孫梅峰，豆小文，張 磊，車軼群，趙 明，歐陽臻，楊美華

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.國(guó)家癌癥中心，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100021）

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的一類具有高水平生物蓄積效應(yīng)的低分子質(zhì)量的有害次生代謝物［1］。已知真菌毒素種類多達(dá)400余種［2］，廣泛存在于食品、農(nóng)作物、飼料及中藥材中。在一定生態(tài)環(huán)境如溫度、相對(duì)濕度［3-4］和殺菌劑［5］等因素影響下，可導(dǎo)致真菌毒素的產(chǎn)生。其中對(duì)人和動(dòng)物危害大并引起世界多國(guó)高度關(guān)注的主要有黃曲霉毒素（aflatoxins，AF）、赭曲霉毒素（ochratoxin，OT）、嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）、T-2毒素、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、伏馬毒素（fumonisin，F(xiàn)B）和展青霉素（patulin，PAT）等［6］。真菌毒素可通過受污染的糧食、霉變中藥、受侵染飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物等途徑進(jìn)入人類食物鏈，對(duì)人體和動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重危害，主要表現(xiàn)為肝、腎、造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等毒性［7］以及致癌和致畸作用［8-9］。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）根據(jù)危險(xiǎn)程度的高低，在致癌物列表［10］中將真菌毒素分類為Ⅰ類致癌物質(zhì)（AF）和ⅡB 類致癌物質(zhì)（OTA，F(xiàn)B1，F(xiàn)B2）、Ⅲ類致癌物質(zhì)（PAT）等。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織/WHO食品添加劑委員會(huì)多次針對(duì)AF，OTA和FB等真菌毒素進(jìn)行了危險(xiǎn)性分析，并且暫定了每周最大耐受攝入量和每日最大耐受攝入量，世界各國(guó)也針對(duì)真菌毒素制定了限量標(biāo)準(zhǔn)。

真菌毒素發(fā)現(xiàn)至今，于2004-2005年便出現(xiàn)過肯尼亞AF急性中毒事件，因?qū)r(nóng)副產(chǎn)品和中藥真菌毒素污染防控措施有限，導(dǎo)致真菌毒素可通過多種攝入途徑在人體內(nèi)蓄積，進(jìn)而可能引發(fā)其潛在慢性毒性。如今，真菌毒素毒性研究已從單一毒素靶器官損傷深入至多毒素在細(xì)胞、分子水平上的聯(lián)合作用機(jī)制，檢測(cè)技術(shù)也由傳統(tǒng)液相色譜發(fā)展至LC-MS/MS、免疫傳感器、分子印跡等高通量、高靈敏、高特異性的痕量檢測(cè)。通過對(duì)臨床樣本檢測(cè)分析人體實(shí)際攝入量，即可客觀評(píng)價(jià)某種毒素對(duì)人體健康的危害［11］。本文基于文獻(xiàn)研究成果，就單一真菌毒素毒性研究及混合真菌毒素基質(zhì)共存的現(xiàn)狀，對(duì)單一毒性和聯(lián)合毒性研究進(jìn)行歸類分析，簡(jiǎn)析不同類型生物樣本的前處理手段和檢測(cè)方法，以期為體內(nèi)真菌毒素檢測(cè)研究及人體真菌毒素暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

