周宇明 黃振 段真珍 李慧雪 暴怡雪 張木清 姚偉
摘 ?要:甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)是生物細(xì)胞膜合成所需的一個非常重要的酶,在病原菌的耐藥性、致病性和生長繁殖等方面發(fā)揮著非常重要的作用。研究表明干擾真菌的CYP51基因表達(dá)導(dǎo)致其無法正常生長,顯著降低其致病性。本研究以甘蔗梢腐病菌甘蔗鐮刀菌(Fusarium sacchari)為試驗材料,根據(jù)基因組測序數(shù)據(jù)設(shè)計特異性引物克隆得到了FsCYP51基因全長和CDS全長。生物信息學(xué)分析表明,該基因序列全長1947 bp,編碼區(qū)由2個內(nèi)含子和3個外顯子組成,CDS全長1554 bp,編碼517個氨基酸,編碼蛋白理論相對分子量為58.61 kDa。其編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲構(gòu)成,具有典型的CYP51保守結(jié)構(gòu)域。預(yù)測其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜,且存在2個跨膜區(qū)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,F(xiàn)sCYP51基因?qū)儆贑YP51C這一類,與串珠鐮刀菌(F. verticillioides)的CYP51C基因親緣關(guān)系最近。同時,根據(jù)克隆到的基因全長和CDS全長構(gòu)建了多價HIGS植物表達(dá)載體,并利用基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將干擾片段成功轉(zhuǎn)化至甘蔗受體材料,為研究FsCYP51基因功能和創(chuàng)制抗梢腐病甘蔗種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞:甘蔗鐮刀菌;CYP51;基因克隆;HIGS;遺傳轉(zhuǎn)化
中圖分類號:S432.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A
Abstract: CYP51 is a very important enzyme for the biosynthesis of biological cell membrane, and plays a very impor-tant role in drug resistance, pathogenicity, growth and reproduction of pathogens. The interference with expression of CYP51 gene in fungi can prevent its normal growth and significantly reduce its pathogenicity. In this study, the full length of FsCYP51 gene and CDS were cloned by designing specific primers based on the genome sequencing data of Fusarium sacchari. Bioinformatics analysis showed that the total length of the gene was 1947 bp, and the coding region consisted of two introns and three exons. The total length of CDS was 1554 bp, encoding 517 amino acids. The theoretical relative molecular weight of the coding protein was 58.61 kDa. The secondary structure of the encoded protein was mainly composed of α-helix and random coils, and it had a typical conserved domain CYP51. Its subcellular localization was predicted in the cell membrane and there were two transmembrane regions. Phylogenetic analysis showed that the FsCYP51 gene belonged to the CYP51C class, and was closely related to the CYP51C gene of F. verticillioides. At the same time, according to the full length of the gene and CDS, the polyvalent HIGS plant expression vector was constructed, and transformed into sugarcane by particle bombardment,which would lay a foundation for the study of function of FsCYP51 gene and the creation of transgenic sugarcane resistant to Pokkah boeng disease.
Keywords: Fusarium sacchari; CYP51; gene cloning; HIGS; genetic transformation
DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.011
