李家輝，崔海悅，馬曉茜，高宇

(1．錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年升高，惡性腫瘤已成為世界范圍內(nèi)人口死亡的主要原因之一[1]。根據(jù)2019年國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率居于第四位，死亡率均位于第二位[2]。大部分晚期惡性腫瘤患者已無手術(shù)機會，首選化療治療，但很多抗癌藥物是不溶于水，其水溶性嚴(yán)重限制了化療藥物的吸收。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是一種已發(fā)現(xiàn)的最優(yōu)秀的天然廣譜抗癌藥物之一，通過抑制微管蛋白的解聚，進而抑制細胞有絲分裂達到抗腫瘤作用，在臨床上已經(jīng)廣泛用于乳腺癌、卵巢癌、肝癌、部分頭頸癌和肺癌的治療[3-4]，并且效果很好，但是其水溶性較差，水中溶解度僅6 ng/mL[5]，因此如何改善紫杉醇溶解性是目前晚期惡性腫瘤治療中亟需解決的問題，對于擴大其臨床應(yīng)用更具重要意義。

納米材料是指材料的基本單元在納米級的范圍內(nèi)，尺度約為 100 個原子緊密貼合,排列整齊。根據(jù)Ostwld-Freundilich 方程和Noyes-Whitney 方程[6]，納米粒子尺寸小比表面積大，不但增加難溶藥物溶解度或溶出速率，還能增加納米粒與細胞膜或生物膜的接觸。這些優(yōu)點都有利于增加難溶藥物吸收，這都為解決難溶性藥物的水溶性和吸收問題提供了良好的機遇。納米藥物載體，是指粒徑大小為10～500 nm的納米粒子應(yīng)用納米技術(shù)包裹或吸附治療藥物，藥物載體被細胞攝取后在胞內(nèi)釋放藥物，從而實現(xiàn)安全有效的藥物輸送。目前用于改善紫杉醇溶解性的方法包括制備膠束[7-9]、脂質(zhì)體[10]、納米粒[11]等。已有的紫杉醇納米藥物，包括脂質(zhì)體紫杉醇和白蛋白結(jié)合型紫杉醇。如Paclitaxel liposome(脂質(zhì)體紫杉醇)的缺點包括穩(wěn)定性差、載藥量低、不易保存等。白蛋白結(jié)合型紫杉醇(albumin-boundpaclitaxel，Abraxane)中，紫杉醇和白蛋白為直接結(jié)合，不存在過敏反應(yīng)，但是無法調(diào)節(jié)藥物釋放，并且成本高，工藝復(fù)雜，價格昂貴[12]。

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，介孔材料用于改善難溶性藥物水溶性的應(yīng)用引起了廣泛的關(guān)注[13-14]，比如介孔硅材料[15-16]，介孔碳材料[17-19]等。根據(jù)國際聯(lián)合會(IUPAC)的定義，孔徑在2～50 nm之間的納米材料稱之為介孔納米材料(mesopore)，介孔納米材料作為藥物載體時，藥物以無定形態(tài)存在于載體內(nèi)部。藥物存在狀態(tài)與藥物溶解度有關(guān)：當(dāng)藥物以無定型態(tài)存在時，溶解度最好。這類材料具有高的比表面積、大的孔容積、易改性等優(yōu)勢。本實驗采用介孔氧化銅納米球作為載體材料，在既往研究中，介孔氧化銅給藥體系顯示出了低毒、靶向腫瘤細胞、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用[20]。本實驗用介孔氧化銅納米球給藥體系的納米效應(yīng)，改善紫杉醇的水溶性，并考察了該給藥體系對SMMC-7721肝癌細胞的作用。

1 儀器與材料

KQ-250B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)、AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、DF-101S恒溫磁力攪拌器(鄭州市亞榮儀器有限公司)、JEM-1010透射電鏡(日本電子株式會社)、LC-2030 高效液相色譜儀(日本島津公司)、TG22-WS臺式高速離心機(上海趙迪生物科技有限公司)、HS-DSC-101差示掃描量熱儀(上海和晟儀器科技有限公司)、ZEISS LSM 700激光共聚焦顯微鏡(上海萊瑟光譜儀器分析技術(shù)有限公司)HBS-1096酶標(biāo)分析儀(深圳良誼儀器有限公司)。

