張葉明，付正豪，陳云雨

(皖南醫(yī)學(xué)院藥物篩選與評(píng)價(jià)研究所，安徽 蕪湖 241000)

小分子泛素樣修飾蛋白質(zhì)(small ubiquitin-like modifier protein，SUMO)廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，是一種通過(guò)結(jié)合賴氨酸側(cè)鏈起相關(guān)調(diào)節(jié)修飾作用的蛋白質(zhì)，廣泛參與RNA轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等[1-2]。目前研究表明SUMO還可以作為重組蛋白質(zhì)表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，促進(jìn)重組蛋白質(zhì)的折疊與可溶性表達(dá)，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與生物學(xué)活性[3-5]。但重組蛋白質(zhì)融合的SUMO標(biāo)簽可以被泛素樣特異性蛋白酶1(ubiquitin-like specific protease 1，Ulp1)特異性識(shí)別并切割，高效獲得具有天然結(jié)構(gòu)和良好生物學(xué)活性的目的蛋白質(zhì)。

Ulp1來(lái)源于釀酒酵母，是由621個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是保守性弱的N-端結(jié)構(gòu)域(1～432 aa)，另一個(gè)是C-端結(jié)構(gòu)域(432～621 aa)，具有促進(jìn)蛋白酶折疊作用。Ulp1的結(jié)構(gòu)分析與蛋白質(zhì)水解實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ulp1的活性結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?03至621位氨基酸，其表現(xiàn)出與全長(zhǎng)的Ulp1等同的酶切活性，能夠水解以α-氨基連接的SUMO融合蛋白質(zhì)[6]。Ulp1在移除SUMO標(biāo)簽時(shí)依賴SUMO空間結(jié)構(gòu)而不是線性氨基酸序列，實(shí)現(xiàn)了高效地特異性切割。更重要的是，融合蛋白質(zhì)切除SUMO標(biāo)簽后，目的蛋白質(zhì)的N端不含有多余的氨基酸，很好地保持了目的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性。本研究旨在優(yōu)化Ulp1(403～621 aa)在大腸桿菌中的原核表達(dá)條件，再以親和層析法一步分離純化，從而高效制備Ulp1，為Ulp1在生物工程中的酶切應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金公司；pET-28a載體由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院-北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所林媛副研究員惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量、質(zhì)粒提取試劑盒、NdeⅠ、XhoⅠ購(gòu)自全式金公司；BCA(bicinchoninic acid)購(gòu)自Thermo公司；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、小鼠抗組氨酸(histidine，His)標(biāo)簽單克隆抗體購(gòu)自Biosharp公司；卡那霉素、氨芐西林、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)購(gòu)自Sigma公司；HisTrapTM層析柱購(gòu)自Cytiva公司；HRP底物化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自上海天能科技有限公司；其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 儀器與設(shè)備 恒溫金屬浴(Coyote Biotech公司)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(SCIENTZ公司)；細(xì)菌振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)；蛋白質(zhì)電泳儀與轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；瓊脂糖水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海Clinx公司)；AKTA Pure層析系統(tǒng)(GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 Ulp1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 GenBank檢索Ulp1(403～621 aa)基因序列，并在目的基因兩端分別加入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，由通用生物(安徽)有限公司進(jìn)行基因片段合成。再將目的基因直接連接pET-28a載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，以雙酶切法進(jìn)行鑒定。

1.2.2 Ulp1的原核表達(dá) 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒Ulp1-pET28a以冷CaCl2化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)細(xì)胞中，后在37 ℃的LB固態(tài)培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中過(guò)夜。隨機(jī)選取6個(gè)單菌落到5 mL LB液態(tài)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)Ulp1表達(dá)(30 ℃誘導(dǎo)10 h，IPTG濃度為1 mmol/L)。采用SDS-PAGE電泳方法分析Ulp1的表達(dá)情況。

1.2.3 Ulp1誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 37 ℃培養(yǎng)工程菌到OD60約為0.7時(shí)，誘導(dǎo)溫度設(shè)置為20 ℃，加入 IPTG(1.0 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)。分別在2、4、6、8、10、12 h時(shí)間點(diǎn)等量收集菌體，通過(guò) SDS-PAGE方法鑒定Ulp1表達(dá)量。分別設(shè)置誘導(dǎo)溫度為25 ℃和30 ℃，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，栓測(cè)分析結(jié)果，從而確定不同誘導(dǎo)溫度的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.4 Ulp1誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 等量隨機(jī)采集20 ℃誘導(dǎo)10 h、25 ℃誘導(dǎo)8 h和30 ℃誘導(dǎo)6 h的菌落，采用超聲法裂解菌體，收集上清液與沉淀，以12% SDS-PAGE分析Ulp1的可溶性表達(dá)，從而確定Ulp1最佳誘導(dǎo)溫度。

