周 璇，譚 斌，楊世皓，羅林麗，祝永才，王 姣，楊勝林

(1.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

番鴨是優(yōu)良的肉用鴨，具有生長(zhǎng)快、耐粗飼和抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，在現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)中具有特殊的價(jià)值和地位，擁有很高的市場(chǎng)需求量[1]。育成時(shí)間較長(zhǎng)(24～26周)、年產(chǎn)蛋數(shù)較少(100～130枚)且就巢性較強(qiáng)等因素，導(dǎo)致番鴨的繁殖性能較低，飼養(yǎng)成本增加。此外，就巢會(huì)使卵巢退化導(dǎo)致停產(chǎn)，增加窩外蛋和破損蛋的數(shù)量，降低番鴨的利用價(jià)值[2]。神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y，NPY)也稱神經(jīng)肽酪氨酸，是生物體內(nèi)高度保守的重要神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛表達(dá)于動(dòng)物機(jī)體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤為豐富。NPY主要通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體相互結(jié)合，直接或間接發(fā)揮相應(yīng)的生理調(diào)節(jié)作用。目前，哺乳動(dòng)物中鑒定出來(lái)的NPY受體有Y1、Y2、Y4、Y5及Y6等5種[3-5]。NPY調(diào)節(jié)著動(dòng)物的攝食行為[6]、能量代謝[7]、激素分泌與釋放[8]、生物節(jié)律[9]、心血管[10]等多種生理活動(dòng)，影響著成骨細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)骨量與體質(zhì)量平衡，影響不同階段的骨形成及骨吸收，調(diào)控骨折愈合等[11-14]。此外，NPY基因也影響著動(dòng)物的繁殖性能[15]。神經(jīng)肽Y-Y1受體基因(NPY-Y1R)的F等位基因與山羊性早熟和高繁殖力相關(guān)[16]，NPY基因GA/AT突變位點(diǎn)的W等位基因與提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)[17]，NPY基因的多態(tài)性還影響著文昌雞和邵伯雞的開(kāi)產(chǎn)體質(zhì)量[18-19]。以上研究表明，NPY可以作為繁殖性能相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外對(duì)NPY基因在水禽繁殖性能方面研究相對(duì)較少，對(duì)番鴨進(jìn)行繁殖性狀轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)，NPY基因與番鴨繁殖性能相關(guān)[20]。鑒于此，為探討NPY基因多態(tài)性與番鴨繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，以天柱黑番鴨為研究對(duì)象，采用PCR產(chǎn)物純化直接測(cè)序法對(duì)NPY基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)進(jìn)行篩查，分析其與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性，旨在為尋找天柱番鴨繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和產(chǎn)蛋性能指標(biāo)

從貴州天柱縣騾鴨科技繁殖場(chǎng)選取90只天柱母番鴨，記錄每只的開(kāi)產(chǎn)日期、開(kāi)產(chǎn)蛋質(zhì)量以及300日齡產(chǎn)蛋量，每只鴨均采取4～5 mL血樣，存于EDTA抗凝管中，置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

DNeasy Blood & Tissue Kit(250)試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、瓊脂糖均購(gòu)自天根生化(北京)科技有限公司，DL2000 DNA Marker購(gòu)自諾唯贊生物科技(南京)有限公司。

多任務(wù)梯度PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、凝膠電泳儀(北京市六一儀器廠)、超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank收錄的綠頭鴨NPY基因序列(登錄號(hào)：NW_004677092)，利用Primer Premier 5.0及NCBI對(duì)NPY基因進(jìn)行擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。運(yùn)用DNAStar軟件的SeqMan、EditSeq程序?qū)PY基因外顯子和5′端啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩查，在其3個(gè)外顯子均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，5′UTR發(fā)現(xiàn)2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，引物序列與預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物信息見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增體系(30 μL):2×TaqPCR Master Mix 13 μL，上下游引物各2 μL，番鴨模板DNA 2 μL，ddH2O 11 μL；擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s,55.7 ℃退火30 s,72 ℃延伸35 s,35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min,4 ℃反應(yīng)終止。擴(kuò)增引物采用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1 引物序列信息

1.4 生物信息學(xué)分析

采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)NPY基因核心啟動(dòng)子區(qū)、CpG島范圍、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控元件，比較其在NPY基因突變前后的變化[21](表2)。