1 典型真菌毒素毒性

1.1 曲霉屬真菌毒素毒性

曲霉屬真菌毒素是研究較多的真菌毒素，按產(chǎn)毒菌類別可分為黃曲霉類、赭曲霉類和雜色曲霉類等。

AF是一類結(jié)構(gòu)相似的二氫呋喃香豆素衍生物，常見種類有AFB1，AFB2，AFG1，AFG2和AFM1等，其中AFB1毒性和致癌性最強(qiáng)，其毒性為氰化鉀的10倍，砒霜的68倍［12］。早在1993年，WHO國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)就將其列為Ⅰ類致癌物質(zhì)。VESEL等［13］通過對(duì)雞胚給藥觀察幾種AF的生長(zhǎng)毒性，發(fā)現(xiàn)AF之間存在毒性差異，其毒性大小依次為：AFB1＞AFG1＞AFM1=AFB2＞AFG2。近期，葛軍華等［14］研究表明，AFB1的心肌毒性可能是通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體損傷以及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生的。徐明芳等［15］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AFB1還可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人胚肝細(xì)胞L-02中晚期凋亡，發(fā)生G0/G1期阻滯，進(jìn)一步豐富了AFB1毒性作用機(jī)制。劉珊等［16］研究顯示，AFB1對(duì)原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞HSF也具有明顯細(xì)胞毒性。

OT主要是由赭曲霉（Aspergillus.ochraceus）、純綠青霉（Penicillum.verrucosum）和炭黑曲霉（A.carbonarius）產(chǎn)生的1-氧代異色滿-7-甲酰胺類化合物，主要有 OTA，OTB，OTC 和OTα［17-18］，其中OTA毒性最大，包括腎毒性、肝毒性、免疫毒性和致癌致畸等［19］。有研究指出，巴爾干地方性腎病可能就與OTA有關(guān)［20］。ZHU等［21］通過ig給予大鼠，進(jìn)一步闡明了OTA是利用miR-122通過細(xì)胞周期蛋白G1/P53通路和BCL-W/胱天蛋白酶3通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生肝毒性。

雜色曲霉毒素是由以雜色曲霉為主的包括構(gòu)巢曲霉、黃曲霉和寄生曲霉等50多種真菌所產(chǎn)生的聚酮類化合物［22］，具有致肝損傷、基因毒性和致癌作用，被IARC歸為ⅡB類致癌物［10］。多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雜色曲霉毒素可以通過抑制T細(xì)胞表達(dá)來削弱免疫系統(tǒng)對(duì)致癌物質(zhì)的監(jiān)測(cè)功能表現(xiàn)出免疫毒性［23-24］。

1.2 鐮刀菌屬真菌毒素毒性

鐮刀菌屬真菌毒素通常按不同結(jié)構(gòu)可分為單端孢霉烯族類、伏馬類和玉米烯酮類等毒素。

單端孢霉烯族毒素是一類倍半萜烯化合物，主要有A，B，C和D 4類分型，其中A和B類較為常見且毒性較大。單端孢霉烯A類毒素種類主要有T-2毒素和HT-2；B類毒素主要有雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，NIV）、DON和鐮刀菌烯酮（fusarenon-X，F(xiàn)u-X）等［25］，其毒性作用主要有生長(zhǎng)毒性、生殖毒性、基因毒性、皮膚毒性及嚴(yán)重的血液毒性［25］。此外，ZHANG等［26］利用小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤（N2a）細(xì)胞研究表明，T-2毒素是通過誘導(dǎo)N2a細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和通過抑制核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1通路和激活P53通路引起細(xì)胞凋亡，從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

FB是主要由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的一類長(zhǎng)鏈多羥基醇丙三酯類水溶性化合物，可引起肝、腎損傷甚至壞死及馬腦白質(zhì)軟化癥、豬肺水腫［27-28］等毒性反應(yīng)。其結(jié)構(gòu)與神經(jīng)鞘氨醇類似，可以阻斷體內(nèi)二氫神經(jīng)酰胺的形成，進(jìn)一步阻斷神經(jīng)酰胺的合成，從而影響鞘脂類物質(zhì)的代謝，擾亂體內(nèi)葉酸的攝取和利用，人體攝入后可能引起食管癌和神經(jīng)管型缺陷?。?9-30］。

ZEN是主要由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的一類具有二羥基苯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)化合物，是世界范圍內(nèi)糧食飼料主要污染物之一，在動(dòng)物源性食品中也有檢出［31］。研究表明，ZEN對(duì)動(dòng)物具有很強(qiáng)的生殖毒性和致畸作用，其生殖毒性主要是由于ZEN具有類雌激素作用，可能與胞漿中雌激素受體高度親和，從而對(duì)雌性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用［32］。