甘蔗(Saccharum officinarum L.)屬禾本科甘蔗屬植物,是我國最主要的糖料作物[1]。甘蔗梢腐?。╬okkah boeng disease)是一種世界分布廣泛的真菌性病害[2]。甘蔗鐮刀菌(Fusarium sacchari)是中國甘蔗梢腐病的主要病原菌菌之一[3]。近幾年由于甘蔗的連年種植以及新臺糖系列等易感病品種的大面積推廣[4],我國的甘蔗梢腐病呈現(xiàn)爆發(fā)的趨勢,嚴(yán)重影響了甘蔗的生產(chǎn)和種植區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,已逐漸成為我國甘蔗的主要病害之一[5-6]。因此對甘蔗梢腐病的防控將是甘蔗產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。
甾醇14α-去甲基化酶(sterol 14α-demethy?lase,P45014DM, CYP51)屬于細(xì)胞色素P450超家族成員,是生物細(xì)胞膜形成所需的一個非常重要的酶[7]。CYP51的缺乏將導(dǎo)致細(xì)胞膜無法正常形成,最終導(dǎo)致真菌無法正常生長[8]。目前研究人員已在多種病原真菌中發(fā)現(xiàn)了CYP51的同源基因,不同真菌的CYP51基因數(shù)目是不盡相同的,有的真菌僅含有CYP51A一種,某些真菌如煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidμLans)、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)等有CYP51A和CYP51B兩種[9],指狀青霉(Penicillium digitatum)[10]、禾谷鐮刀菌(Fusarium gramin?earum)[11]等有CYP51A、CYP51B 和CYP51C三種。通過對CYP51同源基因的功能研究發(fā)現(xiàn)CYP51基因的功能非常豐富,在病原菌的抗藥性、致病性、孢子產(chǎn)生等方面起著重要作用。例如在引起柑橘腐爛的指狀青霉中,PdCYP51A和PdCYP51B基因會影響它的抗藥性[10]。在一些絲狀真菌如煙曲霉菌[12]、禾谷鐮刀菌[13]中發(fā)現(xiàn)的同源CYP51基因被證實與病原菌對DMI殺菌劑的敏感性有關(guān),這可能是真菌抗DMI的一種新機(jī)制。在禾谷鐮刀菌中,F(xiàn)gCYP51A和FgCYP51B都能編碼14α-去甲基化酶,F(xiàn)gCYP51B同時對病原菌的子囊孢子形成起重要作用,F(xiàn)gCYP51C不編碼14α-脫甲基化酶但對病原菌的毒力至關(guān)重要[11]。
寄主誘導(dǎo)的基因沉默(host-induced gene si-lencing, HIGS)是基于RNAi的一種新型抗病育種技術(shù),通過在寄主植物中表達(dá)病原菌基因的dsRNA來沉默病原菌中靶標(biāo)基因的表達(dá)達(dá)到抗病的效果。HIGS技術(shù)不僅可以用來研究病原菌重要致病基因功能,而且也是創(chuàng)制抗病轉(zhuǎn)基因作物的一種新方法,在小麥條銹病[14]、小麥赤霉病[15]、水稻稻瘟病[16]、香蕉枯萎病[17]等的研究中有著充分的運用,但目前HIGS技術(shù)在甘蔗上的應(yīng)用較少,因此建立適用于甘蔗梢腐病菌基因功能研究的HIGS體系是研究甘蔗梢腐病菌致病機(jī)制所必需的,也是創(chuàng)制抗病甘蔗新種質(zhì)的一種快速有效的方法。
利用HIGS技術(shù)沉默病原菌CYP51基因表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因作物的抗病性。Koch等[18]利用HIGS技術(shù)在擬南芥和大麥中表達(dá)了禾谷鐮刀菌(F. graminearum)FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C基因串聯(lián)片段的dsRNA,得到的轉(zhuǎn)基因大麥和擬南芥對禾谷鐮刀菌的抗性顯著提高。目前關(guān)于甘蔗鐮刀菌CYP51基因的研究尚未見報道,本研究基于課題組分離到的甘蔗梢腐病甘蔗鐮刀菌(Fusarium sacchari)野生型菌株CNO-1及其基因組數(shù)據(jù),從甘蔗鐮刀菌中成功克隆其CYP51基因全長和CDS全長,采用生物信息學(xué)方法對其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了分析,同時,基于克隆到的基因全長和CDS全長,選取了保守且特異3個區(qū)段作為靶標(biāo)片段并構(gòu)建了HIGS多價干擾載體,并成功轉(zhuǎn)化至甘蔗,為研究甘蔗鐮刀菌CYP51基因功能和創(chuàng)制抗梢腐病轉(zhuǎn)基因甘蔗的打下基礎(chǔ)。
1 ?材料與方法
1.1 ?材料
材料:甘蔗梢腐病主要致病菌甘蔗鐮刀菌(Fusarium sacchari)菌野生型菌株CNO-1由課題組分離獲得,并對其進(jìn)行了精細(xì)基因組測序與序列分析(待發(fā)表),獲得了FsCYP51基因全長和CDS全長序列。易感梢腐病甘蔗品種‘中蔗1號’由課題組提供。
試劑:反轉(zhuǎn)錄試劑盒、各類限制性核酸內(nèi)切酶、T4-DNA連接酶、DNA Marker購自Takara(大連)公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購買自北京天根生化科技有限公司;引物合成、序列測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成;HIGS植物干擾表達(dá)載體pBWA(V)BU載體由課題組保存;用于RNA提取用的Trizol試劑購于生工生物工程(上海)股份有限公司;各類PCR Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;平端克隆pEASY?-Blunt Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;基因槍(Bio-Rad PDS-1000/He)及其耗材均購自Bio- Rad公司;其他試劑和耗材購自生工生物工程(上海)股份有限公司或國產(chǎn)分析純試劑。