紫杉醇PTX(純度≥98%，西安天豐生物科技有限公司，批號：20151015)，間苯二酚(阿拉丁)，正硅酸乙酯(TEOS)，谷胱甘肽(GSH)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，3-巰基丙基-三甲氧基硅烷(MPTMS)(阿拉丁)，甲醇(色譜醇，天津光復(fù)精細化工有限公司)，噻唑蘭(MTT)，Hoechst 33342，羅丹明鬼筆環(huán)肽，異硫氰酸熒光素(FITC)，RPMI-1640培養(yǎng)基(北京鼎國昌盛生物科技有限公司)，其余試劑為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 載體制備及載藥研究

2.1.1 MCON的制備[19]

70 mL乙醇、3 mL氨水、10 mL水置于磨口錐形瓶中混合均勻，然后3.46 mL正硅酸乙酯滴加到上述溶液中，攪拌下反應(yīng)15 min，接下來加入0.4 g間苯二酚和0.56 mL的甲醛，反應(yīng)24 h后，得到的白色沉淀經(jīng)干燥后，于700 ℃氮氣氛圍下煅燒7 h，5%的氫氟酸除去二氧化硅，得到介孔中空碳納米球。取100 mg介孔中空碳納米球分散在10 mL 1.5 M的硝酸銅溶液中，攪拌24 h后，離心得到的樣品經(jīng)干燥于500 ℃空氣中煅燒3 h，得到MCON。

2.1.2 載藥研究

吸附法被用于載藥研究。取200 mg MCON分散于2 mL的PTX二氯甲烷溶液(2 mg/mL)中，經(jīng)超聲進一步分散后繼續(xù)攪拌6 h，離心得到的沉淀經(jīng)真空干燥后,得到MCON-PTX。精密稱量5.0 mg CS-SS-MSN-PTX /MSN-PTX置于10 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度。靜置1 h，離心，取上清液為供試品，HPLC法測定PTX濃度并計算載藥量，按如下公式計算得到：載藥量 (DLC) %=包裹在APMSN載藥體系中的紫杉醇重量/載藥體系重量×100%。

2.2 表征

2.2.1 透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)表征

采用透射電子顯微鏡(Tecnai G2F30，F(xiàn)EI，USA) 觀察MCON的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。

2.2.2 DSC表征

差示掃描量熱掃描儀檢測PTX在MCON孔道中的存在狀態(tài)，實驗條件為氮氣氛圍下從50～120 ℃ 以 10 ℃/min的加熱速率進行掃描，繪制DSC曲線。

2.3 體外溶出實驗

根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》溶出度測定第二法，考察MCON-PTX和PTX的溶出行為。取相當(dāng)于3.0 mg PTX 的原料藥PTX和MCON-PTX分散于400 mL pH=7.4 PBS中，在溫度為37.0 ℃和轉(zhuǎn)速為100 rpm條件下，分別于5、10、20、30、45、60 min 取樣2 mL，取樣后補充等量空白釋放介質(zhì)。通過HPLC法對PTX進行定量分析，計算PTX的累積溶出度。色譜條件：使用的流動相比例為甲醇-水(65∶35)，色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃，檢測波長為227 nm，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL。

2.4 體外細胞實驗

2.4.1 細胞毒性實驗

SMMC-7721細胞培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為含10%血清的DMEM，溫度為37 ℃，5%二氧化碳。試驗中所用細胞均經(jīng)過細胞計數(shù)。MCON-PTX的細胞活力用MTT法檢測。5×104濃度的細胞被種到96孔板中，貼壁后，系列濃度的MCON，PTX、MCON-PTX被加入孔中，孵育48 h每孔加入MTT試劑20 μL，孵育4 h后，去除介質(zhì)，每孔加入150 μLDMSO。酶標(biāo)儀在492 nm測定光密度值。

2.4.2 細胞攝取實驗

500 mg MCON置于 100 mL錐形瓶中，在100 ℃下干燥 30 min，降至室溫后在氮氣保護下加入 50 mL無水乙醇和2 mL的 3-氨丙基三乙氧基硅烷，77 ℃下攪拌加熱回流10 h，經(jīng)離心得到的樣品用無水乙醇洗滌3次，真空干燥后置于1 mg/mL的 FITC無水乙醇溶液中，靜置吸附3 h，離心得到含有 FITC 標(biāo)記的MCON(FITC-MCON)。將細胞密度為5×104的對數(shù)期SMMC-7721細胞接種于共聚焦皿中，貼壁后，50 μg/mL MCON-PTX分散液填加入共聚焦皿中，37 ℃下分別孵育1、2 h，棄去培養(yǎng)基后用PBS洗3次，4%多聚甲醛溶液固定10 min，1 mg/mL 的Hoechst 33342和1 mg/mL的羅丹明鬼筆環(huán)肽分別進行染色，最后激光共聚焦顯微鏡(Leica DM-6000 CS microscope，Germany)下觀察SMMC-7721細胞對FITC-MCON的攝取情況。