1.2.5 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 將工程菌于37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.7 h，分別加入不同濃度IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)，30 ℃誘導(dǎo)6 h。等量收集菌體，以 SDS-PAGE分析不同IPTG濃度下Ulp1的表達(dá)量，并確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度。

1.2.6 飽和硫酸銨沉淀制備粗提液 工程菌以0.2 mmol/L IPTG于30 ℃誘導(dǎo)6 h，收集的菌體超聲法破碎，收集菌體裂解上清液。在100 μL上清液中分別加入10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%飽和硫酸銨溶液，4 ℃沉淀2 h。離心收集沉淀，以80 μL TBS(25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl pH 8.0)重懸，再以12% SDS-PAGE確定各不同飽和硫酸銨濃度中Ulp1沉淀量，確定飽和硫酸銨的最佳沉淀濃度。

1.2.7 Ulp1分離純化與鑒定 在上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳原核表達(dá)條件下，大量誘導(dǎo)工程菌，用30%飽和硫酸銨溶液沉淀菌體裂解上清液，制備粗提液。用適量A液(50 mmol/L 咪唑、0.5 mol/L NaCl、25 mmol/L Tris pH 8.0)重懸，制備粗提液。用0.5 mL/min的流速上樣以10倍柱床體積A液清洗和平衡的HisTrapTM層析柱。隨后按照參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行洗脫收集、分離純化[7]。以SDS-PAGE電泳檢測(cè)，經(jīng)TBS透析后，再用BCA法分析。

將含有Ulp1(24 kDa)泳道的電泳膠轉(zhuǎn)膜，開展Western blot實(shí)驗(yàn)。一抗為1∶2000稀釋的小鼠抗His標(biāo)簽單抗，二抗為1∶4000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG，用HRP底物化學(xué)發(fā)光液顯影成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ulp1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成的Ulp1基因克隆到pET-28a載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒Ulp1-pET-28a，見(jiàn)圖1A。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和XhoI雙酶切后，可獲得大小約657 bp的特異性片段，擴(kuò)增的特異性片段與Ulp1預(yù)期大小基本一致，說(shuō)明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒Ulp1-pET-28a，見(jiàn)圖1B。

A：重組質(zhì)粒Ulp1-pET-28a的構(gòu)建；B：重組質(zhì)粒Ulp1-pET-28a的雙酶切鑒定

2.2 Ulp1的原核表達(dá)

重組菌經(jīng)1 mol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，隨機(jī)選取6株工程菌，以SDS-PAGE分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在相對(duì)分子量為24 kDa位置均有明顯的目的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，這與Ulp1理論分子量基本相符，說(shuō)明Ulp1原核表達(dá)成功，見(jiàn)圖2。

1:陰性對(duì)照；2：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；3～8：誘導(dǎo)的工程菌

2.3 確定Ulp1最佳誘導(dǎo)時(shí)間

工程菌經(jīng)20、25和30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)后，以SDS-PAGE分析Ulp1原核表達(dá)量。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)，Ulp1表達(dá)量在10 h時(shí)趨于表達(dá)量峰值，此時(shí)表達(dá)量約為35%，見(jiàn)圖3a。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)，Ulp1表達(dá)量在8 h時(shí)趨于表達(dá)量峰值，此時(shí)表達(dá)量約為33，見(jiàn)圖3b。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí)，Ulp1表達(dá)量在6 h時(shí)趨于表達(dá)量峰值，此時(shí)表達(dá)量約為36%，見(jiàn)圖3c。

(a,b,c)Ulp1在20 ℃、25 ℃、30 ℃誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

2.4 確定Ulp1最佳誘導(dǎo)溫度

菌體分別在20 ℃誘導(dǎo)10 h、25 ℃誘導(dǎo)8 h和30 ℃誘導(dǎo)6 h后，采用超聲法裂解菌體，收集沉淀與上清液。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20 ℃誘導(dǎo)10 h時(shí)，Ulp1在上清液中含量較少；25 ℃誘導(dǎo)8 h時(shí)和30 ℃誘導(dǎo)6 h時(shí)，Ulp1雖有部分包涵體表達(dá)，但上清液中Ulp1含量明顯增多，Ulp1以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)，見(jiàn)圖4。

1:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；2：全菌蛋白質(zhì)(30 ℃)；3：上清液(30 ℃)；4：沉淀(30 ℃)；5：全菌蛋白質(zhì)(25 ℃)；6:上清液(25 ℃)；7：沉淀(25 ℃)；8：全菌蛋白質(zhì)(20 ℃)；9：上清液(20 ℃)；10：沉淀(20 ℃)

2.5 確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度

菌體在30 ℃溫度下分別以不同濃度IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)誘導(dǎo)6 h，SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)表明，雖然IPTG濃度不斷遞增，但Ulp1表達(dá)量基本不變，故選擇0.2 mmol/L IPTG為最佳誘導(dǎo)濃度，見(jiàn)圖5。