1.3 混合真菌毒素的聯(lián)合毒性

在實(shí)際檢測(cè)研究中，食品及飼料中往往存在不止一種真菌毒素。據(jù)報(bào)道，全球各類商品中污染的真菌毒素有127種［33］，同時(shí)存在的混合真菌毒素主要包括AF+OTA，AF+FB及DON+ZEN，檢出頻率依次為21%，20%和13%。2018年BioMin公司統(tǒng)計(jì)，在全球13 629份樣品中頻繁檢出的真菌毒素為FB，DON和ZEN。在多種真菌毒素共存模式下，其毒性作用遠(yuǎn)比單一毒素毒性簡(jiǎn)單相加更復(fù)雜，真菌毒素毒性之間可能存在拮抗、加和以及協(xié)同等效應(yīng)。JIAN等［34］通過小鼠對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DON和ZEN對(duì)小鼠肝代謝的聯(lián)合毒性弱于單一毒素組，兩者表現(xiàn)出明顯的拮抗作用。李文竹等［35］發(fā)現(xiàn)，DON和AFB1作用于HepG2/C3A細(xì)胞引起的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為加和作用。此外，混合真菌毒素在不同劑量下可能表現(xiàn)不同的相互作用。WAN等［36］利用IPEC-J2細(xì)胞研究鐮刀菌屬類真菌毒素時(shí)發(fā)現(xiàn)，在低濃度DON和NIV聯(lián)合毒性表現(xiàn)出拮抗作用，而在高濃度時(shí)為協(xié)同作用。因此，對(duì)混合真菌毒素聯(lián)合毒性效應(yīng)進(jìn)行深入研究十分必要。

2 生物樣本中典型真菌毒素及其標(biāo)志物檢測(cè)

2.1 樣品前處理

生物體中真菌毒素含量低且樣本基質(zhì)復(fù)雜，為提高檢測(cè)的選擇性和靈敏度，樣品凈化必不可少。生物樣本前處理主要采用的凈化方法有蛋白質(zhì)沉淀（protein precipitation，PPT）、液液萃?。╨iquidliquid extraction，LLE）、固相萃取（solid phase extraction，SPE）、免疫親和凈化（immunoaffinity column，IAC）和直接稀釋（dilute-and-shoot）等1種或2種方法聯(lián)用。

2.1.1 血清和血漿

血漿的組成包括水、蛋白質(zhì)、磷脂、氨基酸和尿酸等有機(jī)物及無機(jī)鹽等［37］。以磷脂酰膽堿為例，作為磷脂類兩性化合物，在電噴霧離子源（ESI）正、負(fù)離子模式下均能引起待測(cè)物離子抑制效應(yīng)［38］，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，蛋白質(zhì)、磷脂大分子去除不完全則會(huì)堵塞色譜柱。因此，在體內(nèi)痕量真菌毒素及其標(biāo)志物檢測(cè)分析中，有效的凈化處理必不可少。目前血漿和血清樣本中主要采用LLE法，或LLE法聯(lián)合SPE或IAC法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行純化富集處理（表1）。其中單一真菌毒素OTA研究最多。萃取溶劑以三氯甲烷、二氯甲烷和乙腈最為常用，尤其是多種真菌毒素及標(biāo)志物共同檢測(cè)研究中，乙腈和乙腈-丙酮混合溶劑作為極性至中等極性化合物的良好溶媒，毒性相對(duì)較小，應(yīng)用最廣。SLOBODCHIKOVA等［39］研究人血漿中17種真菌毒素及其標(biāo)志物時(shí)發(fā)現(xiàn)，與SPE和PPT法相比，三步LLE法能極大程度降低基質(zhì)效應(yīng)的同時(shí)保留良好回收率。此外，LLE法的成本相對(duì)較低，更加經(jīng)濟(jì)。

表1 血清和血漿樣本中真菌毒素的檢測(cè)