3 結(jié)果與討論

3.1 載體形態(tài)結(jié)構(gòu)及載藥研究

通過TEM對制備的介孔碳納米球和MCON的形貌進行表征。介孔碳納米球呈單分散的球形顆粒，具有介孔中空結(jié)構(gòu)，粒徑分布約為230 nm，見圖1A。MCON為核殼結(jié)構(gòu)，是介孔碳納米球結(jié)構(gòu)的復(fù)制，其介孔殼結(jié)構(gòu)能夠提供足夠的空間存貯藥物并限制藥物粒徑大小，短的孔道距離具有相對低的擴散阻力，在改善PTX的水溶性的同時有利于藥物的快速釋放。通過HPLC測定載藥量，得到PTX-MCON載藥量為(13.65±0.725)%，見圖1B。

A:介孔碳納米球；B:MCON

3.2 DSC

采用差式掃描量熱法對MCON、PTX、PTX-MCON、PM(PTX和MCON物理混合)和進行檢測，PTX在223 ℃顯示吸熱峰，PM也在此溫度出現(xiàn)吸熱峰，表明將PTX和PM中藥物是晶體狀態(tài)，MCON呈現(xiàn)一條平滑曲線，無相轉(zhuǎn)變發(fā)生，表明載體是無定形的，見圖2。PTX-MCON未見PTX的吸熱峰，說明PTX以無定型狀態(tài)存在于MCON的介孔結(jié)構(gòu)中，無定型狀態(tài)的藥物具有更大的溶解度和溶出速率，這是PTX溶出改善的原因。

圖2 DSC曲線圖

3.3 體外溶出實驗

采用pH=7.4的PBS作為溶出介質(zhì)，考察PTX-MCON的溶出情況，PTX原料藥在5 min時，藥物溶出(5.633±0.45)%，在1 h時藥物累積溶出量僅為(20.198±1.48)%，相比之下，PTX-MCON中PTX釋放較快，5 min 藥物釋放(10.536±2.15)%，1 h累積溶出量為(86.347±3.06)%，表明MCON包載后的PTX溶出速率得到顯著的提高，見圖3。

圖3 PTX-MCON的累積溶出度

3.4 細胞實驗

3.4.1 細胞毒性實驗

通過MTT法考察系列濃度的MCON對SMMC-7721細胞的作用效果，評估MCON的生物相容性。SMMC-7721細胞在濃度10～500 μg/mL的MCON孵育48 h后細胞活力均高于80%，這表明MCON對SMMC-7721細胞具有良好的生物相容性，見圖4 A。通過系列濃度的PTX和PTX-MCON對SMMC-7721細胞的抑制率評價載藥樣品的細胞毒性，PTX和PTX-MCON孵育的SMMC-7721細胞在10～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)細胞毒性呈現(xiàn)濃度依賴性，并且PTX-MCON具有更強的細胞毒性，見圖4B。

圖4 MCON(A)、PTX和PTX-MCON(B)對SMMC-7721的細胞毒性作用

3.4.2 細胞攝取實驗

通過激光共聚焦顯微鏡觀察SMMC-7721細胞在0.5、1 h對FITC-MCON的攝取情況。根據(jù)熒光強度變化說明FITC-MCON能夠被細胞攝取跨膜進入細胞質(zhì)，并呈時間依賴性實驗，見圖5。

圖5 FITC-MCON被細胞攝取的激光共聚焦圖像

4 結(jié) 論

本研究制備了MCON，并以其為載體改善難溶性藥物PTX的水溶性，載藥樣品中PTX以無動態(tài)存在，體外溶出結(jié)果說明PTX-MCON明顯改善了PTX的溶出速率。細胞實驗結(jié)果進一步表明PTX-MCON對SMMC-7721細胞的顯著抑制作用。綜上，MCON是一種具有改善難溶性藥物水溶性的潛力載體，為改善難溶性抗腫瘤藥物療效提供參考。