徑。該途徑中的關鍵酶是煙酰胺單核苷酸腺苷酸轉移酶（nicotinamide mononucleotide adenyltransferace，NMNAT），其具有3種亞型（NMNAT1～NMNAT3），且以NMNAT1的酶活性最強［43］。NMNAT在ATP存在下將煙酸單核苷酸轉化為煙酸腺嘌呤二核苷酸（nicotinic acid adenine dinucleotide，NAAD），NAAD 再被催化成 NAD+［33，44］。

第二種合成途徑是通過犬尿氨酸途徑，由色氨酸合成NAD+。以吲哚胺2，3-雙加氧酶或色氨酸2，3-雙加氧酶為關鍵酶，將色氨酸轉化為N-甲酰犬尿氨酸，后者再依次轉化為L-犬尿氨酸、5-羥基-2-氨基苯甲酸、2-氨基-3-羧酸黏康酸-6-半醛（2-amino-3-carboxymuconate-6-semialdehyde，ACMS），最后變成喹啉酸。該途徑中的另一個關鍵步驟是ACMS的轉化，NAD+合成的前體ACMS自發(fā)地縮合并重排為喹啉酸酯。在大多數(shù)情況下，ACMS會被ACMS脫羧酶脫羧成2-氨基-3-黏康糖-6-半醛（2-amino-3-muconose-6-semialdehyde，AMS），從而通過檸檬酸循環(huán)被氧化成乙酰輔酶A。如過量的色氨酸超出了ACMS脫羧酶的酶促能力，喹啉酸酯將轉化為NAMN，從而進入Preiss-Handler合成途徑［33，44］。

在哺乳動物中還存在補救途徑，也是產生和維持細胞內NAD+水平的重要途徑。動物研究表明，NAMPT作為NAD+補救途徑中的關鍵酶，在維持細胞內NAD+水平方面發(fā)揮著重要作用［45］。NAD+在消耗酶（SIRT，ADPRT和PARP）的作用下，產生酶活性的副產物——煙酰胺。煙酰胺通過NAMPT先轉化為煙酰胺單核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN），再在NMNAT催化下合成NAD+。煙酰胺作為抑制因子調節(jié)NAD+活性［46］。還有一條補救途徑是以NAMPT為關鍵酶，將ATP的腺苷酸部分綴合至 NMN 來產生 NAD+［33，44］。

4 NAD+在衰老進展過程中的變化及機制

研究已證實，小鼠大腦、肝和胰腺等多個器官中的NAD+含量隨其年齡的增長而下降［47-49］。也有研究發(fā)現(xiàn)，NAD+水平下調能誘發(fā)衰老及相關表型的出現(xiàn)。降低NAD+含量能促進實驗動物提前進入衰老［40］。而衰老過程中NAD+含量的下降可導致細胞核中SIRT1的活性降低，從而破壞線粒體功能。提高老年小鼠體內的NAD+水平則以SIRT1依賴的方式恢復線粒體功能［50］。煙酰胺核苷激酶1（nicotinamide riboside kinase 1，NRK1）是肝細胞中NR誘導NAD+合成的限速酶和必要酶。SAMBEAT等［51］發(fā)現(xiàn)，NRK1缺失限制PARP活性并加重DNA損傷，導致基因組不穩(wěn)定，進一步促進細胞衰老和炎癥發(fā)生，加劇衰老相關的神經變性。目前已發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律、慢性炎癥、miRNA、DNA損傷和CD38是影響NAD+水平的5個主要因素［45］。

4.1 晝夜節(jié)律

生物鐘基因中的Clock基因和Bmal1基因是調節(jié)晝夜節(jié)律的關鍵轉錄因子復合體，該復合體通過與NAMPT的啟動子區(qū)域結合來調節(jié)NAMPT的表達，晝夜節(jié)律活動隨機體衰老而發(fā)生改變，這使得Clock基因表達豐度下降，進一步導致NAMPT和NAD+的缺乏；此外，SIRT1可使BMAL1脫乙?；?，從而調節(jié)生物鐘基因的表達，并且NAMPT-NAD+-SIRT1調控通路會放大NAD+和NAMPT水平的晝夜節(jié)律振蕩［52-55］。以上研究表明，在衰老的進展過程中，晝夜節(jié)律與NAD+水平相互影響，晝夜節(jié)律也是衰老進展過程中的潛在調節(jié)因素。

4.2 慢性炎癥

炎癥細胞因子中的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和氧化應激反應可顯著降低NAMPT和NAD+的水平［56］。TNF-α抑制小鼠肝和視交叉上核中Clock/Bmal介導的晝夜節(jié)律周期，同時氧化應激反應顯著降低原代肝細胞的NAMPT和NAD+水平［57］。TNF-α，IL-1和IL-6以及氧化應激都促進衰老過程中慢性炎癥的發(fā)展，慢性炎癥可能是衰老過程中NAMPT介導的NAD+生物合成和受損的原因。