目前色譜科技領(lǐng)域的各大公司相繼推出了除磷脂、蛋白質(zhì)的前處理產(chǎn)品如Phree磷脂去除板、Oasis PRiME MCX小柱和Cleanert?PPT 96孔蛋白沉淀板等。與傳統(tǒng)LLE法和PPT法相比，此類產(chǎn)品利用多功能化的復(fù)合吸附材料通過離子交換、反相、氫鍵等原理有效去除磷脂蛋白干擾基質(zhì)，同時(shí)因其96孔板的獨(dú)特設(shè)計(jì)免去了離心和液體轉(zhuǎn)移的繁瑣步驟，大大節(jié)省了前處理時(shí)間，減少了工作量，還能減少上樣量，有望在檢測(cè)血樣真菌毒素及其痕量標(biāo)志物中得以推廣應(yīng)用。

2.1.2 尿液

尿液樣本多以真菌毒素及其代謝標(biāo)志物為研究目標(biāo)，且尿液基質(zhì)干擾以無機(jī)鹽為主。因此，多采用直接稀釋法或過濾稀釋法聯(lián)合SPE柱、IAC柱等前處理方法，以確保最大程度上獲得樣本中的真菌毒素（表2）。痕量檢測(cè)研究中往往需要同時(shí)考慮目標(biāo)物的富集和樣本凈化，AHN等［52］在研究人尿液中的真菌毒素時(shí)，利用IAC柱抓捕靶標(biāo)的特性對(duì)樣本中的目標(biāo)物進(jìn)行凈化富集，并利用同位素內(nèi)標(biāo)的方法進(jìn)行定量分析，方法準(zhǔn)確可行但成本較高。鹽析液液萃?。╯alting-out liquid-liquid extraction，SALLE）利用鹽析原理促進(jìn)均相溶液分層達(dá)到對(duì)待測(cè)物分離凈化的目的，適合常規(guī)LLE法無法萃取的親水性目標(biāo)物，RODRíGUEZ-CARRASCO等［53］在分析人尿液樣本中10種鐮刀菌毒素及其代謝物水平時(shí)，對(duì)比了分散液液微萃?。╠ispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）和鹽析液液萃?。╯altingout liquid-liquid extraction，SALLE）法。結(jié)果表明，SALLE法提取效率優(yōu)于DLLME法，回收率84%～96%，同時(shí)成本也比DLLME法更經(jīng)濟(jì)。

表2 尿液樣本中真菌毒素的檢測(cè)

2.1.3 組織器官

組織器官中除真菌毒素及其代謝物外還有毒素加合物的存在，且基質(zhì)相比其他體內(nèi)樣本復(fù)雜。因此，器官組織中真菌毒素研究多采用均質(zhì)法處理樣本，以正己烷等非極性溶劑脫除脂肪干擾，并加入酸或酶等促使加合物（如AFB1-DNA加合物：AFB1-甲酰嘧啶和iro-AFB1-DNA等；AFB1-白蛋白加合物等）還原為毒素原型，再利用LLE法聯(lián)合IAC和SPE等凈化樣本（表3）。游麗娜等［64］利用β-葡萄糖苷酸/硫酸酯復(fù)合酶對(duì)樣本酶解后，利用LLE法聯(lián)用IAC進(jìn)行處理，對(duì)雞蛋中6種玉米赤霉烯醇類化合物殘留進(jìn)行檢測(cè)，方法靈敏度高，重現(xiàn)性好。李玉平等［58］在測(cè)定OTA時(shí)對(duì)豬腎組織進(jìn)行酸解、萃取等步驟后，采用IAC進(jìn)行凈化處理。

2.2 檢測(cè)技術(shù)