1.2 ?方法
1.2.1 ?基因組DNA和總RNA的提取及cDNA合成 ? 用課題組改良的SDS法提取甘蔗鐮刀菌基因組DNA。使用Trizol法提取甘蔗鐮刀菌總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(nanodrop)檢測所提取的DNA和RNA的純度和濃度。使用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行cDNA合成,反應(yīng)體系與程序參照試劑盒說明書進(jìn)行。提取的基因組DNA用于基因全長克隆,逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于CDS全長克隆。
1.2.2 ?甘蔗鐮刀菌FsCYP51基因全長和CDS全長克隆 ?根據(jù)課題組前期基因組測序的結(jié)果,用軟件Primer Premier 5分別設(shè)計擴(kuò)增基因全長的特異引物FsCYP51QC-F/R和擴(kuò)增基因CDS的特異引物FsCYP51CDS-F/R(表1)。用引物FsCYP51QC-F/R和引物FsCYP51CDS-F/R分別以基因組DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,切膠回收長度符合預(yù)期的條帶,連接到克隆載體pEASY?-Blunt上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)Top10感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定陽性克隆后提取質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。
1.2.3 ?FsCYP51基因的生物信息學(xué)分析 ?利用在線分析工具ProtParam(https://web.expasy.org/ protparam/)對FsCYP51蛋白序列進(jìn)行分析;利用在線軟件GSDS2.0[19](http://gsds.gao-lab.org/)對FsCYP51的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;利用NCBI CDD數(shù)據(jù)庫分析FsCYP51蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域;利用在線軟件SignalP-5.0 Server分析FsCYP51蛋白的信號肽;用在線分析軟件NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對FsCYP51蛋白潛在的磷酸化修飾位點進(jìn)行預(yù)測;通過在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)分析FsCYP51蛋白二級結(jié)構(gòu);利用在線軟件Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/ html/page.cgi?id=index)預(yù)測FsCYP51蛋白三級結(jié)構(gòu);利用在線工具TMHMM Server v2.0(http:// www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析FsCYP51蛋白可能的跨膜結(jié)構(gòu);運用在線工具CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)預(yù)測FsCYP51蛋白亞細(xì)胞定位;用FsCYP51蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast并下載搜索到的常見鐮刀菌CYP51蛋白序列,用MEGA 6軟件釆用鄰近法(neighbor-joining,bootstrap replications=1000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.2.4 ?FsCYP51基因HIGS植物表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)克隆到的FsCYP51的CDS序列和基因全長序列,選取FsCYP51基因CDS的2個特異區(qū)段和UTR區(qū)的1個區(qū)段,并將這3個區(qū)段串聯(lián)成一個片段作為HIGS靶標(biāo)片段,串聯(lián)片段由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。結(jié)合RNAi植物表達(dá)載體上的酶切位點,利用Primer Premier 5設(shè)計了分別用于擴(kuò)增正向靶標(biāo)序列tgtf、反向靶標(biāo)序列tgtr和連接它們的loop片段的引物tgtf-F/R、tgtr-F/R和loop-F/R(表1),以合成的靶標(biāo)片段為模板進(jìn)行PCR,1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收相應(yīng)的目的片段。將載體pBWA(V)BU用限制性內(nèi)切酶Eco31 I酶切線性化,3個擴(kuò)增回收目的的片段用Aar I進(jìn)行酶切,回收酶切產(chǎn)物。