李琳，葉麗平

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬盤錦遼油寶石花醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 盤錦 124010)

卵巢惡性腫瘤是婦科常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌而居第三位，但卻是導(dǎo)致女性癌癥死亡的首要原因。卵巢癌發(fā)病隱匿，具有異質(zhì)性，目前仍缺乏有效的早期診斷和治療手段。研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞信號通路活性異常密切相關(guān)[1-2]。YAP(yes-associated protein，Yes相關(guān)蛋白)，是Hippo信號通路的關(guān)鍵分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和分化，器官的發(fā)育、再生和干細(xì)胞等生物學(xué)功能，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3-4]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt 信號通路的重要效應(yīng)蛋白分子，在腫瘤中高表達(dá)并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等生命活動(dòng)[5-6]。近年來越來越多的研究證實(shí)，Hippo/YAP通路與Wnt/β-catenin通路存在相互交叉作用，協(xié)同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測了YAP和 β-catenin在卵巢癌中的表達(dá)情況，并分析了二者之間表達(dá)相關(guān)性及其各自與臨床病理因素的關(guān)系，旨在探討卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早診手段和分子靶向治療藥物。

1 材料和方法

1.1 組織來源

基于知情同意原則，收集盤錦遼油寶石花醫(yī)院住院卵巢癌手術(shù)切除的標(biāo)本66例，所有病例在腫瘤切除前均未進(jìn)行放、化療。根據(jù)年齡、病理類型、FIGO分期、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組。良性腫瘤組織標(biāo)本30例，對照組30例取自同時(shí)期住院的卵巢切除患者。新鮮組織標(biāo)本一部分凍存于-80 ℃冰箱備用，用于western blot，一部分經(jīng)甲醛固定石蠟包埋，用于免疫組化染色。

1.2 免疫組織化學(xué)

30例正常卵巢組織、30例卵巢良性腫瘤、66例卵巢惡性組標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育5～10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS 浸泡 5 min×2次，抗原高壓熱修復(fù)，自然冷卻至室溫。 5%～10% 正常山羊血清封閉，室溫孵育 10 min，傾去血清，滴加一抗工作液，4 ℃孵育過夜。PBS 沖洗，5 min×3 次，滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37 ℃ 孵育 10～30 min。PBS 沖洗，5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性 樹膠封片，光鏡觀察。采用 0.01 M PBS液代替一抗作陰性對照。用已知YAP，β-catenin陽性的卵巢癌組織切片作為陽性對照。

請兩位病理科醫(yī)師雙盲閱片。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)500個(gè)細(xì)胞。按陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比評分：陰性為0分；陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。再按染色強(qiáng)度評分：無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。按兩者乘積分?jǐn)?shù)評分，0～2分為(-)；3～4分為(+)；5～8分為(++)；9～12分為(+++)。

1.3 Western blotting 檢測YAP和β-catenin的蛋白表達(dá)

將盤錦遼油寶石花醫(yī)院婦科于2016年5月至2019年5月期間行卵巢手術(shù)切除的標(biāo)本快速凍存，其中卵巢正常組織、良性腫瘤組織、卵巢癌組織各10例。加蛋白裂解液于放有剪碎組織試管內(nèi)，超聲至勻漿狀態(tài)，在細(xì)胞蛋白提取完成后采用Bradford法進(jìn)行測定。

采用10.0%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳以分離蛋白樣品，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后分別按1∶400和1∶1000的濃度加入YAP、β-catenin一抗和二抗，然后孵育2 h，雜交信號用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測。X線曝光，顯影定影后掃描。各電泳帶的光密度值用Image Pro-plus圖像處理軟件分析，目的蛋白的相對表達(dá)水平通過計(jì)算目的片段與β-actin電泳帶密度的相對值來表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

病理形態(tài)學(xué)資料采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。χ2檢驗(yàn)分析YAP，β-catenin表達(dá)的差異及其與病理臨床參數(shù)的關(guān)系。Pearson列聯(lián)系數(shù)分析YAP和β-catenin表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 YAP和β-catenin在正常卵巢組織，良性卵巢腫瘤和卵巢癌中的表達(dá)情況

