來麗葉，智翠娜，傅娟玲，趙 鵬，姚碧云

（北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系，食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

稀土因其獨(dú)特的理化性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，工業(yè)，電子和醫(yī)藥等行業(yè)，致使土壤、飲用水和食物中均可檢出較高含量的稀土元素，最終通過皮膚、消化道和呼吸道等多種途徑進(jìn)入人體，并通過血液分布于多種組織器官內(nèi)［1］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高暴露稀土礦區(qū)兒童的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力顯著下降，其神經(jīng)毒性及其機(jī)制得到人們的普遍關(guān)注［2-3］。鑭（lanthanum，La）作為輕稀土元素的代表，化學(xué)性質(zhì)活潑，具有較強(qiáng)的生物活性，從而廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，同時(shí)稀土元素鹽類中硝酸鹽類毒性最強(qiáng)，因此硝酸鑭〔La（NO3）3〕是研究稀土毒作用的代表物質(zhì)［4-5］。有研究表明，稀土鑭可通過血腦屏障使動(dòng)物海馬功能受損，并誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生氧化應(yīng)激及凋亡等，表明La可以在腦中蓄積并發(fā)揮毒性作用［6］。

有研究發(fā)現(xiàn)，稀土元素所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷可能與氧化應(yīng)激有關(guān)［7］。正常情況下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成速度受線粒體膜電位的控制，當(dāng)ROS產(chǎn)生過多時(shí)，可氧化線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）上相應(yīng)的氧化還原敏感位點(diǎn)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降及線粒體膜通透性的增加，從而引起線粒體功能障礙［8］。細(xì)胞自噬是真核生物中依賴溶酶體對(duì)錯(cuò)誤折疊的蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解的重要途徑，以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝和功能的穩(wěn)定［9-10］。根據(jù)自噬對(duì)底物的選擇可分為選擇性和非選擇性自噬，線粒體自噬是特異性清除受損線粒體的過程。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬和PTEN誘導(dǎo)的假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在多種神經(jīng)疾病中發(fā)揮重要作用，其早期可能具有保護(hù)效應(yīng)，而晚期可能引起神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡［11］。本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SK-N-SH）細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察La（NO3）3對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激、線粒體膜電位和自噬的影響以及鑭的神經(jīng)毒性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

La（NO3）3·6H2O、胰蛋白酶和二甲亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），噻唑藍(lán)（MTT）和質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（美國(guó)Genview公司），過氧化氫（H2O2）、碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP）、ROS 檢測(cè)試劑盒和JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司），兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（micro-tubule associated protein 1 light chain 3，LC3）和P62單抗（美國(guó)Abcam公司），兔抗人Parkin單抗和小鼠抗人PINK1單抗（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），小鼠抗人β肌動(dòng)蛋白單抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

MCo-15AC CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司），F(xiàn)ACS Calibur雙激光流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），TCS SP8 MP FLIM激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司），垂直板蛋白電泳及轉(zhuǎn)印裝置（北京六一儀器），Tanon 4500數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.2 SK-N-SH細(xì)胞培養(yǎng)

SK-N-SH細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心）在37℃，5% CO2飽和濕度條件下，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并定期按比例傳代。

1.3 MTT法檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞存活率

將SK-N-SH細(xì)胞以8×107L-1密度接種于96孔板中，每孔100 μL。La（NO3）30.125，0.25，0.5，1.0，2.0和4.0 mmol·L-1處理細(xì)胞24 h，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組。每孔加MTT 1.0 mmol·L-1溶液100 μL，培養(yǎng)4 h后形成藍(lán)紫色結(jié)晶，棄上清并加DMSO 100 μL，置搖床上振蕩5 min使結(jié)晶完全溶解。在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（A570nm）值。細(xì)胞存活率（%）=處理組A570nm/細(xì)胞對(duì)照組A570nm×100%。

1.4 細(xì)胞分組

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，以3×108L-1密度接種于6孔板中，每孔2 mL。結(jié)合 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取 La（NO3）30.5，1.0 和2.0 mmol·L-1處理SK-N-SH細(xì)胞24 h，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組，進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)活性氧含量

細(xì)胞處理同1.4，同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照H2O2600 μmol·L-1組，處理30 min。胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗2次后，加DCFH-DA 10 μmol·L-1的無血清培養(yǎng)液2 mL，恒溫箱中培養(yǎng)30 min后將細(xì)胞重懸于300 μL PBS，轉(zhuǎn)移至流式專用測(cè)定管，在激發(fā)波長(zhǎng)502 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm附近，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度以表示ROS相對(duì)含量，每組至少收取10 000個(gè)細(xì)胞。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞線粒體膜電位