將3個酶切目的片段和線性化載體在同一反應(yīng)中進(jìn)行連接,連接體系:T4 DNA Ligase 1 μL,10×Buffer 1 μL,線性化pBWA(V)BU載體1 μL,tgtF片段1 μL,tgtR片段1 μL,loop片段0.5 μL,16 ℃連接過夜,轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞后,在含50 mg/L Kan的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)12~14 h,隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定,然后將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。
1.2.5 ?基因槍介導(dǎo)HIGS表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗
將測序驗證正確的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng),提取大量質(zhì)粒。參考吳楊[20]的方法轉(zhuǎn)化甘蔗,利用基因槍在71.12 cm汞柱真空度,1100 psi轟擊壓力和6 cm轟擊距離的條件下轟擊甘蔗胚性愈傷組織,在含有G418的培養(yǎng)基經(jīng)過篩選、分化和生根等一系列培養(yǎng)后得到抗性植株,用CTAB法提取抗性植株的基因組DNA,稀釋基因組DNA濃度至50 ng/μL,以此為模板,同時以構(gòu)建好的干擾重組載體質(zhì)粒為陽性對照,未轉(zhuǎn)化的甘蔗植株基因組DNA為陰性對照,用于溶解DNA的ddH2O作為空白對照,為了提高PCR檢測的準(zhǔn)確性,根據(jù)干擾表達(dá)載體序列和靶標(biāo)基因序列設(shè)計如表1中的tgtf-F/R和G418-F/R這2對引物進(jìn)行PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株,這2對引物擴(kuò)增到的預(yù)期片段大小分別為645 bp和1660 bp。
2 ?結(jié)果與分析
2.1 ?FsCYP51的基因全長和CDS克隆
將提取的甘蔗鐮刀菌總RNA和基因組DNA用nanadrop測量濃度和純度,結(jié)果顯示提取的RNA的濃度在300 ng/μL左右,A260/A280比值在1.9~2.1的范圍內(nèi),DNA的濃度在700 ng/μL左右,A260/A280比值在1.8~2.0的范圍內(nèi),1%瓊脂糖凝膠電泳顯示提取的DNA和RNA的完整
性較好,可以進(jìn)行下一步實驗。用引物FsCYP51 QC-F/R以基因組DNA為模板進(jìn)行基因全長擴(kuò)增;用南京諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒以RNA為模板進(jìn)行cDNA合成,然后用引物FsCYP51CDS-F/R以得到的cDNA為模板進(jìn)行CDS全長擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(圖1),可以得到長度分別為2000 bp左右的基因全長片段和1500 bp左右的CDS全長片段,回收相應(yīng)的片段連接到克隆載體,用M13通用引物對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,結(jié)果顯示克隆到的FsCYP51的基因全長和CDS全長與基因組的數(shù)據(jù)是一致的,F(xiàn)sCYP51基因全長1947 bp,CDS全長1554 bp,編碼517個氨基酸。
2.2 ?FsCYP51基因的生物信息學(xué)分析
2.2.1 ?FsCYP51基因結(jié)構(gòu)分析及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 ?將克隆到的FsCYP51基因全長和CDS全長通過在線軟件GSDS2.0進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析(圖2),結(jié)果顯示FsCYP51基因編碼區(qū)由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。利用ProtParam在線分析軟件對FsCYP51蛋白氨基酸進(jìn)行理化性質(zhì)分析。FsCYP51蛋白由517個氨基酸組成,理論分子量為58.61 kDa,理論等電點pI=6.61。不穩(wěn)定指數(shù)為42.87,說明該蛋白的穩(wěn)定性較差。此外,脂肪族氨基酸指數(shù)達(dá)83.52,總平均親水指數(shù)為–0.239,說明該蛋白為親水性蛋白。利用程序ProtScale對FsCYP51蛋白氨基酸的親水性進(jìn)行在線分析,組成FsCYP51蛋白的氨基酸多為親性氨基酸,表明該蛋白有較強(qiáng)的親水性。
2.2.2 ?FsCYP51蛋白信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測 ?用在線工具TMHMM Server v. 2.0對FsCYP51蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(圖3),發(fā)現(xiàn)在FsCYP51蛋白第26位至第45位氨基酸和第57位至第77位氨基酸可能是2個跨膜螺旋,由此推測FsCYP51蛋白為跨膜蛋白。通過SignalP-5.0對FsCYP51蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其不含有信號肽,表明FsCYP51蛋白不是分泌型蛋白。通過在線工具CELLO v.2.5預(yù)測FsCYP51蛋白的亞細(xì)胞定位,預(yù)測結(jié)果顯示FsCYP51蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜、溶酶體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體的可能性分別為1.953、0543、0.489、0.374、0.369,預(yù)測FsCYP51蛋白定位在細(xì)胞膜。
