田勇，姚素艷，薛慕巍，鄭德宇

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；2.大連瓦房店中心醫(yī)院骨外科，遼寧 大連 116300；3.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，遼寧 錦州 121000；4.大連瓦房店中心醫(yī)院檢驗科，遼寧 大連 116300)

施萬細(xì)胞(schwann cells，SCs)在周圍神經(jīng)的修復(fù)和再生中起到至關(guān)重要的作用，但SCs作用的發(fā)揮需要依賴適宜的神經(jīng)纖維微環(huán)境[1]。自從1994年Gold就提出了FK506具有促進(jìn)神經(jīng)再生作用[2]后，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)FK506能保護(hù)SCs[3]并促進(jìn)SCs增殖以及其相應(yīng)的NGF、Slit2[4]的分泌；FK506能明顯減少神經(jīng)損傷修復(fù)后神經(jīng)內(nèi)膠原纖維的含量和瘢痕的面積，顯著提高神經(jīng)再生的速度和再生神經(jīng)的質(zhì)量，促進(jìn)周圍神經(jīng)再生使神經(jīng)功能加速恢復(fù)[5]。體外的實驗結(jié)果表明隨著FK506劑量的加大，促進(jìn)SCs的增殖作用越來越明顯，但當(dāng)FK506劑量加大到400 mM后，施萬細(xì)胞出現(xiàn)活性下降甚至凋亡[6]。

神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中。有研究表明[7]，抑制GFAP的表達(dá)具有促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的作用。

神經(jīng)絲蛋白(neuro filament 200，NF200)，是NF家族的一員，主要存在于神經(jīng)元的軸突中。以往的研究表明[8]，正常大鼠的神經(jīng)元中并沒有NF200表達(dá)，但脊髓損傷后由神經(jīng)元大量合成，并聚集于受損區(qū)域，參與神經(jīng)的修復(fù)再生[9]。

跨膜糖蛋白Nogo-A是勿動蛋白(Nogo蛋白)的一種，由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，具有很強(qiáng)的抑制軸突生長作用[10-11]，并且能穩(wěn)定和恢復(fù)神經(jīng)元纖維骨架，來實現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定[12]。

本文選用在神經(jīng)修復(fù)過程中具有一定作用的GFAP、NF200和Nogo-A 3種施萬細(xì)胞相關(guān)蛋白，探討FK506誘導(dǎo)對大鼠施萬細(xì)胞的增殖分泌功能的促進(jìn)作用，旨在為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)再生的研究提供新的思路，同時也為臨床上早日解除患者周圍神經(jīng)損傷的病痛提供可行的想法。

1 材料與方法

1.1 施萬細(xì)胞RSC96細(xì)胞株的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)和分組

無菌條件下常規(guī)復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)RSC96細(xì)胞株(中橋新舟)，實驗分為空白對照組即RSC96細(xì)胞繼續(xù)正常培養(yǎng)，F(xiàn)K506誘導(dǎo)組即在RSC96細(xì)胞株培養(yǎng)基中加入FK506(終濃度100 μM)和溶劑對照組即RSC96細(xì)胞培養(yǎng)基中加入相同體積的FK506的溶劑—DMSO。分別于FK506誘導(dǎo)1 d和14 d后，收集細(xì)胞提取RNA或進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。

1.2 RT-PCR檢測施萬細(xì)胞GFAP、NF200及Nogo-A基因mRNA的表達(dá)

收集細(xì)胞，根據(jù)說明書利用高純總RNA快速提取試劑盒(BioTeke)提取細(xì)胞的總RNA，并調(diào)整RNA含量至3組一致，應(yīng)用real time-PCR擴(kuò)增目的基因，三個目的基因的引物如表1，反應(yīng)體系為SYBR GREEN mastermix 10 μL，上、下游引物(10 μM) 各0.5 μL，cDNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件，預(yù)變性(95 ℃，10 min)，循環(huán)為變性(95 ℃，10 s)、退火(60 ℃，20 s)、延長(72 ℃，30 s)，共40個循環(huán)，使用熒光定量儀進(jìn)行檢測析。