細(xì)胞處理同1.4，同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照CCCP 10 μmol·L-1組，處理 30 min。胰酶消化并收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗2次，每組重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中（含血清和酚紅），再加入0.5mL JC-1工作液（1×），37℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min。JC-1染色緩沖液（1×）洗滌細(xì)胞2次后，300 μL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果中，橫坐標(biāo)代表綠色熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)代表紅色熒光強(qiáng)度。發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞所占比例表示相對(duì)線粒體膜電位，同時(shí)兩者成反比。每組至少收取10 000個(gè)細(xì)胞。

1.7 激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬體

無菌環(huán)境下，綠色熒光標(biāo)記的LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化復(fù)蘇后的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB培養(yǎng)基過夜振蕩培養(yǎng)，質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取細(xì)菌培養(yǎng)液中的高純度質(zhì)粒DNA。將細(xì)胞以3×108L-1密度接種于激光共聚焦皿中培養(yǎng)24 h，將2 μg質(zhì)粒DNA稀釋于100 μL Opti-MEM中，充分混勻后制成DNA稀釋液，然后加2 μL NeofectTM，混勻并靜止30 min，最終將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中混勻培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分組處理見1.4，激光共聚焦顯微鏡下每組別至少選取50個(gè)細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量。

1.8 Western印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞處理同1.4，采用RIPA裂解液提取細(xì)胞全蛋白，Bradford法測(cè)定各蛋白樣品的濃度，與5×SDS加樣緩沖液以4∶1混合后，水浴煮沸5 min變性。取等量蛋白樣品（30 μg）經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕式電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜），麗春紅染色后根據(jù)分子marker準(zhǔn)確切取所需條帶。室溫封閉2 h后，依次加LC3，P62，Parkin和PINK1一抗（1∶500），4℃過夜。TBST清洗后加入二抗（1∶1000）室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光后于暗室內(nèi)依次曝光、顯影及定影。Image J軟件分析各條帶積分吸光度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的積分吸光度值比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 硝酸鑭對(duì)SK-N-SH細(xì)胞存活率的影響

MTT結(jié)果顯示（表1），與細(xì)胞對(duì)照組相比，La（NO3）3≤0.5 mmol·L-1組細(xì)胞存活率無明顯改變，La（NO3）31.0，2.0和4.0 mmol·L-1組細(xì)胞存活率均顯著低于細(xì)胞對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）。La（NO3）3的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為（2.54±0.37）mmol·L-1，本研究最終選取La（NO3）30.5，1.0和2.0 mmol·L-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab.1 Effect of lanthanum nitrate〔La（NO3）3〕on cell viability of SK-N-SH cells by MTT assay

2.2 硝酸鑭對(duì)SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示（圖1），與細(xì)胞對(duì)照組相比，La（NO3）30.5 mmol·L-1組ROS含量無顯著改變，La（NO3）31.0和2.0 mmol·L-1組及H2O2陽性對(duì)照組SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)ROS含量均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 硝酸鑭對(duì)SK-N-SH細(xì)胞線粒體膜電位的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示（圖2），與細(xì)胞對(duì)照組（10±4）%相比，La（NO3）30.5，1.0和2.0 mmol·L-1組及陽性對(duì)照CCCP 10 μmol·L-1組呈綠色熒光的細(xì)胞比例分別為（15±4）%，（23±4）%，（24±3）%和（30±6）%，表明各處理組細(xì)胞膜電位均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Effect of La（NO3）3on content of reactive oxygen species（ROS）in SK-N-SH cells by flow cytometry（FCM）.The cells were treated with La（NO3）30.5，1.0 and 2.0 mmol·L-1for 24 h and also treated with H2O2600 μmol·L-1for 30 min as positive control.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

Fig.2 Effect of La（NO3）3on mitochondrial membrane potential in SK-N-SH cells by FCM.The cells were treated with La（NO3）30.5，1.0 and 2.0 mmol·L-1for 24 h and also treated with carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone（CCCP）10 μmol·L-1 for 30 min as positive control，then cells were analyzed by FCM after being stained with JC-1.The proportion of cells emitting green fluorescence was inversely proportional to the relative mitochondrial membrane potential.x ± s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.4 硝酸鑭對(duì)SK-N-SH細(xì)胞自噬體數(shù)量的影響