2.2.3 ?FsCYP51基因編碼氨基酸磷酸化修飾的預(yù)測和分析 ?通過在線分析軟件NetPhos 3.1 Server將FsCYP51蛋白的氨基酸序列進(jìn)行磷酸化修飾預(yù)測。結(jié)果顯示,F(xiàn)sCYP51蛋白質(zhì)的多個氨基酸位點可以發(fā)生潛在的磷酸化修飾,預(yù)測FsCYP51蛋白質(zhì)中有20個Ser(絲氨酸)位點可發(fā)生磷酸化修飾,有17個Thr(蘇氨酸)位點可發(fā)生磷酸化修飾,9個Tyr(酪氨酸)位點可發(fā)生磷酸化修飾(圖4)。此外發(fā)現(xiàn)FsCYP51蛋白可能存在cdc2蛋白激酶的4個Ser和3個Thr磷酸化位點,而且可能存在蛋白激酶C(PKC)的4個Ser和7個Thr磷酸化位點,推測FsCYP51蛋白可能需要進(jìn)行磷酸化修飾來激發(fā)其活性。
2.2.4 ?FsCYP51蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域分析 ?將甘蔗梢腐病菌FsCYP51蛋白通過SOPM和Phyre2進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)(圖5A)和三級結(jié)構(gòu)分析(圖5B),結(jié)果表明FsCYP51蛋白的二級結(jié)構(gòu)有α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲,分別占比47.97%、11.61%、3.09%和37.33%。因此FsCYP51蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)形式存在。利用NCBI的CDD功能分析FsCYP51蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(圖6),發(fā)現(xiàn)在其第72位至第510位氨基酸序列之具有CYP51- like保守結(jié)構(gòu)域,說明該蛋白屬于p450家族中的CYP51蛋白。
2.2.5 ?FsCYP51基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建分析 ?為了解FsCYP51基因在鐮刀菌中的進(jìn)化情況,用FsCYP51蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST,下載了常見鐮刀菌的CYP51蛋白。利用MEGA 6選擇鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)??梢悦黠@地看出系統(tǒng)進(jìn)化樹按照CYP51A、CYP51B和CYP51C這三類分為3個分支,F(xiàn)sCYP51基因?qū)儆贑YP51C這一類基因。其中F. sacchari CYP51(FsCYP51)與串珠鐮刀菌F. verticillioides CYP51C、尖孢鐮刀菌F. oxysporum CYP51C、頂腐病菌F. subglutinans CYP51C和層出鐮刀菌F. proliferatum CYP51C基因在CYP51C類的同一小簇中,說明它們的同源性更高,表明這5個基因在進(jìn)化關(guān)系上更為接近,物種進(jìn)化關(guān)系較為密切。其中FvCYP51與FsCYP51的同源性最高,表明這2個真菌在物種進(jìn)化過程中親緣關(guān)系更近。
2.3 ?FsCYP51基因HIGS植物表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)干擾載體pBWA(V)BU和多價靶標(biāo)片段的序列,設(shè)計了3對帶有酶切位點的引物(表1)。以含有多價靶標(biāo)序列的克隆載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增正向靶標(biāo)序列(tgtF)和反向靶標(biāo)序列(tgtR)(圖8A),以含有l(wèi)oop序列的干擾載體pBWA(V) BU為模板擴(kuò)增loop序列(圖8B)。將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,分別切膠純化回收大小符合的條帶,可獲得帶有相應(yīng)酶切位點的大小分別為645 bp、645 bp和200 bp的正向靶標(biāo)片段、反向靶標(biāo)片段和loop片段。測量純度和濃度后,將載體pBWA(V)BU用限制性內(nèi)切酶Eco31 I酶切線性化,3個擴(kuò)增回收目的的片段用Aar I進(jìn)行酶切,回收酶切產(chǎn)物。將3個酶切目的片段和線性化載體在同一反應(yīng)中進(jìn)行連接,然后轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞。根據(jù)載體序列和loop序列設(shè)計分別設(shè)計了用來檢測正向靶標(biāo)序列(Pubiseq-F/ loop-R)和反向靶標(biāo)序列的兩組引物(表1)。隨機(jī)選取若干個轉(zhuǎn)化后在抗性平板上長出的單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定,預(yù)期擴(kuò)增的片段大小分別為929 bp和960 bp,電泳結(jié)果(圖8C)與預(yù)期的大小一致。提取陽性菌液質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶酶Eco32I進(jìn)行酶切驗證,酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。提交陽性質(zhì)粒至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果與預(yù)期一致,F(xiàn)sCYP51基因HIGS植物表達(dá)載體構(gòu)建成功,可用于遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗研究。