表1 引物序列表

1.3 免疫組化檢測施萬細(xì)胞GFAP、NF200及Nogo-A蛋白的表達(dá)

按試劑盒的要求常規(guī)進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，DAB顯色。一抗的稀釋比例為GFAP(1∶200)、NF200(1∶50)和Nogo-A(1∶40)，二抗均為生物素化生物素化山羊抗兔IgG。使用顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，染色效果，200倍時進(jìn)行拍照彩圖。每組復(fù)染3次，每次隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包。采用χ2分析和q檢驗，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 施萬細(xì)胞倒置相差顯微鏡觀察

鏡下可見，復(fù)蘇傳代的施萬細(xì)胞形態(tài)為雙極長梭形，呈并排或尖對尖排列，可聚集成簇，細(xì)胞核卵圓形，在形態(tài)上未見異常。FK506誘導(dǎo)劑組中的細(xì)胞經(jīng)過14 d的誘導(dǎo)培養(yǎng)，以相同密度接種后，傳代時間約為2.5 d，而其他兩個對照組大約需要3～3.5 d，見圖1。

2.2 FK506對施萬細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響

應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，在空白對照組和溶劑對照組中RSCs的GFAP基因mRNA表達(dá)量在培養(yǎng)1 d和14 d時幾乎沒有變化，而在FK506誘導(dǎo)組，培養(yǎng)14 d的RSCs中GFAP基因的mRNA表達(dá)量明顯高于培養(yǎng)1 d。培養(yǎng)1 d后，F(xiàn)K506誘導(dǎo)組SCs 的GFAP基因mRNA表達(dá)比空白對照組和溶劑對照組只略有升高，見圖2A；而FK506誘導(dǎo)14 d后，F(xiàn)K506誘導(dǎo)組SCs 的GFAP的mRNA相對表達(dá)量升高超過3倍，高達(dá)3.73，明顯高于兩對照組(P<0.01)，見圖2B。

A：空白對照組；B：FK506誘導(dǎo)劑組；C：溶劑對照組

A：為誘導(dǎo)1 d；B：誘導(dǎo)14 d；數(shù)據(jù)為均數(shù)的比較，** P<0.01

在顯微鏡下，各組中均可見散在胞漿呈棕褐色的GFAP陽性細(xì)胞。在空白對照組和溶劑對照組中RSCs的GFAP陽性細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)1 d和14 d時幾乎沒有變化，而在FK506誘導(dǎo)組，培養(yǎng)14 d的RSCs中GFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于培養(yǎng)1 d(P<0.05)。培養(yǎng)1 d后，在FK506誘導(dǎo)組的SCs中GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量與空白對照組或溶劑對照組比均無明顯差異，見圖3。而在培養(yǎng)14 d后，F(xiàn)K506誘導(dǎo)組的施萬細(xì)胞中GFAP蛋白的陽性細(xì)胞明顯多于空白對照組或溶劑對照組(P<0.05)。

2.3 FK506對施萬細(xì)胞NF200 基因mRNA表達(dá)的影響

應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，在空白對照組和溶劑對照組中RSCs的NF200基因mRNA表達(dá)量在培養(yǎng)1 d和14 d時幾乎沒有變化，而在FK506誘導(dǎo)組，培養(yǎng)14 d的RSCs中NF200基因的mRNA表達(dá)量明顯高于培養(yǎng)1 d。培養(yǎng)1 d后，在FK506誘導(dǎo)組的施萬細(xì)胞中 NF200基因的mRNA表達(dá)量與兩對照組相比幾乎沒有變化，而在溶劑對照組卻略有降低，見圖4A。培養(yǎng)14 d后，在FK506誘導(dǎo)組的RSCs中NF200基因的mRNA相對表達(dá)量達(dá)到2.31，明顯高于空白對照組或溶劑對照組(P<0.01)，見圖4B。