表2 生物信息學(xué)在線軟件

1.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用DNAStar軟件SeqMan、EditSeq程序篩查NPY基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果，運(yùn)用SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)計(jì)算其基因型頻率、等位基因頻率、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)以及Hard-Weiberg平衡(χ2)等。采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA,LSD)，對(duì)基因型與產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行顯著性分析[22-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 NPY基因SNP位點(diǎn)鑒定

利用DNAStar軟件SeqMan、EditSeq程序比對(duì)分析序列，并結(jié)合測(cè)序峰圖鑒定SNP位點(diǎn)，在番鴨5′UTR的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)A411G和A540G，這2個(gè)位點(diǎn)均產(chǎn)生3種基因型AA、AG和GG(圖1)。

圖1 NPY基因SNP位點(diǎn)鑒定

2.2 NPY基因SNP位點(diǎn)遺傳特性

對(duì)番鴨NPY基因2個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量等遺傳特性的分析(表3)。由表3可知，番鴨NPY基因A411G位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型是頻率為0.467的AG基因型，優(yōu)勢(shì)等位基因是頻率為0.611的G等位基因；A540G位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型是頻率為0.467的AG基因型，優(yōu)勢(shì)等位基因是頻率為0.533的A等位基因；2個(gè)SNP位點(diǎn)均處于中度多態(tài)(0.250.05)。

表3 SNP位點(diǎn)在番鴨中的群體遺傳信息

2.3 NPY基因SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡、單倍型及雙倍型分析

對(duì)番鴨NPY基因2個(gè)SNP點(diǎn)A411G、A540G進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果表明，2個(gè)SNP位點(diǎn)D′值等于1，r2值大于0.33，2個(gè)SNP位點(diǎn)間具有強(qiáng)連鎖不平衡效應(yīng)。番鴨NPY基因2個(gè)突變位點(diǎn)的單倍型和雙倍型分析表明，番鴨NPY基因中A411G、A540G位點(diǎn)存在3種單倍型H1、H2和H3，頻率分別為0.467、0.389和0.144。共檢測(cè)到4種雙倍型，雙倍型H1H2(AGAG)最高，頻率為0.467，其次是H1H1(GGGG)，頻率為0.233，雙倍型H2H2(AAAA)和H3H3(GGAA)頻率相對(duì)較低，分別為0.156和0.144(表4)。

表4 NPY基因2個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型和雙倍型分析

2.4 NPY基因核心啟動(dòng)子范圍預(yù)測(cè)

通過(guò)2種不同軟件對(duì)番鴨NPY基因的核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，2個(gè)軟件均預(yù)測(cè)到1個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)，表明NPY基因具有明顯的啟動(dòng)子識(shí)別特征。2個(gè)軟件預(yù)測(cè)核心啟動(dòng)子區(qū)域均在-2 400 bp左右，表明NPY基因核心啟動(dòng)子區(qū)域可能在-3 031～-2 400 bp處，推測(cè)其突變可能引起NPY基因的表達(dá)(表5)。

表5 NPY基因核心啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)

2.5 NPY基因CpG島預(yù)測(cè)

選用3種不同的軟件分析預(yù)測(cè)NPY基因CpG島，將參數(shù)設(shè)置為Obs/Exp 值大于0.6，GC含量大于50%，范圍大于200 bp。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)CpG島的存在。

2.6 NPY基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)3種不同軟件預(yù)測(cè)番鴨NPY基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)NPY基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在其序列突變前后均沒(méi)有發(fā)生變化(表6)。

表6 NPY基因轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.7 NPY基因SNP位點(diǎn)與番鴨產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)性分析

對(duì)番鴨NPY基因2個(gè)突變位點(diǎn)A411G和A540G進(jìn)行產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果表明，在番鴨開(kāi)產(chǎn)日齡上，基因型AG極顯著(P<0.01)早于基因型AA；在開(kāi)產(chǎn)蛋質(zhì)量上，基因型GG顯著(P<0.05)高于基因型AA；在300日齡產(chǎn)蛋量上，基因型GG極顯著(P<0.01)高于基因型AA，基因型AG顯著(P<0.05)高于基因型AA(表7)。雙倍型H1H1的開(kāi)產(chǎn)日齡顯著(P<0.05)早于其余雙倍型；雙倍型H3H3的開(kāi)產(chǎn)蛋質(zhì)量顯著(P<0.05)高于H1H1和H1H2，其300日齡產(chǎn)蛋量顯著(P<0.05)高于H1H2和H2H2(表8)。