2.2.1 薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）

自20世紀(jì)60-70年代，有關(guān)真菌毒素問題進(jìn)入人類視線，10年間與其有關(guān)的研究方法大多基于AF自然熒光的TLC法及溶劑提取優(yōu)化［79］。魏潤(rùn)蘊(yùn)等［80］建立了豬組織中OTA的TLC測(cè)定方法，利用甲醇-水-碳酸氫鈉提取豬組織中OTA，經(jīng)過石油醚、三氯甲烷萃取凈化后，采用雙向展開法對(duì)樣品進(jìn)行分析。由于TLC法檢測(cè)效率低，試劑易揮發(fā)，靈敏度有待提高，其應(yīng)用在生物樣本中已鮮有報(bào)道。

2.2.2 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）

HPLC也稱高壓液相色譜，區(qū)別于紙色譜、TLC等經(jīng)典液相色譜法。因其高靈敏度、高自動(dòng)化、特異性強(qiáng)、分析效率高等特點(diǎn)而被廣泛用于體內(nèi)微量真菌毒素檢測(cè)。方曉明等［81］基于玉米赤霉醇（zearalanone，ZAN）262 nm處具有紫外吸收，利用二極管陣列檢測(cè)器（photo-diode array，PDA）建立了一種HPLC測(cè)定雞肝中ZAN的方法。SANGARE-TIGORI等［82］利用OTA的熒光特性，采用熒光檢測(cè)器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）檢測(cè)，在22名（34.9%）健康志愿者中檢出OTA平均含量為0.83 μg·L-1；在8名（20.5%）腎病患者體內(nèi)檢出OTA，平均含量是1.05 μg·L-1?；谧贤饣驘晒鈾z測(cè)方法的前提是樣本中待測(cè)真菌毒素或其衍生物具有可引起紫外吸收或產(chǎn)生熒光光譜的化學(xué)官能團(tuán)，然而，并不是所有真菌毒素具備上述條件。因此，HPLC-PDA或FLD在生物樣本中痕量真菌毒素及其代謝標(biāo)志物的檢測(cè)應(yīng)用存在局限性。

表3 器官組織中真菌毒素的檢測(cè)

2.2.3 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）不僅具備液相色譜法的準(zhǔn)確定量、高分離效能等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)利用質(zhì)譜的高靈敏度、可定性和高特異性等特點(diǎn)，彌補(bǔ)了液相色譜法無法準(zhǔn)確定性的缺點(diǎn)，提高了方法適用性，為檢測(cè)多種毒素提供了同時(shí)定量定性的方法，因此在生物樣本中應(yīng)用廣泛。QIU等［83］利用UPLC-MS/MS分析國(guó)內(nèi)15個(gè)省份的母乳中10種真菌毒素的暴露水平。結(jié)果表明，我國(guó)母乳中真菌毒素含量總體處于較低水平，但仍有AFB1和AFM1等6種真菌毒素檢出。WANG等［84］建立了LC-MS/MS檢測(cè)動(dòng)物血漿中21種真菌毒素及其代謝產(chǎn)物方法，可同時(shí)對(duì)樣本中多種真菌毒素進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，但所需個(gè)體樣本量（2 mL）較大，不適用人體暴露情況的分析研究。LC-MS/MS法相比HPLC-PDA或FLD法，靈敏度有很大改善，但實(shí)際人體樣本研究中，如何降低樣本采樣量并兼顧其檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性仍是體內(nèi)分析的研究熱點(diǎn)。BERND等［85］開發(fā)了無創(chuàng)采集樣品制備方法，將血液或血清樣本100 μL收集于濾紙卡上干燥保存，建立了人血液樣本中27種真菌毒素及代謝物HPLCMS/MS檢測(cè)方法，該法的樣品制備過程具有無創(chuàng)、制備簡(jiǎn)單、成本損耗低和儲(chǔ)存便利等特點(diǎn)。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）主要用于測(cè)定具有熱穩(wěn)定性、揮發(fā)性以及化學(xué)衍生的非揮發(fā)性真菌毒素，因此具有一定局限性。BLOKLAND等［56］用GC-MS對(duì)牛尿液中的ZAN及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)定。RODRíGUEZ等［53］基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用建立了一種檢測(cè)人尿液中10種鐮刀菌屬真菌毒素及其代謝物的高靈敏度、定量、定性準(zhǔn)確的方法。