4.3 miRNA

miRNA通過結合于靶基因的3′端非翻譯區(qū)抑制基因的表達，已被證明在多種生理和病理狀態(tài)下發(fā)揮重要的轉錄后調控作用。研究表明，miRNA在衰老及相關疾病進展中發(fā)揮重要作用。CHOI等［58］的研究表明，肥胖癥患者肝miRNA-34a（miR-34a）的水平顯著升高，miR-34a通過靶向作用于SIRT1降低其表達。此外，miR-34a還可通過直接抑制NAMPT表達進而降低NAD+水平和SIRT1活性。在肝中過表達miR-34a則降低NAMPT/NAD+水平，導致肥胖。這說明miR-34a具有潛在調控NAD+及衰老的作用。

4.4 DNA損傷

NAD+減少也可能是由PARP介導的NAD+耗竭導致的，PARP被認為是老化過程中主要消耗NAD+的酶［59］。SCHEIBYE-KNUDSEN 等［60］的研究闡明，科凱恩綜合征B（Cockayne syndrome B，CSB）蛋白被PARP產生的聚腺苷二磷酸-核糖基化蛋白募集到DNA損傷的位點并置換PARP，從而使DNA修復得以進行。因此，在缺少CSB的細胞中，活性PARP將持續(xù)存在于DNA受損部位，從而加劇NAD+的消耗，并加劇DNA損傷。

4.5 CD38

除上述因素外，SCHULTZ等［61］認為，CD38也是影響NAD+水平的一個重要因素。其研究發(fā)現(xiàn)，32月齡的野生型小鼠的NAD+水平大約是幼鼠的一半，但CD38敲除小鼠的NAD+水平下降。過表達CD38的肝細胞線粒體氧消耗明顯減少，而線粒體功能障礙是衰老期間代謝水平下降的重要標志，說明CD38可能通過影響線粒體功能進而調控衰老。CAMACHO-PEREIRA等［62］也發(fā)現(xiàn)，CD38過表達的細胞表現(xiàn)出較高的NAD+糖水解酶活性，以及較低的NAD+和NADH水平，表明衰老小鼠中CD38至少部分通過調節(jié)NAD+表達水平影響線粒體功能。

5 NAD+在衰老及其相關疾病中的作用

上述研究顯示，NAD+在衰老進展過程中受各種因素影響而表達下調，并可作為衰老發(fā)生的生物標志物，隨之又有諸多NAD+對衰老及相關疾病的作用研究，探討了恢復NAD+水平作為抗衰老策略的可行性［63］。

5.1 NAD+對壽命和心臟衰老的影響

5.1.1 壽命

ZHANG等［64］發(fā)現(xiàn)，NAD+可恢復失活干細胞的功能。通過飲食補充老年小鼠NAD+前體NR 6周，能顯著延長衰老小鼠壽命〔普通飲食組（829±12）d；NR治療組（868±12）d〕，這種作用是通過NAD+作用于SIRT1繼而激活線粒體未折疊蛋白反應（mitochondrial unfolded protein response，UPRmt），最終通過改善線粒體功能而產生的。MOUCHIROUD等［59］建立了秀麗隱桿線蟲和小鼠的衰老模型，發(fā)現(xiàn)PARP通過調節(jié)NAD+水平調控線粒體功能，在維持線粒體和機體功能方面發(fā)揮重要的作用。消耗NAD+水平使線蟲的壽命顯著縮短，而外源性給予NAD+則抑制線蟲的衰老過程并延長其壽命。機制研究發(fā)現(xiàn)，NAD+通過sir-2.1基因的過度表達誘導有絲分裂蛋白表達失衡，并通過激活UPRmt促進轉錄因子DAF-16的核轉運和激活，共同參與調節(jié)線粒體功能，最終影響機體壽命。YOSHIDA等［38］發(fā)現(xiàn)，在脂肪組織特異性過表達NAMPT可增加衰老小鼠血循環(huán)中細胞外煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase，eNAMPT）的水平，eNAMPT能夠促進多種組織中NAD+的表達，并延長雌性小鼠的健康期。此外，從幼鼠中分離的含eNAMPT的細胞外囊泡可顯著延長衰老小鼠的壽命。這些研究表明，提高NAD+水平可延遲實驗模型動物的正常衰老。

研究也證實NAD+可作為抗衰老藥物靶點。對小鼠過表達SIRT1/SIRT6，或給予小鼠SIRT激活復合物（sirtuin-activating compound，STAC）如白藜蘆醇和SRT2104，或以NAD+前體作用于小鼠后，小鼠壽命得以延長，器官功能、身體耐力、抗病性得到明顯提高。在非人類靈長類動物和人類中進行的試驗也表明，STAC在治療炎癥和代謝性疾病等方面是安全有效的［37］。

