栗笑陽，郭夏麗

(鄭州大學(xué) 化工學(xué)院生態(tài)與環(huán)境研究所,河南 鄭州 450000)

氮素循環(huán)是土壤生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)之一，包括4個主要過程，均由微生物驅(qū)動[1]。其中，硝化作用是連接氧化態(tài)和還原態(tài)無機(jī)氮庫的重要環(huán)節(jié)，在土壤的氮素形態(tài)轉(zhuǎn)化過程中起著至關(guān)重要的作用[2]。氨氧化作用是硝化作用的限速步驟，主要由氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)驅(qū)動[3-4]。AOA和AOB的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)受多種環(huán)境因子和農(nóng)業(yè)管理措施的影響[5-6]。研究表明，酸性土壤中長期施肥可改變AOA的豐度和群落結(jié)構(gòu)，而在中性或堿性土壤中AOB比AOA更敏感[7]。WU等[8]研究小麥中性土壤發(fā)現(xiàn)，長期施肥(22 a)顯著改變AOB的群落結(jié)構(gòu)，而AOA則保持不變。在一些惡劣的環(huán)境條件下，例如低pH值、低溫或高溫、高鹽度、低氧和低氨含量，土壤AOA可能是氮循環(huán)的主要參與者[9]。由于氨氧化作用與氮肥利用率、氮素淋失和N2O排放等問題直接相關(guān)[10]，為此，作為氨氧化作用的主要承擔(dān)者，AOA和AOB群落對施肥方式的響應(yīng)機(jī)制一直是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)研究中的熱點問題。

在我國小麥糧食生產(chǎn)中，化肥尤其是氮肥發(fā)揮了重要作用。但是隨著施用量的不斷提高，氮肥對糧食產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率逐漸降低，同時出現(xiàn)了過量施用帶來的一系列農(nóng)田面源污染問題[11-12]。鑒于此，為進(jìn)一步了解減施氮肥措施對農(nóng)田氨氧化微生物的影響，采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，以河南省許昌市小麥季土壤為研究對象，比較小麥不同生長階段不同施肥水平下小麥根際AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)的差異，同時結(jié)合土壤理化性質(zhì)的分析，探討小麥根際AOA和AOB對減施氮肥方式的響應(yīng)機(jī)制，為科學(xué)施肥、維護(hù)土壤生物肥力和提高土壤質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)計與土壤樣品采集

試驗區(qū)位于河南省許昌市建安區(qū)蘇橋鎮(zhèn)石梁河北岸，該區(qū)屬于大陸性暖溫帶季風(fēng)型氣候，年平均氣溫14.6 ℃，年平均降水量728.9 mm，土壤類型為褐土中壤，土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。小麥播種時間為2017年11月5日，施肥水平分別為不施氮肥(CK)、常規(guī)施肥N(210 kg/hm2，TN)和減氮施肥30%(氮肥減少30%，N 147 kg/hm2，NR)。本研究在玉米秸桿還田的基礎(chǔ)上進(jìn)行，磷肥施加量均為 127.5 kg/hm2(P2O5)，鉀肥施加量均為60 kg/hm2(K2O)，小區(qū)面積為42 m2，每個處理重復(fù)3次，試驗小區(qū)隨機(jī)排列。

表1 土壤基本理化性質(zhì)

于2018年3月2日(起身期)、2018年4月22日(拔節(jié)期)和2018年5月29日(成熟期)分別采集3個處理的小麥根際土壤。在每個小區(qū)對角線5點采樣混合為1個土樣，每點選取5株。采集時先將小麥根系從土壤中挖出，棄去秸稈等雜質(zhì)和大顆粒土塊，抖掉與根系結(jié)合松散的土壤，收集與根系結(jié)合緊密的土壤作為根際土壤。將采集土壤及時放置于含有冰袋的泡沫箱中，帶回實驗室分為兩部分，一部分保存于4 ℃，用于測定潛在硝化速率及銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。另一部分保存于-80 ℃，用于分析氨氧化微生物的多樣性。

1.2 土壤理化指標(biāo)測定

采用電位法測定土壤的pH值(水∶土=2.5∶1)；用含量為2 mol/L的氯化鉀溶液浸提鮮土樣后，采用分光光度法測定土壤的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量[13]；潛在硝化速率采用氯酸鹽抑制法[14]進(jìn)行測定。

1.3 土壤微生物多樣性測定

根際土樣交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行氨氧化微生物多樣性分析。氨氧化細(xì)菌amoA基因的引物序列：bamoA1-F：5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′和bamoA2-R：5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′[15]；氨氧化古菌amoA基因的引物序列：amoA-F：5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′和amoA-R：5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用Flash軟件進(jìn)行拼接，使用Uparse軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類；使用Uchime軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對fgr/amoA數(shù)據(jù)庫，設(shè)置比對閾值為70%。通過冗余分析(RDA)評估環(huán)境變量與AOA和AOB群落的相關(guān)性。