2.4 ?轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定
用改良CTAB法提取的抗性植株基因組DNA,以其為模板,同時分別以重組干擾載體作為陽性對照,以未轉(zhuǎn)基因甘蔗為陰性對照,以用于溶解基因組DNA的ddH2O為空白對照,用引物tgtf-F/R和G418-F/R進(jìn)行PCR檢測。引物tgtf-F/R和引物G418-F/R的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示分別有8株(圖9A)和7株(圖9B)抗性植株的基因組DNA擴(kuò)增到了相應(yīng)預(yù)期大小的條帶,而陰性對照和空白對照沒有對應(yīng)的電泳條帶,綜合2對引物的PCR鑒定均為陽性的結(jié)果,表明HIGS載體上的外源DNA片段已整合到甘蔗基因組中。
3 ?討論
CYP51首次是從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分離獲得[21],并且在動物(大鼠)[22]、植物(高粱)[23]、細(xì)菌(結(jié)核分枝桿菌)[24]中相繼被發(fā)現(xiàn),是分布最廣的P450家族成員。目前研究者已在多種病原鐮刀菌如禾谷鐮刀菌(F. gra-minearum)、串珠鐮刀菌(F. verticillioides)和尖胞鐮刀菌(F. oxysporum)等中發(fā)現(xiàn)了CYP51A、CYP51B、CYP51C這3個同源基因[25]。研究表明CYP51C基因是鐮刀菌屬物種特有的,可以作為鑒定鐮刀菌屬的一個特殊標(biāo)記基因[11]。本研究根據(jù)課題組對分離得到的甘蔗梢腐病菌(Fusarium sac-chari)野生型菌株CNO-1的基因組測序結(jié)果,成功克隆到甘蔗梢腐病菌FsCYP51基因全長和CDS全長,對其序列進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析。
本研究對FsCYP51蛋白的親水性、蛋白理化性質(zhì)、氨基酸磷酸化修飾、蛋白二級結(jié)構(gòu)、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位預(yù)測以及系統(tǒng)進(jìn)化樹等進(jìn)行預(yù)測或分析。氨基酸的親疏水性可以反映蛋白質(zhì)的折疊情況,在潛在的跨膜區(qū)域會出現(xiàn)疏水區(qū),在保持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)上起重要作用,而且蛋白的親疏水性圖譜可為蛋白跨膜區(qū)域的鑒定提供參考。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域為膜蛋白與膜脂相結(jié)合的主要部位。FsCYP51蛋白氨基酸多為親水性氨基酸,結(jié)構(gòu)上最主要是α-螺旋。通過結(jié)合蛋白親水性分析和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果,說明FsCYP51蛋白可能為跨膜蛋白,這與禾谷鐮刀菌中的研究是一致的[26]。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示FsCYP51蛋白可能定位在細(xì)胞膜中,這也符合其為膜結(jié)合蛋白的特征[27]。
研究表明禾谷鐮刀菌(F. graminearum)中的3個CYP51基因有著不同的功能,F(xiàn)gCYP51A和FgCYP51B編碼14α-脫甲基酶,F(xiàn)gCYP51B同時對病原菌的子囊孢子形成起重要作用,F(xiàn)gCYP51C不編碼14α-脫甲基酶但對病原菌的毒力至關(guān)重要[11]。而在甘蔗鐮刀菌(F. sacchari)中只鑒定到1個CYP51基因,經(jīng)過序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,可以看出FsCYP51屬于CYP51C這一類基因,這與其為鐮刀菌的鑒定結(jié)果是一致的。FsCYP51與FvCYP51C的同源性最高,達(dá)到了84.53%,這也符合這2個物種更為接近的親緣關(guān)系。甘蔗鐮刀菌中沒有CYP51A和CYP51B這2個基因,推測FsCYP51這個基因的功能可能會更加豐富,不僅僅編碼14α-脫甲基酶,可能還與病原菌致病性、毒力、子囊孢子形成等密切相關(guān),這將是下一步研究的重點,所以構(gòu)建了HIGS植物表達(dá)載體,并成功轉(zhuǎn)化甘蔗,為進(jìn)一步探究甘蔗鐮刀菌中CYP51基因的功能和創(chuàng)制抗梢腐病的轉(zhuǎn)基因甘蔗打下基礎(chǔ)。同時HIGS技術(shù)在甘蔗抗梢腐病研究中的應(yīng)用還未見報道,本研究是在甘蔗中轉(zhuǎn)入甘蔗梢腐病菌重要基因干擾片段來進(jìn)行HIGS試驗,具有重要的理論意義與應(yīng)用價值。
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