5.1.2 心臟衰老

在WANG等［65］的研究中，D-半乳糖胺（D-galactosamine，D-Gal）誘導的衰老H9C2細胞和衰老小鼠心肌組織中發(fā)現(xiàn)CD38表達上調，并且NAMPT和SIRT1的表達下調。敲除CD38可顯著減少衰老相關β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量，同時能降低衰老H9C2細胞中P16和P21的表達，減少細胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。抑制SIRT1可部分逆轉CD38敲除對H9C2細胞衰老和氧化應激反應的影響。此外，補充NAD+可有效抑制D-Gal誘導的細胞衰老，減少ROS產生和降低MDA含量。以上研究說明敲除CD38通過NAD+/SIRT1信號通路延緩心肌細胞衰老，CD38也可作為補充NAD+的有效作用靶點。

5.2 NAD+對衰老相關疾病的影響

5.2.1 神經系統(tǒng)退行性疾病

神經系統(tǒng)退行性疾病主要包括帕金森病和AD，是年齡高度相關的惡性神經系統(tǒng)疾病。FANG［66］對AD發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，AD患者死后腦海馬組織顯示出受損的線粒體積累和線粒體數(shù)量減少，表明線粒體損傷可能是AD病理進程的主要驅動力，恢復NAD+水平能通過維持線粒體功能改善AD中的認知喪失，證實NAD+有望成為AD的治療靶點。FANG等［67］建立了共濟失調毛細血管擴張模型。實驗數(shù)據表明，在共濟失調毛細血管擴張綜合征（ataxia capillary dilatation syndrome，A-T）中存在線粒體動力學特征紊亂，主要表現(xiàn)為線粒體分裂和融合的不平衡以及線粒體自噬的降低。而外源性補充NAD+前體NR能通過上調SIRT1活性維持線粒體動力平衡，上調線粒體自噬水平，且能促進ATM-KD神經元中DNA的修復，進一步改善A-T的臨床癥狀。

5.2.2 腫瘤

胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）細胞和PDAC組織中NAD+補救途徑的限速酶NAMPT表達顯著增加。下調NAMPT能夠在體內外抑制腫瘤的發(fā)生和生長，表明是由細胞內NAD+水平和糖酵解活性降低導致［68］。同時，F(xiàn)K866（NAMPT抑制劑）能夠增強吉西他濱（嘧啶類抗腫瘤藥物）在PDAC細胞和小鼠PDAC模型中的抗腫瘤活性。miR-206的表達下調是NAMPT表達異常的原因，證明miR-206和NAMPT可作為PDAC治療的有效藥物研發(fā)靶點。在其他腫瘤中，NAD+也被證明是可靠的藥物靶點，抗腫瘤藥物丹參酮ⅡA和β-拉帕醌可以通過降低L型氨基酸轉運體1的表達來阻斷色氨酸的轉運，從而抑制細胞內NAD+合成，最終使腫瘤細胞能量代謝受阻［69］。此外，PARP抑制劑奧拉帕尼、尼拉帕尼和盧卡帕尼等能夠用于治療卵巢癌和乳腺癌，目前大部分的PARP抑制劑均以NAD+中的煙酰胺結構為母體，并通過與NAD+競爭結合PARP催化域上的NAD+結合位點來發(fā)揮作用，這也進一步說明PARP抑制劑是調控NAD+功能的潛在候選藥物［70］。

5.2.3 糖尿病

糖尿病的發(fā)生比例與年齡呈顯著正相關，衰老是糖尿病的重要危險因素，最新統(tǒng)計數(shù)據顯示，糖尿病已成為中老年人致死的主要疾病之一［71］。YANG等［72］探究了NAD+對2型糖尿病動物模型OLETF大鼠的影響。連續(xù)4周每天給予大鼠煙酰胺100 mg·kg-1能顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖和胰島素水平，胰島素抵抗也得到明顯緩解。而給予同樣劑量煙酸組的大鼠，降糖效果不如煙酰胺組明顯。該研究表明，NAD+調節(jié)劑能夠改善糖尿病大鼠的糖代謝，為糖尿病的臨床治療提供了參考。

6 結語

目前，NAD+相關藥物已成為被大眾所期待的新興抗衰老策略，其前體物質NR和NMN為目前藥物開發(fā)的熱點方向，在過去幾年，NMN僅作為科研材料面向研究機構銷售且價格昂貴。近幾年，通過一定的生物技術，NMN在人體內的吸收及活性得以增強，并且其生產成本也有所降低，目前已有成熟型NAD+前體NMN衰老抑制劑的產品上市。但此產品以營養(yǎng)補充劑形式上市，未經過美國食品藥品監(jiān)督管理局的藥物安全性和有效性測試，且人體實驗數(shù)據匱乏，其長期服用的人體收益與風險未知，因此，更期待以NAD+為靶點開發(fā)出更多的抗衰老藥物問世，如與NAD+合成或降解相關酶的激活劑或抑制劑、NAD+藥代活性產物等均可能是藥物研究的潛在方向。NAD+的作用機制與有效藥物亟待更多研究來深入闡明與發(fā)掘。