趙鵬 孫樹凱 翟玉娥 田清武 周廷廷 李靖

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003； 1 檢驗(yàn)科； 2 腎內(nèi)科)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(GBM)是人類最常見的原發(fā)性惡性腦組織腫瘤，有增殖快、侵襲能力強(qiáng)的特點(diǎn)[1-3]。目前對于GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是手術(shù)切除，并通過放療和化療輔助治療，此種方法治療的GBM患者預(yù)后非常差，平均生存率僅為13～15個月[4]。因此，探索GBM的發(fā)生機(jī)制、尋找靶向生物標(biāo)志物是目前該腫瘤研究的熱點(diǎn)。磷脂酶CB1(PLCB1)基因位于人類染色體20p12，作為最初G蛋白耦聯(lián)受體與PLCL3異構(gòu)體耦聯(lián)，進(jìn)而催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化成1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)與二酰甘油(DAG)[5]。PLCB1在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用，其激活后會引起細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，細(xì)胞增殖異常，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[6]。有研究表明，PLCB1的過表達(dá)會導(dǎo)致肝腫瘤細(xì)胞增殖，并與肝癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[7]。另有研究表明，PLCB1的異常表達(dá)與結(jié)腸癌密切相關(guān)[8]。但目前，PLCB1在GBM中的表達(dá)情況鮮見報道，本文的研究旨在探討PLCB1表達(dá)對GBM U87細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取2015年2月—2018年9月于我院經(jīng)手術(shù)切除的50例新鮮GBM組織(GBM組)及其癌旁非腫瘤組織(癌旁組)，每例樣本分為2份，另一份用于免疫組化分析，一份用于實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測。50例患者術(shù)前均未行化療或放療等抗腫瘤治療。所有樣本均經(jīng)病理科檢查確診。患者年齡10～87歲，平均年齡44.9歲；根據(jù)GBM分級Ⅰ級3例，Ⅱ級18例，Ⅲ～Ⅳ級29例。GBM U87細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。一抗兔抗人PLCB1多克隆抗體購自美國Abcam公司，PrimeScript RT-PCR試劑盒(No. RRO47A)購自日本Takara公司，生物素Biotin購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，胎牛血清及MEM培養(yǎng)基購自澳大利亞Gibco公司，Con siRNA以及PLCB1 siRNA均購自銳博公司，PLCB1抗體購自美國Abcam公司，ERK1/2抗體、p-ERK1/2抗體以及GAPDH單克隆抗體購自美國Cell signaling公司，HRP標(biāo)記二抗購自碧云天生物技術(shù)研究所，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化SP法檢測GBM組和癌旁組中PLCB1蛋白表達(dá)量 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟行樣本固定、石蠟化、脫蠟、脫水、封閉、沖洗，以一抗兔抗人PLCB1多克隆抗體(1∶200稀釋)4 ℃孵育10 h，1×PBS充分沖洗3次，生物素Biotin室溫孵育2 h，DAB顯色(B液∶C液=1∶50)，1×PBS充分沖洗3次，蘇木素復(fù)染，烘干封片，于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.2RT-qPCR檢測GBM組、癌旁組、PLCB1 siRNA組和Con siRNA組中PLCB1 mRNA的表達(dá)量 Trizol法提取GBM組、癌旁組、PLCB1 siRNA組和Con siRNA組中總RNA，用Trizol對以上各組組織、細(xì)胞分別進(jìn)行消化裂解獲取總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行RT-qPCR。根據(jù)試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，分別比較GBM組和癌旁組、PLCB1 siRNA組和Con siRNA組中PLCB1 mRNA的表達(dá)量。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其均值。引物如下：PLCB1基因正向引物：5′-GATGAGCCCAGATGGCCG-3′, 反向引物：5′-AGTTGAGTCATCATCCCACTTGA-3′；β-actin基因正向引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′[7]。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) U87細(xì)胞系接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至匯合度為80%時，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將GBMU87細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(每孔約5×105個細(xì)胞)，用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞達(dá)到85%融合時，將含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的MEM培養(yǎng)液更換為無血清培養(yǎng)液，再分別加入Con siRNA以及PLCB1 siRNA(Con siRNA組和PLCB1 siRNA組)，并輕搖混勻。培養(yǎng)6 h后，再更換為含體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以備用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5CCK-8法測定GBM U87細(xì)胞的增殖情況以胰酶消化Con siRNA組和PLCB1 siRNA組貼壁U87細(xì)胞，將U87細(xì)胞密度調(diào)整為5×108個/L，接種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔；分別在6、12、24 和48 h時向6孔板中加入CCK-8試劑，室溫作用1 h后，采用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處細(xì)胞的吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.6Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測GBM組、癌旁組、PLCB1 siRNA組和Con siRNA組中PLCB1蛋白的表達(dá)情況 于GBM組、癌旁組、PLCB1 siRNA組和Con siRNA組中加入RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解20 min后，13 000 r/min離心15 min取上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量測定，并調(diào)整蛋白的濃度。加上樣緩沖液混勻后煮沸使蛋白變性，后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳至分離膠底部后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以體積分?jǐn)?shù)0.05脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h，以TBST洗滌3次，每次10 min；將PVDF膜置于PLCB1抗體(1∶1 000稀釋)、ERK1/2抗體(1∶1 000稀釋)、p-ERK1/2抗體(1∶1 000稀釋)以及GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)中，4 ℃過夜，PVDF膜以TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000稀釋)，室溫下作者2 h，TBST洗滌3次，Vilber Lourmat凝膠成像系統(tǒng)顯色。以Quality One軟件分析計算目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度比，以此表示目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測PLCB1蛋白對GBM U87細(xì)胞侵襲能力的影響 將Transwell小室放入24孔板中,Transwell小室內(nèi)為上室,24孔板內(nèi)為下室。將Matrigel基質(zhì)膠放置于上室底部膜上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中30 min使其凝固。取100 μL無血清培養(yǎng)基的PLCB1 siRNA組和Con siRNA組細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度5×108/L)滴入上室，下室中加入600 μL含血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)細(xì)胞24 h以后，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液。將Transwell小室用PBS洗3次后，甲醇固定30 min并風(fēng)干，再將含體積分?jǐn)?shù)0.1的結(jié)晶紫染色20 min，棉簽除上層未遷移細(xì)胞，最后用PBS洗3次。顯微鏡下隨機(jī)觀察5個視野細(xì)胞并計數(shù)，取平均值。

