朱冉冉，吉雪花，張中榮，李慧姬，張海英

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系/特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子,832003)

超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于真核細(xì)胞與原核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中[1]是活性氧清除系統(tǒng)中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶。胡景江等[2]對(duì)元寶楓進(jìn)行模擬脅迫發(fā)現(xiàn)，干旱條件下SOD活性先下降后逐漸回升至正常水平；在NaCI和Na2SO4脅迫下阿月渾子葉片中的SOD活性顯著升高[3]。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，對(duì)SOD家族的探索也逐漸深入。有關(guān)SOD的研究主要集中在擬南芥[4]、煙草[5]和水稻[6]上,而有關(guān)辣椒SOD基因功能的研究較少。本文研究利用生物信息學(xué)對(duì)辣椒 SOD基因家族成員進(jìn)行分析，以期深入挖掘該基因家族在辣椒上的生物學(xué)功能，為深入闡明辣椒抗逆奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 辣椒SOD基因的獲取及序列分析

從Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載辣椒SOD隱馬爾科夫模型SOD-1(PF00080)、SOD-2(PF02777)和SOD-3(PF00081)作為種子序列，下載辣椒基因組數(shù)據(jù)庫PGP(http://peppergenome.snu.ac.kr/，品種為 CM334 和Zunla-1中注釋的蛋白序列。利用HMMER3.0搜索SOD蛋白數(shù)據(jù)庫[7]，設(shè)置E<1×10-5。搜索結(jié)果利用NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.g/Stuctu/ cdd/wrpsb.cgi)工具進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域鑒定，刪除不含SOD結(jié)構(gòu)域的基因，利用 ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)辣椒SOD基因序列的分子量、氨基酸數(shù)量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性系數(shù)、親疏水性進(jìn)行分析。

1.2 辣椒SOD基因序列結(jié)構(gòu)分析

對(duì)鑒定出的辣椒SOD基因家族成員利用GSDS軟件分析其基因結(jié)構(gòu)，利用MEME(http://meme- suite.org/)在線軟件分析SOD蛋白的保守域和結(jié)構(gòu)元件(motif 數(shù)量設(shè)置為 10)。

1.3 辣椒SOD基因進(jìn)化樹分析

利用ClustalW 軟件對(duì)辣椒和擬南芥的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA5.0 軟件用相鄰連接法繪制進(jìn)化樹，重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000，構(gòu)建辣椒和擬南芥的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 辣椒SOD基因家族在不同組織中的表達(dá)量

利用已經(jīng)完整測序的CM334組織和發(fā)育階段的數(shù)據(jù)，結(jié)合TBtools分析SOD基因在辣椒各發(fā)育時(shí)期和組織的表達(dá)情況。

1.5 辣椒SOD基因家族蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析

利用SOMPA、SWISS-MODEL對(duì)辣椒SOD蛋白序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒SOD主結(jié)構(gòu)域鑒定

借助NCBI-CDD工具進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域鑒定，去除不含有SOD基因家族主結(jié)構(gòu)域的成員，其他成員分屬于5個(gè)基因超家族，如圖1所示。

圖1 辣椒SOD基因家族主結(jié)構(gòu)域

2.2 辣椒SOD蛋白理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，對(duì)植物表型的建成起著重要作用。利用ProtParam tool在線軟件分析辣椒SOD蛋白理化性質(zhì),結(jié)果(表1)表明：氨基酸數(shù)目在55～326之間；分子量介于5 753.35～34 557.55；分子量與氨基酸數(shù)目成正比；理論等電點(diǎn)在4.80～9.84之間，多數(shù)為酸性蛋白。總平均疏水性結(jié)果顯示，除CA01g03860、CA06g07250、Capana06g002288為疏水性蛋白外，其余均為親水性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)結(jié)果顯示所有辣椒SOD家族成員均為穩(wěn)定蛋白。

表1 辣椒SOD 基因家族蛋白理化性質(zhì)

續(xù)表

2.3 辣椒SOD基因結(jié)構(gòu)與蛋白基序分析

從辣椒PGP(http://peppergenome.snu.ac.kr/)數(shù)據(jù)庫中下載SOD基因注釋文件，利用GSDS軟件繪制結(jié)構(gòu)分布圖,結(jié)果(圖2)顯示：辣椒SOD各基因所含內(nèi)含子數(shù)目、長度均不相同。內(nèi)含子數(shù)目在1～9之間,其中CA00g10900內(nèi)含子數(shù)目最少僅1個(gè)，Capana06g001955內(nèi)含子數(shù)目最多有9個(gè)。

利用MEME 在線軟件對(duì)辣椒SOD基因蛋白序列進(jìn)行保守基序分析，結(jié)果(圖3)顯示：位于同一亞族的SOD 基因都含有相似的保守基序，如CA01g03860、CA01g25550、CA05g14670、Capana10g000115、CA10g01740、Capana11g000173都含有motif3 基序,CA06g09510、Capana12g001441、Capana06g001955、CA06g07250、CA00g10900、Capana06g002288、Capana01g003728、CA12g06850、CA05g15860都含有motif2 基序。

圖2 辣椒SOD家族基因結(jié)構(gòu)

圖3 辣椒SOD家族蛋白保守基序

2.4 辣椒SOD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

借助MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)化分析結(jié)果(圖4)顯示：辣椒SOD 基因家族可分為2個(gè)亞家族,其中GroupⅠ(圖4 紫色部分)包括CA01g03860、CA01g25550、Capana10g00011、Capana11g000173、CA10g01740、CA05g14670,GroupⅡ(圖4 綠色部分)包括Capana12g001441、CA06g09510、Capana06g001955、CA06g07250、Capana06g002288、Capana01g003728、CA05g15860、CA00g10900、CA12g06850。辣椒和擬南芥的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，辣椒SOD 基因家族成員在擬南芥中均有分枝。