在顯微鏡下，各組細(xì)胞爬片中均可見散在胞漿呈棕褐色的NF200蛋白陽性細(xì)胞。在空白對照組和溶劑對照組中RSCs的NF200陽性細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)1 d和14 d時幾乎沒有變化，而在FK506誘導(dǎo)組，培養(yǎng)14 d的RSCs中NF200陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于培養(yǎng)1 d(P<0.05)。培養(yǎng)1 d后，SCs在FK506誘導(dǎo)組的NF200蛋白陽性細(xì)胞數(shù)量與空白對照組或溶劑對照組均無明顯差異，這一結(jié)果與NF200基因的mRNA表達(dá)趨勢一致。培養(yǎng)14 d后，在FK506誘導(dǎo)組中NF200的陽性細(xì)胞數(shù)量(達(dá)到161)明顯高于空白對照組或溶劑對照組的NF200陽性細(xì)胞數(shù)(P<0.05)，這一檢測結(jié)果也與NF200基因的mRNA表達(dá)結(jié)果一致，見圖5，P>0.05。

A：誘導(dǎo)1 d；B：誘導(dǎo)14 d；數(shù)據(jù)為均數(shù)的比較，** P<0.01

圖5 NF200蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)量

2.4 FK506對施萬細(xì)胞Nogo-A 基因表達(dá)的影響

應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，在空白對照組和溶劑對照組中RSCs的NF200基因mRNA表達(dá)量在培養(yǎng)1 d和14 d時幾乎沒有變化，而在FK506誘導(dǎo)組，培養(yǎng)14 d的RSCs中NF200基因的mRNA表達(dá)量明顯低于培養(yǎng)1 d。培養(yǎng)1 d后，在FK506誘導(dǎo)組的RSCs中Nogo-A基因的mRNA表達(dá)較空白對照組相升高較明顯(P<0.01)，在溶劑對照組中Nogo-A的mRNA的表達(dá)量卻較空白對照組稍稍降低，見圖6A。在14 d培養(yǎng)后，F(xiàn)K506誘導(dǎo)組的RSCs中Nogo-A基因的mRNA相對表達(dá)量降低到0.23，明顯低于空白對照組或溶劑對照組(P<0.01)，見圖6B。

圖6 FK506誘導(dǎo)SCs的Nogo-A基因mRNA表達(dá)

在顯微鏡下，各組中均可見散在胞漿呈棕褐色的Nogo-A蛋白陽性細(xì)胞。在空白對照組和溶劑對照組中RSCs的Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)14 d時明顯多于培養(yǎng)1 d，而在FK506誘導(dǎo)組，培養(yǎng)14 d和培養(yǎng)1 d的RSCs中Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)幾乎沒有變化(P<0.05)。培養(yǎng)1 d后，F(xiàn)K506誘導(dǎo)組的RSCs中Nogo-A蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于空白對照組或溶劑對照組(P<0.05)。在培養(yǎng)14 d后，F(xiàn)K506組的SCs中Nogo-A蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)量略低于空白對照組，二者間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，卻明顯少于溶劑對照組(P<0.05)，見圖7。

圖7 Nogo-A蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)量

3 討 論

如何發(fā)揮施萬細(xì)胞的促進(jìn)周圍神經(jīng)修復(fù)的作用是研究者關(guān)注的課題。本實驗應(yīng)用RSC96細(xì)胞株作為研究對象，應(yīng)用FK506作為處理因素，在實驗觀察的14 d內(nèi)，F(xiàn)K506能明顯的促進(jìn)SCs的增殖，這也與以前的文獻(xiàn)報道相一致[5]。

有研究表明[13]，GFAP參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成并維持其張力強(qiáng)度，是SCs的標(biāo)志蛋白。而在本實驗中，F(xiàn)K506誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，經(jīng)FK506處理的RSC96細(xì)胞株中GFAP基因mRNA表達(dá)與兩對照組相比明顯升高(P<0.01)，RSC96細(xì)胞株中GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量也明顯多于兩對照組(P<0.05)。結(jié)合以往的研究可以推斷FK506能促進(jìn)RSC96細(xì)胞株GFAP的表達(dá)，借此促進(jìn)細(xì)胞骨架形成并維持其張力，加快損傷神經(jīng)的再生修復(fù)。