1.2.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測PLCB1蛋白對GBM U87細(xì)胞遷移能力的影響 向6孔板當(dāng)中分別加入約5×105個PLCB1 siRNA組和Con siRNA組GBM U87細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日用微移液管的尖端在每個孔中垂直畫線，PBS洗3次，加無血清培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡拍照，觀察劃痕愈合的情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PLCB1在GBM組織中的表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，GBM組以及瘤旁組PLCB1 mRNA表達(dá)量分別為58.33±3.03、11.67±2.08，兩組比較差異具有顯著意義(t=131.29,P<0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，GBM組和癌旁組PLCB1蛋白表達(dá)量分別為68.13±2.13、18.04±3.24,兩組比較差異具有顯著性(t=100.53,P<0.01)。Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測顯示，GBM組以及瘤旁組中PLCB1的表達(dá)量分別為0.88±0.14、0.24±0.08，兩組比較差異有顯著性(t=50.25,P<0.01)。

2.2 PLCB1對GBM U87細(xì)胞增殖的影響

CCK-8分析檢測結(jié)果顯示，時間、組別以及時間與組別交互作用均對GBM U87細(xì)胞的增殖能力具有極顯著的影響(F時間=78.48，F(xiàn)組別=50.29，F(xiàn)時間*組別=31.49，P<0.01)。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，與6 h相比，PLCB1 siRNA組以及Con siRNA組12～48 hGBM U87細(xì)胞增殖水平均明顯提高(F=53.27～74.23，P<0.01)。與Con siRNA組相比較，PLCB1 siRNA組細(xì)胞在48 h時增殖率明顯降低(F=61.16，P<0.05)。見表1。

表1 兩組U87細(xì)胞各時間點(diǎn)增殖情況比較

2.3 PLCB1對GBM U87細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell法檢測的結(jié)果顯示，Con siRNA組以及PLCB1 siRNA組U87細(xì)胞的侵襲率分別為16.44±1.16、4.44±0.64，兩組比較差異具有顯著性(F=29.96，P<0.05)。

2.4 PLCB1對GBM U87細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Con siRNA組和PLCB1 siRNA組細(xì)胞侵襲率分別為81.44±4.49、26.34±3.60)，兩組比較差異具有顯著意義(F=55.71，P<0.05)。見圖1。