2.2.4 免疫分析法

近年來，隨著真菌毒素抗體制備技術(shù)的發(fā)展，基于免疫分析原理的快速篩查方法及傳感技術(shù)已逐漸應(yīng)用到體內(nèi)真菌毒素的檢測(cè)中。以示蹤標(biāo)記物分類，體內(nèi)生物標(biāo)志物免疫分析法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）和放射免疫測(cè)定法（radioimmunoassay，RIA）。

ELISA采用酶高效催化實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大標(biāo)記，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、成本低的優(yōu)點(diǎn)。PESTKA等［86］利用ELISA快速、靈敏的特點(diǎn)，對(duì)大鼠體內(nèi)DON代謝分布情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)研究。此外，有關(guān)伊朗等國(guó)家地區(qū)共計(jì)183例母乳中OTA，AFM1和ZEN等真菌毒素暴露情況的研究也采用了ELISA［87-88］，該方法最大的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)易的前處理方式，無需復(fù)雜的樣品凈化、富集等處理即能達(dá)到良好的靈敏度；所需的樣本量較少（＜100 μL），適用于大樣本量的篩選檢測(cè)。

TRFIA是將具有特殊熒光的鑭系離子與螯合劑結(jié)合標(biāo)記抗原、抗體、蛋白等作為信號(hào)源，經(jīng)過生物識(shí)別反應(yīng)（抗原抗體的特異性結(jié)合、核酸探針的雜交反應(yīng)等），利用時(shí)間分辨熒光儀通過測(cè)定熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量分析［89-90］。TRFIA法具有測(cè)量范圍寬、檢測(cè)效率高、重復(fù)性好等特點(diǎn)［91-93］，已應(yīng)用于臨床腫瘤標(biāo)志物CA19-9和乙型肝炎病毒（HBV）等研究［91，94-95］。在真菌毒素的檢測(cè)中也有廣闊的應(yīng)用前景。TANG等［96］首次利用抗特異性納米與單抗結(jié)合的方式，建立了2種具有競(jìng)爭(zhēng)性的時(shí)間分辨條帶法用于檢測(cè)玉米制品中的AF和ZEN。結(jié)果顯示，方法定量可靠，靈敏度高且避免了劇毒抗原的使用。

RIA是通過同位素標(biāo)記的和未標(biāo)記的抗原同抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)，通過測(cè)量反應(yīng)后反應(yīng)產(chǎn)物放射性而求得未標(biāo)記抗原（目標(biāo)物）含量的分析方法。孫桂菊等［97］建立了一種敏感特異的AFB1-白蛋白加合物（AFB1-ALB）的測(cè)定方法，利用Microcon-50微型濃縮器對(duì)白蛋白快速分離，最后制得的樣品用液體閃爍儀進(jìn)行檢測(cè)，該法通過裝置內(nèi)的酶解消化，減少了轉(zhuǎn)移損耗，提高了回收率和分析方法的準(zhǔn)確性。唐耘天等［98］采用RIA法探究了肝癌高危人群中AFB1-ALB水平和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的基因多態(tài)性之間的關(guān)系。結(jié)果表明，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的基因多態(tài)性在決定AF暴露水平上起重要作用，方法靈敏度雖高，但操作步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，穩(wěn)定性不佳。

2.2.5 其他檢測(cè)技術(shù)

隨現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展，傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)不斷完善的同時(shí)誕生了諸多快速檢測(cè)技術(shù)，如適配體（aptamer）傳感器技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)（phage display technology，PDT）、膠體金技術(shù)等。