NF200是組成神經(jīng)胞體和軸突細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)，能反映神經(jīng)元和突觸的功能[14]。當(dāng)神經(jīng)受損時，損傷范圍內(nèi)神經(jīng)元失去反應(yīng)能力，而損傷范圍附近的神經(jīng)元中NF200合成增加并積聚[15]。根據(jù)本實驗結(jié)果，經(jīng)FK506處理14 d后，RSC96細(xì)胞株中NF200基因mRNA表達(dá)較兩個對照組明顯升高(P<0.01)，免疫組織化學(xué)方法檢測RSC96細(xì)胞株中NF200陽性細(xì)胞數(shù)量也明顯多于對照組(P<0.05)，而在誘導(dǎo)1 d時，各組RSC96細(xì)胞株中NF200的mRNA和蛋白水平升高均不明顯(P>0.05)。結(jié)合以往的研究結(jié)果，可以推斷FK506能促進(jìn)在損傷區(qū)附近神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中NF200的大量合成并聚集，加快神經(jīng)胞體和軸突骨架結(jié)構(gòu)形成，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)損傷的神經(jīng)再生長作用。

研究表明Nogo-A在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能都具有重要影響[16]。當(dāng)采用使用抗Nogo-A抗體或者更直接敲除Nogo-A基因，會導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)移植培養(yǎng)物生出比對照組更粗、更長的神經(jīng)突，并且能顯著減少神經(jīng)束的解束，而使其變粗[17]。在本實驗中，經(jīng)FK506作用14 d后，RSC96細(xì)胞株中Nogo-A基因mRNA表達(dá)明顯較兩個對照組減少(P<0.01)，免疫組化檢測結(jié)果顯示，在FK506誘導(dǎo)1 d時，F(xiàn)K506誘導(dǎo)劑組中表達(dá)Nogo-A蛋白的陽性細(xì)胞平均數(shù)量比空白對照組和溶劑組明顯增多(P<0.05)；但經(jīng)FK506誘導(dǎo)14 d后，F(xiàn)K506誘導(dǎo)組Nogo-A的陽性細(xì)胞數(shù)量與空白對照組幾乎相等(P>0.05)，而且均明顯低于溶劑對照組(P<0.05)。FK506誘導(dǎo)組在處理前后Nogo-A的陽性細(xì)胞數(shù)幾乎沒有增加，而空白對照組和溶劑組明顯增多。結(jié)合以往的研究結(jié)果可推知，F(xiàn)K506對Nogo-A蛋白的表達(dá)發(fā)揮了抑制作用，能通過減弱Nogo-A的抑制神經(jīng)突生長的功能，幫助神經(jīng)骨架的再生，促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)。

綜上所述，當(dāng)應(yīng)用FK506作用于RSC96細(xì)胞時，可能增加GFAP、NF200的表達(dá)，同時抑制Nogo-A的表達(dá)，加速神經(jīng)細(xì)胞及軸突細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的形成；能使施萬細(xì)胞在數(shù)量上明顯優(yōu)于未誘導(dǎo)組，促進(jìn)其增殖及分泌功能，有助于受損的周圍神經(jīng)加速進(jìn)行再生修復(fù)。然而，F(xiàn)K506促進(jìn)施萬細(xì)胞GFAP、NF200的表達(dá)，抑制Nogo-A蛋白的表達(dá)的機(jī)制本實驗未涉及，尚待進(jìn)一步研究證實。施萬細(xì)胞是否還通過其他物質(zhì)促進(jìn)神經(jīng)元生長，也有待于進(jìn)一步的研究。由于可操作實驗的時間有限，F(xiàn)K506作用的時間點只選取了2個，今后的研究中會可以適當(dāng)增加幾個時間點，適當(dāng)延長觀察時間，以期待有更多的發(fā)現(xiàn)。