我們應(yīng)用免疫組化的方法分別檢測了YAP和β-catenin在30例正常卵巢組織、30例良性卵巢組織和66例卵巢癌中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)YAP陽性表達(dá)主要定位細(xì)胞核，而β-catenin則主要定位于細(xì)胞膜。二者在惡性卵巢組織中的表達(dá)均明顯高于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤。YAP和β-catenin分別在30例正常卵巢組織中陽性表達(dá)率為10.0%(3/30)和16.7%(5/30)，在30例良性卵巢組織中陽性表達(dá)率為33.3%(10/30)和40%(12/30)，在66例卵巢癌中的陽性表達(dá)率為57.6%(38/66)和65.2%(43/66)。證明YAP和β-catenin均在卵巢癌中存在過表達(dá)，提示與卵巢的惡變有關(guān)，見圖1。

2.2 YAP、β-catenin的表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理因素的關(guān)系

為了進(jìn)一步明確YAP和β-catenin的臨床特點(diǎn)，我們分別統(tǒng)計(jì)分析了其表達(dá)與年齡，組織類型，F(xiàn)IGO分期，分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn) YAP和β-catenin均與FIGO分期有關(guān)，YAP在FIGOⅠ+Ⅱ期中陽性表達(dá)率為43.3%(13/30) 明顯低于Ⅲ+Ⅳ期中的陽性率69.4%(25/36)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同樣，β-catenin在FIGO Ⅲ+Ⅳ期中陽性表達(dá)率高于Ⅰ+Ⅱ期(86.1%(31/36)vs 40.0%(12/30)，P<0.05)。此外，YAP在卵巢癌中過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，β-catenin在卵巢癌中過表達(dá)與分化程度有關(guān)(P<0.05)。二者的高表達(dá)均與年齡，組織類型無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1、表2。

A：YAP在正常卵巢組織中的表達(dá)；B：YAP在良性卵巢腫瘤中的表達(dá)；C：YAP在卵巢癌中的表達(dá)；D：β-catenin在正常卵巢組織中的表達(dá)；E：β-catenin在良性卵巢腫瘤中的表達(dá)；F：β-catenin在卵巢癌中的表達(dá)

表1 YAP蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系(%)

表2 β-catenin蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系(%)

2.3 卵巢癌中YAP和β-catenin的表達(dá)相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示66例卵巢癌患者中YAP 和β-catenin 表達(dá)均陽性者33 例，均陰性者18 例；YAP 表達(dá)陽性、β-catenin表達(dá)陰性者5例；YAP 表達(dá)陰性、β-catenin 表達(dá)陽性者10例，經(jīng)過Pearson列聯(lián)系數(shù)分析：在66卵巢癌組織中，YAP 和β-catenin 的高表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.51，P<0.05)，見表3。

表3 YAP、β-catenin二者表達(dá)的相關(guān)分析

2.4 Western blotting 檢測YAP、β-catenin的蛋白表達(dá)

YAP蛋白的分子質(zhì)量為65 kDa，β-catenin的分子質(zhì)量為92～95 kD，在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織和卵巢癌組織中均可見YAP、β-catenin的特異性條帶出現(xiàn)。

同正常卵巢組織組和卵巢良性腫瘤組相比，卵巢癌組織中的YAP和β-catenin的蛋白表達(dá)水平明顯更高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4、圖2。

表4 YAP、β-catenin在不同卵巢組織中的蛋白表達(dá)

圖2 YAP、β-catenin在不同卵巢組織中的蛋白表達(dá)

3 討 論

近年來，卵巢癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，手術(shù)切除仍是治療的首選方式。然而，卵巢癌發(fā)病隱匿，患者就診時(shí)往往失去手術(shù)時(shí)機(jī)，目前仍未有有效的早診手段，導(dǎo)致卵巢癌仍是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。伴隨基因組學(xué)的發(fā)展，從分子學(xué)探討腫瘤發(fā)病機(jī)制，為尋找有效的腫瘤診治靶點(diǎn)提供可能性。