A:未處理的GBM U87細(xì)胞，B:Con siRNA組，C:PLCB1 siRNA組

2.5 Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測PLCB1、ERK1/2以及p-ERK1/2蛋白表達(dá)

Western-blot檢測結(jié)果顯示，PLCB1 siRNA組和Con siRNA組中PLCB1蛋白的相對表達(dá)量分別為1.27±0.20、0.23±0.09，與Con siRNA組相比較，PLCB1 siRNA組PLCB1蛋白的表達(dá)量明顯下降(F=26.42，P<0.01)；兩組p-ERK的表達(dá)量分別為1.62±0.17、1.11±0.24，與Con siRNA組相比較，PLCB1 siRNA組p-ERK蛋白的表達(dá)量明顯下降(F=17.98，P<0.01)。GBM組和瘤旁組PLCB1蛋白的相對表達(dá)量分別為1.60±0.19、0.43±0.09，GBM組中PLCB1蛋白表達(dá)量明顯高于瘤旁組(F=24.67，P<0.01)，p-ERK1/2蛋白的相對表達(dá)量分別為1.91±0.21、1.32±0.31，GBM組中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)量明顯高于瘤旁組(F=18.65，P<0.01)。見圖2。

A:Con siRNA組，B:PLCB1 siRNA組，C:GBM組，D:瘤旁組

3 討 論

基因的異常表達(dá)可能會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞信號通路被異常激活，繼而影響細(xì)胞生物學(xué)功能[9-10]。在一些疾病中均發(fā)現(xiàn)PLCB1存在異常表達(dá)，并參與這些疾病的發(fā)生發(fā)展[11-14]，如在乳腺癌組織樣本中發(fā)現(xiàn)PLCB1基因表達(dá)異常，其過表達(dá)與腫瘤分級和細(xì)胞增殖有關(guān)[15]。在結(jié)腸癌中PLCB1過表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，增強(qiáng)腫瘤侵襲能力[16]。PLCB1能編碼磷脂酰肌醇特異性磷脂酶，在癌細(xì)胞中可激活、催化G蛋白使其產(chǎn)生第2信使，并可激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，最終導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[5]。然而，PLCB1在GBM中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不清楚。

GBM是一種最為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，病程進(jìn)展較為迅速，其較強(qiáng)的侵襲性導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，目前治療方法比較局限，生存率極低，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[17-21]。因此，尋找GBM新的治療策略、確定更多的治療靶點(diǎn)尤為重要。本研究本通過對50例臨床標(biāo)本的檢測分析，結(jié)果表明與癌旁組相比，GBM組中PLCB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增高，即PLCB1高表達(dá)于GBM中。為進(jìn)一步探討PLCB1對GBM U87細(xì)胞的影響，本研究又將PLCB1 siRNA以及Con siRN分別轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞后，采用CCK-8法分析檢測PLCB1對兩組細(xì)胞增殖情況的影響，結(jié)果表明PLCB1 siRNA可以明顯抑制GBM U87細(xì)胞的增殖；Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測PLCB1對兩組細(xì)胞侵襲和遷移情況的影響，結(jié)果表明，與Con siRNA組相比，PLCB1 siRNA組細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯受到抑制。即在GBM細(xì)胞中，PLCB1會導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，提示PLCB1可能對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移起到重要作用。但目前對其導(dǎo)致GBM發(fā)生發(fā)展的具體通路機(jī)制還不明確，有研究表明PLCB1可正向調(diào)節(jié)ERK[7]，而EKR廣泛參與許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22]。在90%GBM中p-ERK表達(dá)量會明顯升高，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化[23-24]。本研究通過對GBM組織以及細(xì)胞中ERK信號通路相關(guān)蛋白ERK1/2和p-ERK1/2的檢測發(fā)現(xiàn)，PLCB1可以激活影響細(xì)胞生長和凋亡的ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

綜上所述，本研究首次在GBM患者臨床標(biāo)本及細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PLCB1存在特異性上調(diào)，其過表達(dá)在GBM的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。此外，在GBM組織中，由于PLCB1與細(xì)胞侵襲性密切相關(guān)，其可能成為預(yù)測GBM的潛在標(biāo)志物，為今后GBM的治療提供新思路和策略。