采用SPSS 19.0軟件對土壤理化性質(zhì)、AOA和AOB 群落多樣性指數(shù)(Shannon和Chao)進(jìn)行多重比較分析(ANOVN LSD，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥根際土壤pH值及無機(jī)氮含量的變化

在小麥起身期和拔節(jié)期，根際土壤硝態(tài)氮含量隨著施氮水平增加而逐漸增加。在所有樣品中，起身期常規(guī)施肥的硝態(tài)氮含量最高。在成熟期，減氮施肥處理的硝態(tài)氮含量低于常規(guī)施肥處理，與不施氮肥處理差異不顯著(表2)。減氮施肥處理的銨態(tài)氮含量在小麥的起身期和拔節(jié)期低于常規(guī)施肥和不施氮肥處理，成熟期與不施氮肥處理接近，而高于常規(guī)施肥處理。減氮施肥處理的硝態(tài)氮含量在起身期和拔節(jié)期均低于常規(guī)施肥處理且高于不施氮肥處理，而銨態(tài)氮含量在起身期和拔節(jié)期均低于常規(guī)施肥處理和不施氮肥處理，在成熟期3個處理無顯著差異。

表2 小麥根際土壤pH值及無機(jī)氮的變化

2.2 AOA和AOB群落多樣性分析

經(jīng)過最小序列數(shù)抽平后，每個土樣的AOA OTU數(shù)(26 633)高于AOB(20 510)，再者，小麥不同生育時期的不同施肥處理的AOA的Chao指數(shù)均高于AOB(表3)，表明小麥根際土壤中，AOA的數(shù)量高于AOB。在小麥起身期，減氮施肥處理的AOA的Chao指數(shù)高于其他2個處理，在其他生育時期，不同施肥水平對AOA的Chao指數(shù)沒有顯著影響。同樣，不同施肥水平對AOB的Chao指數(shù)也沒有顯著影響。

表3 土壤AOB和AOA群落的多樣性分析

除了起身期不施氮肥處理的AOB和AOA的Shannon指數(shù)類似外，其余處理的AOA Shannon指數(shù)均高于AOB。不同施氮量對AOA和AOB的Shannon指數(shù)沒有顯著影響。

2.3 AOA和AOB群落組成分析

土壤樣品中所有的AOA OTU歸屬于4門、5綱、5目、5科、5屬。在門水平上，不同處理的未知類群(Unclassified group)占優(yōu)勢，占總OTU的21.17%～23.52%。其次為泉古菌門(Crenarchaeota)，占總OTU的8.62%～10.68%。奇古菌門(Thaumarchaeota)數(shù)量最低，占總OTU的0.11%～0.12%。在減氮施肥處理中,未知類群的相對豐度和不施氮肥相似，但相對于常規(guī)施肥處理有所減少；泉古菌門類群相對豐度在減氮施肥處理中和不施氮肥處理相似，略高于常規(guī)施肥處理。奇古菌門類群相對豐度在3個處理變化不大。在屬水平，所有處理只檢測出1個已知屬為亞硝化球菌屬(Nitrososphaera)(歸屬于奇古菌門)，其相對豐度為0.07%～0.08%，不同施氮水平對亞硝化球菌屬(Nitrososphaera)相對豐度沒有顯著影響。

所有處理的AOB OTU歸屬于4門、5綱、6目、8科、12屬。在門水平上，變形桿菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢門，占總OTU的17.12%～17.57%。其次為未知類群(Unclassified group)，占總OTU的15.53%～16.00%。不同處理對變形桿菌門和未知類群的相對豐度沒有顯著影響。在屬水平，所有處理中檢測出的已知屬為亞硝化弧菌屬(Nitrosovibrio)和亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)(歸屬于變形桿菌門)，亞硝化螺菌屬的相對豐度(2.78%～3.06%)遠(yuǎn)高于亞硝化弧菌屬(0.05%～0.07%)。亞硝化螺菌屬的相對豐度在減氮施肥處理中低于常規(guī)施肥處理，但差別不明顯。亞硝化弧菌屬的相對豐度在減氮施肥處理中最高，但差別也不明顯。

2.4 在門和屬水平上AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)的變化

如圖1所示，在門水平上，隨著小麥生長，各處理AOA的未知類群相對豐度逐漸增加。而泉古菌門和奇古菌門的相對豐度在成熟期處于較低水平。在減氮施肥處理中，Nitrososphaera屬的相對豐度隨著小麥生長逐漸下降，與不施氮肥處理中Nitrososphaera屬變化一致；而常規(guī)施肥處理中，Nitrososphaera屬的相對豐度在拔節(jié)期達(dá)到最高。

圖1 不同生育時期的不同處理AOA(a、b)及AOB(c、d)在門和屬上的群落組成

對于AOB，變形菌門的相對豐度在拔節(jié)期達(dá)到較高水平。而未知類群的相對豐度在拔節(jié)期處于最低水平。亞硝化螺菌屬的相對豐度隨著小麥生長逐漸增大，在小麥成熟期達(dá)到最大，在不同的施氮水平下，亞硝化螺菌屬的相對豐度無明顯的差別。