腫瘤的發(fā)病機(jī)制是多因素，多階段，多基因之間的共同作用。研究證實(shí)在惡性腫瘤中存在多條信號通路的異常激活或失活。YAP定位于染色體11q22，該區(qū)域在人類多種腫瘤中被證實(shí)存在擴(kuò)增或雜合型突變。Hippo信號通路的失活可使YAP在細(xì)胞漿積累，進(jìn)入細(xì)胞核后與TEAD結(jié)合，從而調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)。研究表明，YAP在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，如結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、口腔鱗癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、食管鱗癌等，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[8]。β-catenin是Wnt信號傳導(dǎo)過程中的樞紐，當(dāng)Wnt-1 信號與細(xì)胞膜上的受體蛋白Frizled(Ez)蛋白結(jié)合后，信號傳給dishevelled(DSH/Dvl)，使其過磷酸化，DSH 的過磷酸化抑制了GSK-3β功能，使其不能磷酸化β-catenin 蛋白，導(dǎo)致胞漿內(nèi)游離的β-catenin 增加，β-catenin進(jìn)入胞核與轉(zhuǎn)錄因子LEF 和TCF形成復(fù)合物，促進(jìn)如：c-myct 和cyclinD1 等下游靶基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等行為[9]。已有研究證實(shí)Hippo/YAP通路與Wnt/β-catenin通路在肝癌、大腸癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤中存在協(xié)同促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展的作用[7，10-11]71-79。但在卵巢癌中的作用研究尚未明確。

本研究證實(shí)YAP和β-catenin在卵巢癌中均存在過表達(dá)，提示與卵巢癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展有關(guān)。YAP在Hippo通路失活條件下，在細(xì)胞漿中聚集入核后發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化因子的作用。β-catenin在Wnt通路激活條件下，在細(xì)胞漿中聚集后入核亦發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化作用。二者均可以通過調(diào)節(jié)下游增殖、侵襲和凋亡相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。我們證實(shí)了YAP陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，而β-catenin主要定位于細(xì)胞膜。二者在卵巢癌中的陽性表達(dá)率均高于良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織。在探討YAP和β-catenin在卵巢癌中高表達(dá)的臨床意義時(shí)，我們分析了二者過表達(dá)與卵巢癌臨床病理因素的關(guān)系即年齡、組織類型、FIGO分期、分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均與FIGO分期有關(guān)(Ⅲ+Ⅳ期中的表達(dá)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期)。其中YAP的過表達(dá)與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，β-catenin的過表達(dá)與分化程度有關(guān)。

已有研究顯示，YAP和β-catenin定位于細(xì)胞核時(shí)能夠協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化的作用進(jìn)而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Hippo 信號通路活的激活能夠抑制Wnt信號通路，而Wnt信號通路的激活亦能抑制Hippo 信號通路的活性。在腸癌中Hippo 信號通路活性下調(diào)而Wnt信號通路活性上調(diào)，磷酸化YAP能夠促進(jìn)β-catenin定位于細(xì)胞漿[12]。在膠質(zhì)瘤中，YAP可以通過GSK3β調(diào)節(jié)β-catenin的表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤的增殖，β-catenin亦能調(diào)節(jié)YAP。在肝癌中[13]，Wnt/β-catenin信號通路異常激活時(shí)，發(fā)現(xiàn)YAP亦起到關(guān)鍵促癌因子作用[14]。值得一提的是，我們在本研究中證實(shí)了YAP1 和β-catenin 在卵巢癌中高表達(dá)且二者表達(dá)呈正相關(guān)性，這與上述研究報(bào)道結(jié)果一致。提示我們YAP和β-catenin在卵巢癌中亦發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)癌癥惡性進(jìn)展的作用，為進(jìn)一步闡明Hippo 與Wnt 信號通路在卵巢癌的協(xié)同作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是，二者是如何發(fā)揮協(xié)同作用，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，YAP和β-catenin 分別作為Hippo和Wnt 信號通路中的關(guān)鍵分子在卵巢癌中高表達(dá)，并且均與臨床FIGO分期有關(guān)，重要的是二者表達(dá)呈正常相關(guān)。我們的研究證實(shí)了YAP和β-catenin在卵巢癌中的協(xié)同促癌作用，為探討卵巢癌發(fā)病分子機(jī)制提供理論研究基礎(chǔ)，為臨床卵巢癌早期診治提供依據(jù)。