2.5 辣椒SOD基因表達(dá)模式分析

根據(jù)辣椒各組織基因表達(dá)譜RNA-seq 的數(shù)據(jù)進(jìn)行SOD 基因組織特異性表達(dá)分析[8]。本文研究利用已經(jīng)完整測序的CM334 組織和發(fā)育階段的數(shù)據(jù)分析SOD 基因在辣椒各發(fā)育時(shí)期和組織的表達(dá)情況，結(jié)果見圖5。

圖5中原始數(shù)據(jù)來自 CM334 各組織的 RNA-seq 數(shù)據(jù)，分析的組織有花后6、16、25 d 的根、莖、葉、果皮(PC)和胎座(PL),以及綠熟期(MG)、破色期(B)、破色期后 5 d(B5)和破色期后 10 d(B10)的 PC 和 PL；使用TBtools 繪制 8個(gè)辣椒 SOD 基因的熱圖，顏色從綠到紅代表表達(dá)量由低到高,其他數(shù)據(jù)使用 log 2 校正。

由圖5可知：CA01g03860、CA10g01740 基因在花后不同組織中和各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)均高于其他基因。CA05g14670、CA12g06850 在花后根、莖、葉、綠熟期、花后胎的胎座表達(dá)相對(duì)較高，在其他組織表達(dá)量相對(duì)較低；CA06g09510、CA06g07250 在花后莖中的表達(dá)量高于根、葉等其他組織，花后CA01g25550 在各組織的表達(dá)均較低。

圖5 辣椒SOD基因家族組織表達(dá)分析

2.6 辣椒SOD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

借助SOMPA分析辣椒SOD基因家族的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果(表2)表明：大多數(shù)SOD基因家族成員的結(jié)構(gòu)比例由高到低依次是無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角；無規(guī)則卷曲比例在26.32%～63.64%之間，β-轉(zhuǎn)角絕大多數(shù)低于10%；預(yù)測無規(guī)則卷曲、α-螺旋在SOD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)。

表2 辣椒SOD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.7 辣椒SOD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SWISS-MODEL對(duì)辣椒SOD蛋白序列進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)辣椒SOD蛋白均有α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲等空間構(gòu)象，但結(jié)構(gòu)上仍存在差異，不同的SOD蛋白含有不同數(shù)目的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)。

圖6 辣椒SOD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

3 討論

(1)SOD是植物體內(nèi)清除ROS系統(tǒng)的重要組成部分，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷、持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性、增強(qiáng)植物抗逆性等方面具有重要作用[9]。自玉米中獲得第1個(gè)SOD 基因以來[10]，在其他的植物中也克隆了該家族基因。學(xué)者們對(duì)高粱、棉花等SOD 基因家族進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析[11-12]。全基因組分析技術(shù)的發(fā)展以及辣椒全基因組測序工作的完成為闡明辣椒SOD 基因家族成員的生物學(xué)功能提供了重要的數(shù)據(jù)支持。

(2)SOD 蛋白分為三類，其中SOD1 包含一個(gè)桶狀結(jié)構(gòu)，由β螺旋形成，并具分子內(nèi)二硫鍵，且在每個(gè)亞基中含一個(gè)雙核的Cu/Zn 位點(diǎn)，此位點(diǎn)中含有的銅離子和鋅離子能夠促進(jìn)超氧歧化反應(yīng)[13]。編碼SOD2 的基因包含4 個(gè)內(nèi)含子和5 個(gè)外顯子，能夠在線粒體基質(zhì)中編碼同源四聚體蛋白[14]。SOD3 屬于胞外超氧化物歧化酶，在胞外分泌并形成糖基化的同源四聚體，能夠與細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、膠原蛋白發(fā)生反應(yīng)，完成催化作用[15]。已知SOD 的活性中心都有1 個(gè)金屬離子，在植物體中根據(jù)金屬的不同可分為Mn-SOD、Cu/Zn-SOD 和Fe-SOD 三種類型，在香蕉[16]、萵苣[17]、龍眼[18]等植物中已克隆到Fe-SOD 基因。研究表明Fe-SOD 基因廣泛參與了植物對(duì)逆境脅迫的抵抗[19]，如普通小麥幼苗對(duì)鹽、ABA、低溫和高溫脅迫中Fe-SOD 基因起了重要調(diào)節(jié)作用[20]。煙草的Cu/Zn-SOD 基因可以響應(yīng)鹽堿脅迫[20]。Fe-SOD1 基因可以增強(qiáng)番茄對(duì)致病疫霉的抗性[21]。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這三種類型的SOD 在辣椒中均有存在，說明辣椒的抗逆性強(qiáng)弱與SOD 活性密切相關(guān)。

(3)本研究利用生物信息學(xué)手段對(duì)辣椒SOD基因家族的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行預(yù)測分析，為后期進(jìn)一步研究該基因家族的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

(1)辣椒SOD蛋白的分子量與氨基酸數(shù)目成正比，多為酸性穩(wěn)定親水性蛋白；辣椒SOD各基因所含內(nèi)含子數(shù)目介于1～9之間。

(2)辣椒SOD基因可粗分為2個(gè)亞家族，Group I 是出現(xiàn)最早的亞家族；位于同一亞族的SOD基因具有相似的保守基序。

(3)辣椒與擬南芥的SOD基因具有很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)相似性。

(4)CA01g03860、CA10g01740 在花后不同組織中和各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)均高于其他基因。

(5)無規(guī)則卷曲、α-螺旋在辣椒SOD蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位。