1:陰性對(duì)照；2：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；3～7：0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L IPTG

綜上所述，確定誘導(dǎo)溫度30 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間6 h、IPTG濃度0.2 mmol/L作為Ulp1最佳原核表達(dá)條件。

2.6 Ulp1分離純化與鑒定

工程菌在30 ℃下誘導(dǎo)6 h，以不同濃度的飽和硫酸銨沉淀菌體裂解上清液，SDS-PAGE結(jié)果顯示，30%飽和硫酸銨沉淀時(shí)Ulp1大量沉淀，見(jiàn)圖6a。以30%硫酸銨沉淀上清液制備Ulp1粗提液，再用HisTrapTM層析柱分離純化。SDS-PAGE結(jié)果表明，純化的Ulp1經(jīng)考馬斯量藍(lán)染色后，在預(yù)期分子量(24 kDa)位置均出現(xiàn)單一蛋白質(zhì)染色條帶，見(jiàn)圖6b，說(shuō)明Ulp1具有較高的純度，純度大于90%。Western blot表明，在預(yù)期分子量位置仍可呈現(xiàn)單一條帶，證實(shí)了Ulp1的正確表達(dá)，見(jiàn)圖6c。純化的Ulp1以BCA法定量，其濃度為1.0 mg/mL，經(jīng)原核表達(dá)條件優(yōu)化后，Ulp1表達(dá)量約為350 mg/L。

(A)飽和硫酸銨法沉淀Ulp1。1：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；2：10%；3：15%；4：20%；5：25%；6：30%；7：35%；8：40%；9：45%；(B)Ulp1的親和層析。1:陰性對(duì)照；2：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；3：全菌蛋白質(zhì)；4：30%飽和硫酸銨沉淀樣品；5～6：純化的Ulp1條帶；(C)Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定Ulp1。1：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；2：Ulp1條帶(24 kDa)

3 討 論

SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)具有顯著提升重組蛋白質(zhì)表達(dá)水平、促進(jìn)目的蛋白質(zhì)正確折疊和提高目的蛋白質(zhì)可溶表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于容易錯(cuò)誤折疊、有毒和難溶性蛋白質(zhì)的表達(dá)。Ulp1可以特異性識(shí)別并切割SUMO標(biāo)簽，與傳統(tǒng)的切割酶不同，Ulp1識(shí)別SUMO空間結(jié)構(gòu)，特異性切割SUMO標(biāo)簽C端的異肽鍵，且切割后的目的蛋白質(zhì)氨基端不含多余的氨基酸，幾乎不影響目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，因此高效制備高產(chǎn)量的Ulp1并應(yīng)用于重組蛋白質(zhì)的酶切具有重要的實(shí)踐意義。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有成本廉價(jià)、操作簡(jiǎn)捷、表達(dá)量高等眾多優(yōu)點(diǎn)，已成為制備重組蛋白質(zhì)的首選方案[8]。外源蛋白質(zhì)連接分子量較小的His標(biāo)簽后，可方便重組蛋白的分析檢測(cè)和分離純化，因此本實(shí)驗(yàn)在Ulp1(403～621 aa)的羧基端融合了pET-28a載體的His標(biāo)簽，并以親和層析方法進(jìn)行了Ulp1分離純化。優(yōu)化原核表達(dá)條件是為了在簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下最大量的表達(dá)目的蛋白。基于誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度是影響外源蛋白質(zhì)表達(dá)的重要因素[9-10]，本課題組開展了Ulp1原核表達(dá)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，溫度是影響Ulp1表達(dá)的重要因素。20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，Ulp1在上清液中含量較少，這可能與低溫導(dǎo)致目的蛋白表達(dá)速度緩慢有關(guān)。25 ℃與30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，大部分Ulp1表達(dá)為可溶形式，這可能是高溫增加了蛋白質(zhì)正確折疊、促進(jìn)了蛋白質(zhì)可溶。在低溫環(huán)境下大腸桿菌發(fā)展緩慢，可通過(guò)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間以促進(jìn)目的蛋白的表達(dá)。菌體在30 ℃環(huán)境下培養(yǎng)時(shí)，Ulp1表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，在6 h左右后表達(dá)量趨于平穩(wěn)，表達(dá)量約為35%，最高表達(dá)量約為350 mg/L，不低于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[11]。另外，IPTG對(duì)Ulp1誘導(dǎo)效率很高，濃度為0.2 mmol/L時(shí)即可達(dá)到較好的誘導(dǎo)效果。故此確定0.2 mmol/L IPTG、30 ℃誘導(dǎo)6 h作為Ulp1在大腸桿菌中的最佳表達(dá)條件。

綜上所述，本研究成功進(jìn)行了Ulp1原核表達(dá)條件的優(yōu)化與分離純化，為Ulp1在生物工程中的酶切應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。