表7 番鴨NPY基因SNP位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析

表8 NPY基因2個(gè)SNP位點(diǎn)雙倍型對(duì)番鴨產(chǎn)蛋性能關(guān)聯(lián)性分析

3 結(jié)論與討論

啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控主要通過(guò)控制基因的表達(dá)水平、表達(dá)部位以及表達(dá)方式等，當(dāng)其基因組水平上的單個(gè)核苷酸發(fā)生變異時(shí)會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)子的多態(tài)性[25]。本研究在NPY基因5′啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，使用2種不同軟件對(duì)NPY基因核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，軟件均在-2 400 bp附近預(yù)測(cè)出1個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)，表明-3 031～-2 400 bp區(qū)域可能是NPY基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域，說(shuō)明NPY基因具有明顯的啟動(dòng)子識(shí)別特征。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合相互作用來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，其改變會(huì)影響基因的表達(dá)[26]。本研究采用3種生物學(xué)軟件對(duì)NPY基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，突變前后NPY基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)均未發(fā)生改變，但這也可能會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)子區(qū)域構(gòu)象改變，對(duì)機(jī)體的生產(chǎn)性能以及疾病發(fā)生等方面有影響。

神經(jīng)肽Y是胰多肽家族的一員，參與消化、循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)以及抗焦慮作用等機(jī)體的多種生物學(xué)效應(yīng)[27]。本研究對(duì)天柱番鴨NPY基因多態(tài)性與繁殖性狀相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NPY基因多態(tài)性與番鴨的開(kāi)產(chǎn)日齡相關(guān)，基因型AG極顯著早于基因型AA，這與皋黃雞上的基因型GG顯著早于基因型AG不同[28]；本研究發(fā)現(xiàn)，NPY基因多態(tài)位點(diǎn)與番鴨的開(kāi)產(chǎn)蛋質(zhì)量有關(guān)聯(lián)性，基因型AG顯著高于基因型AA，與武定雞上基因型AB極顯著高于基因型AA、BB結(jié)果一致[18]。此外，本研究認(rèn)為，NPY基因多態(tài)性與番鴨的產(chǎn)蛋量相關(guān)聯(lián)，基因型GG極顯著高于基因型AA，基因型AG顯著高于基因型AA，這與武定雞上基因型BB極顯著高于基因型AA、AB[18]，與皋黃雞上基因型GG顯著高于基因型AG、AA相似[28]，但與文昌雞上基因型AA顯著高于其他基因型[29]、東蘭烏雞上基因型AA顯著高于基因型BB[30]、矮小型青腳麻雞上基因型AA、BB顯著高于基因型AB[31]等不同。

本研究中2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)產(chǎn)生3種單倍型和4種雙倍型(理論上是4種單倍型和10種雙倍型)，可能是由于樣本量不足等因素導(dǎo)致。本研究通過(guò)對(duì)NPY基因SNP位點(diǎn)與番鴨繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性分析表明，2個(gè)SNP位點(diǎn)產(chǎn)生的基因型在開(kāi)產(chǎn)日齡上表現(xiàn)出來(lái)的差異總體不大，基因型AG極顯著早于基因型AA，雙倍型H1H1顯著早于其他雙倍型；2個(gè)SNP位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的基因型在開(kāi)產(chǎn)蛋質(zhì)量上完全相同，而基因型AG顯著高于基因型AA，雙倍型H3H3顯著高于其他雙倍型；此外，2個(gè)SNP位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的基因型在300日齡產(chǎn)蛋量上基本相似，但基因型GG極顯著高于基因型AA，基因型AG顯著高于基因型AA，雙倍型H3H3顯著高于其他雙倍型。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的2個(gè)SNP位點(diǎn)變異所產(chǎn)生遺傳效應(yīng)基本相似，基因型AG和雙倍型H3H3可能是影響番鴨產(chǎn)蛋性能的有利基因型和雙倍型。但由于樣本較少，有待進(jìn)一步試驗(yàn)加以驗(yàn)證。