2.5 AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

選擇土壤的硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量、pH值和潛在硝化速率為環(huán)境變量，通過冗余分析(RDA)評估這些環(huán)境變量與AOA和AOB群落的相關(guān)性(圖2)。對于AOA，第一軸(RDA1)和第二軸(RDA2)分別占環(huán)境變量和AOA群落之間總變異的6.70%和4.97%。常規(guī)施肥、減氮施肥處理和不施氮肥處理之間有明顯的分離，表明常規(guī)施肥處理改變了AOA的群落分布。常規(guī)施肥處理AOA的OTU分布與土壤pH值、硝態(tài)氮含量和銨態(tài)氮含量呈正相關(guān)，而減氮施肥處理的AOA分布與土壤潛在硝化速率呈正相關(guān)。對于AOB，RDA1和RDA2分別占環(huán)境變量和AOB群落之間總變異的11.01%和5.52%。成熟期與其他2個生育時期有分離，表明小麥的不同生長階段對AOB群落分布有一定影響。而土壤潛在硝化速率與成熟期的AOB呈正相關(guān)關(guān)系。

圖2 AOA(a)及AOB(b)群落結(jié)構(gòu)與土壤性質(zhì)的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

在不同采樣階段，不同施氮量處理的AOA Chao指數(shù)均高于AOB。AOA OTU高于AOB，這與LEININGER等[17]和CHEN等[14]的研究結(jié)果一致。不同施氮水平對AOB 的Chao指數(shù)沒有顯著影響。除了減氮施肥處理在小麥起身期AOA的Chao指數(shù)高于其他2個處理，其余時期不同施氮水平對AOA的Chao指數(shù)也沒有顯著影響。楊亞東等[18]在研究施氮肥對華北平原土壤AOB和AOA數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的影響時發(fā)現(xiàn)，與增施氮肥相比，不施氮肥和減施氮肥水平下，AOB數(shù)量顯著降低，但對AOA數(shù)量影響不顯著，可能因為是該團(tuán)隊進(jìn)行了為期6 a的試驗，而本研究只進(jìn)行了小麥一季的試驗。另外，楊亞東等[18]試驗土壤的堿性(pH>8)強(qiáng)于本試驗土壤(pH<7.4)。有研究表明，堿性有助于增強(qiáng)AOB對氮肥的敏感性[19]。為此，試驗周期短及土壤堿性不高可能導(dǎo)致AOB對不同施氮水平反應(yīng)不敏感。各處理AOB的Chao指數(shù)在成熟期最低，潛在硝化速率在成熟期也最低，兩者趨勢相同，由此推測AOB可能主導(dǎo)著小麥土壤根際氨氧化作用。

在小麥不同生長階段，不同施氮水平對AOB的優(yōu)勢門—變形菌門的相對豐度沒有明顯影響。在拔節(jié)期，變形菌門相對豐度較高于其他采樣階段。在屬水平上，亞硝化螺菌屬相對豐度為亞硝化弧菌屬的30倍以上。亞硝化螺菌屬在起身期和拔節(jié)期，相對豐度的變化趨勢與潛在硝化速率相似，在成熟期，兩者變化趨勢相反，可能受較低銨態(tài)氮含量限制導(dǎo)致潛在硝化速率降低，硝化速率通常受底物利用率的限制，這與BOOTH等[20]研究結(jié)果相似。而亞硝化螺菌屬相對豐度及硝化速率的降低，也表明亞硝化螺菌屬在小麥根際硝化作用中起著重要作用。

在門水平上，AOA的優(yōu)勢類群為未知類群，減氮施肥處理中未知類群的相對豐度與不施氮肥處理無明顯差別，而低于常規(guī)施肥處理，未知類群的相對豐度隨著小麥生長和施氮水平的增加而增加，在成熟期時各處理相對豐度達(dá)到最大，與潛在硝化速率變化趨勢不同。氨氧化作用中主要的微生物一直被認(rèn)為是AOB，但有研究發(fā)現(xiàn)AOA中泉古菌門和奇古菌門也是氨氧化過程的重要參與者[21]。由微生物群落組成分析可知，泉古菌門與奇古菌門在成熟期相對豐度最低，與潛在硝化速率變化趨勢相似，可推測AOA的泉古菌門與奇古菌門參與了氨的氧化。

綜上所述，減氮施肥處理的硝態(tài)氮含量在起身期和拔節(jié)期均低于常規(guī)施肥處理且高于不施氮肥處理，而銨態(tài)氮含量在起身期和拔節(jié)期均低于常規(guī)施肥處理和不施氮肥處理，但并沒有明顯降低潛在硝化速率。小麥根際中AOA的Chao指數(shù)顯著高于AOB，表明AOA大量存在于農(nóng)田中，而且AOA也參與了小麥根際的氨氧化作用。冗余分析表明，AOB在氨氧化作用中可能起主導(dǎo)作用。在整個小麥生長過程中，與常規(guī)施肥處理相比，減氮施肥處理沒有對根際土壤中氨氧化微生物的群落組成和豐度產(chǎn)生顯著的削弱影響。