適配體傳感器技術(shù)，是以通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），從人工合成的寡核苷酸文庫中篩選得到的能夠與靶分子高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸配基作為核心部件的檢測(cè)技術(shù)。因其在高溫和不良環(huán)境下的穩(wěn)定性、靶分子類型無限制、無免疫原性、無毒等特性被廣泛應(yīng)用于各類研究，大量基于OTA的適配體生物傳感器已有報(bào)道，但在體內(nèi)樣本的檢測(cè)應(yīng)用鮮有報(bào)道。DINCKAYA等［99］通過電化學(xué)阻抗譜和循環(huán)伏安法測(cè)量結(jié)合在胱胺層中的適配體修飾的金納米粒子的相互作用，檢測(cè)了牛奶中的AFM1。搭建的生物傳感器特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性和再現(xiàn)性良好，可用于實(shí)際樣本的檢測(cè)分析，但電化學(xué)阻抗譜的方法相對(duì)耗時(shí)，傳感器的搭建和使用較為精細(xì)，因此在推廣使用上還存在一定局限性。

PDT是以噬菌體或噬菌粒為載體，通過基因工程技術(shù)使外源肽或蛋白隨噬菌體外殼蛋白一同表達(dá)在噬菌體表面的技術(shù)，PDT利用眾多的單一融合型噬菌體組成的噬菌體展示庫來實(shí)現(xiàn)高通量的篩選［100］。PDT篩選得到的真菌毒素模擬抗原表位代替真菌毒素偶聯(lián)抗原建立的免疫學(xué)檢測(cè)方法，不僅增加了人員的操作安全，而且降低了成本。WANG等［101］利用PDT制備的AF無毒替代抗原的納米抗體Phage2-5建立AF的ELISA檢測(cè)方法，方法靈敏度高，基質(zhì)效應(yīng)低，且對(duì)甲醇、鹽離子的耐受能力強(qiáng)。WANG等［102］同樣利用PDT獲得了對(duì)黃曲霉毒素具有高度反應(yīng)的PO8-VHH抗體，并開發(fā)了一種高選擇性的納米抗體夾心ELISA用于快速檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中的曲霉菌。PDT與其他生物檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合為同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素提供了更廣闊的前景。

3 結(jié)語

真菌毒素發(fā)現(xiàn)至今，在各類農(nóng)副產(chǎn)品及中藥材中均有檢出的報(bào)道，隨真菌毒素毒性作用研究的深入，其危害風(fēng)險(xiǎn)受到了越來越多的重視，世界各國(guó)政府均對(duì)真菌毒素制定了相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)作為中藥使用大國(guó)，對(duì)中藥中真菌毒素也制定了相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法。

日常生活中，人和動(dòng)物難免會(huì)攝入真菌毒素并通過吸收代謝在體內(nèi)蓄積，最終對(duì)人和動(dòng)物健康產(chǎn)生危害。因此，人們逐步展開了對(duì)真菌毒素暴露情況的研究。由于人與動(dòng)物復(fù)雜的食物鏈和代謝系統(tǒng)，體內(nèi)通常存在一種以上的真菌毒素。但由于基質(zhì)效應(yīng)以及其他影響因素存在，從體內(nèi)檢出的真菌毒素及其代謝物種類有限，因此針對(duì)不同生物樣本和研究目標(biāo)，采取高效的前處理手段和檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要。合適的前處理方法不僅可提高方法回收率，簡(jiǎn)化操作步驟，節(jié)約成本，還可降低基質(zhì)效應(yīng)影響，提高方法靈敏度。目前最為普遍的前處理方法是一步法的LLE或LLE與柱凈化聯(lián)用的兩步法。常用的萃取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮和甲醇等。而根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的檢測(cè)技術(shù)有利于提高方法靈敏度和重復(fù)性。LC-MS/MS因其出色的分離能力、定性能力、廣泛的適用性以及高靈敏度成為目前對(duì)多目標(biāo)同時(shí)進(jìn)行高效定量、定性檢測(cè)的常用方法之一。生物傳感器技術(shù)等快檢技術(shù)的興起，為體內(nèi)樣本真菌毒素快速檢測(cè)提供了研究方向。同時(shí)為進(jìn)一步研究人體真菌毒素暴露情況，應(yīng)嘗試向樣本制備的低成本和微量樣本，檢測(cè)技術(shù)的高通量和高特異性等方面進(jìn)行突破。