激光共聚焦結(jié)果顯示（圖3），細(xì)胞對(duì)照組綠色熒光多呈彌散分布，自噬體數(shù)量較少，為（11±5）%，而La（NO3）30.5，1.0和2.0 mmol·L-1處理組細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量明顯增加，數(shù)量分別為（31±7），（38±5）和（42±4），均顯著高于細(xì)胞對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.3 Effect of La（NO3）3on number of autophagosomes in SK-N-SH cells by laser scanning confocal microscope.The cells were transfected with green fluorescent protein-labeled micro-tubule associated protein 1 light chain 3（LC3）plasmid for 24 h，then cells were treated with La（NO3）3 0.5，1.0 and 2.0 mmol·L-1for 24 h.Arrows show the autophagosomes.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.5 硝酸鑭對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3，P62，Parkin和PlNK1蛋白表達(dá)水平的影響

Western印跡結(jié)果顯示（圖4），與細(xì)胞對(duì)照組相比，La（NO3）30.5，1.0和2.0 mmol·L-1處理組細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Parkin和PINK1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），P62蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of La（NO3）3on protein expressions of LC3，P62，Parkin and PTEN-induced putative kinase 1（PlNK1）and ration LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ in SK-N-SH cells by Western blotting.The cells were treated with La（NO3）30.5，1.0 and 2.0 mmol·L-1for 24 h.B and C were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，La（NO3）3≥1.0 mmol·L-1時(shí)，SK-N-SH細(xì)胞存活率顯著降低，存在明顯的細(xì)胞毒性。La（NO3）3可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高從而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的氧化損傷，并通過線粒體膜電位的降低從而誘導(dǎo)線粒體功能障礙，同時(shí)可增強(qiáng)SK-N-SH細(xì)胞自噬和線粒體自噬水平。

氧化應(yīng)激是La致神經(jīng)細(xì)胞功能受損的重要因素，La可使大腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)活性氧水平升高并導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞形態(tài)損傷，同時(shí)可降低超氧化物歧化酶活力［12-13］。ROS可誘導(dǎo)MPTP由周期性開放變?yōu)槌掷m(xù)性開放，從而導(dǎo)致線粒體膜電位下降及線粒體膜通透性的增加，最終誘導(dǎo)胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)和不可逆的細(xì)胞凋亡，線粒體通透性孔道的開放可進(jìn)一步釋放出大量ROS，加劇孔道的打開從而導(dǎo)致細(xì)胞和線粒體的損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，La（NO3）30.5，1.0 和2.0 mmol·L-1可誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高，線粒體膜電位降低，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙。線粒體膜電位降低可進(jìn)一步激活PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，PINK1可選擇性募集至損傷的線粒體表面，通過其激酶活性磷酸化下游的Parkin，損傷的線粒體被特異性包裹進(jìn)自噬體中，并與溶酶體融合以完成線粒體降解的過程［15-16］。本研究結(jié)果顯示，一定濃度La（NO3）3可誘導(dǎo)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的發(fā)生，從而特異性清除功能受損的線粒體。

La具有促進(jìn)神經(jīng)元自噬的能力，同時(shí)La能引起大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生過度氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量ROS，從而激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起下游自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平升高并增加自噬流強(qiáng)度［17-18］。本研究結(jié)果顯示，一定濃度的La（NO3）3可誘導(dǎo)SK-NSH細(xì)胞自噬體數(shù)目的明顯增多。但綠色自噬體斑點(diǎn)增多并不一定代表自噬活性增強(qiáng)，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻，可通過LC3與P62驗(yàn)證。自噬過程中，LC3分子構(gòu)象改變，由胞漿型LC3-Ⅰ進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型LC3-Ⅱ，P62在自噬溶酶體通路中，作為特異性底物被降解。當(dāng)LC3-Ⅱ/Ⅰ升高，P62同時(shí)降低，表明自噬流通暢，當(dāng)LC3-Ⅱ/Ⅰ升高，P62升高，表明自噬起始正常，但下游不通，吞噬體與溶酶體不能融合，因此LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值及P62蛋白的表達(dá)水平可表征及衡量自噬的發(fā)生及水平［19］。本研究結(jié)果顯示，一定濃度的La（NO3）3能增高SK-N-SH細(xì)胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值并降低P62蛋白的表達(dá)，表明細(xì)胞自噬流通暢，La（NO3）3可增強(qiáng)細(xì)胞的自噬水平。

綜上所述，La（NO3）3可一定程度地誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的氧化損傷和線粒體功能障礙并增強(qiáng)細(xì)胞自噬和線粒體自噬水平。確切機(jī)制及自噬對(duì)細(xì)胞作用有待進(jìn)一步探討。