郭良勇，周俊波，曹 訪，吳建良，趙永祥，彭彩娥，潘異哲

(1.湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000； 2.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 湖羊研究所，浙江 湖州 313000；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)所，浙江 杭州 310021； 4.湖州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江 湖州 313000)

褪黑素(melatonin，MLT)是一種由松果腺合成和分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素.有關(guān)研究證明，褪黑素和代謝衍生物可調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，減少對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA抗氧化的損傷[1].褪黑素可以提高精子頂體、質(zhì)膜和DNA完整性，降低膜脂質(zhì)過氧化作用，調(diào)節(jié)精子獲能過程[2].目前，褪黑素在關(guān)于動(dòng)物精液冷凍保存領(lǐng)域已開展相關(guān)研究.霍敏等[3]證實(shí)在絨山羊精液冷凍稀釋液中添加0.5 mg/mL褪黑素能顯著提高絨山羊精子的抗氧化能力和冷凍保存效果.楊寶衛(wèi)等[4]發(fā)現(xiàn)10 mmol/L褪黑素可以有效改善冷凍后豬精子的畸形率和頂體完整率.李曉霞等[1]在牛精液稀釋液中添加10-3mmol/L褪黑素可明顯改善牛精液品質(zhì)，提高牛精液的保存時(shí)間和保存質(zhì)量.這些研究都證實(shí)褪黑素對動(dòng)物精液保存質(zhì)量具有一定的促進(jìn)作用.

湖羊是我國國家級畜禽資源保護(hù)的綿羊品種，主要養(yǎng)殖于太湖流域，具有獨(dú)特的波浪形羔皮、一胎多羔、生長速度快等優(yōu)良性[5].目前關(guān)于褪黑素在湖羊精液低溫保存中的應(yīng)用少見報(bào)道.本研究通過比較不同濃度褪黑素對湖羊精液冷凍解凍后的精子活力、頂體完整率，以及精漿中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量的影響，篩選出褪黑素最適合的添加濃度，為湖羊精液冷凍保存技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)精液

選擇湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院湖羊試驗(yàn)場5只健康、繁殖性能良好的湖羊種公羊，年齡為2～3周歲，采用假陰道法采集鮮精.將收集到的精液置于37 ℃水浴中保存，1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行活力檢測，選擇精子活力0.8以上的精液用于冷凍保存.

1.2 藥品與試劑

褪黑素、果糖、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸、甘油購自Sigma公司；丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；新鮮雞蛋購自超市，用于取得卵黃.

1.3 試驗(yàn)儀器

冰箱(型號為BCD-320WTPMA)，美的公司生產(chǎn)；水浴鍋(型號為DK-S28)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；電子天平(型號為JD2000-3)，沈陽天平儀器廠生產(chǎn)；熒光顯微鏡(型號為BA210 Digital)，麥克奧迪集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；紫外分光光度計(jì)(型號為BioSpectrometer)，艾本德中國有限公司生產(chǎn).

1.4 基礎(chǔ)冷凍稀釋液配置

基礎(chǔ)冷凍稀釋液的配制參照配方[6]：果糖5 g/L、三羥甲基氨基甲烷30.63 g/L、檸檬酸19.9 g/L，添加20%蛋黃、5%甘油.

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

將新鮮精液在室溫中靜置30 min，然后以基礎(chǔ)冷凍稀釋液分2步等比例稀釋至4倍，加入褪黑素，按褪黑素的不同終濃度(10、20、30 mg/mL)設(shè)為試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組，以不添加褪黑素為對照組.

1.6 精液冷凍與解凍

將稀釋好的精液置于4 ℃冰箱中緩慢降溫，1.5 h后在4 ℃條件下分裝至0.25 mL細(xì)管中平衡2 h，然后在距液氮面4 cm處熏蒸10 min，熏蒸結(jié)束后迅速將細(xì)管投入液氮中冷凍保存.2周后取出冷凍細(xì)管，39 ℃水浴解凍20 s，然后進(jìn)行相關(guān)檢測.

1.7 精液品質(zhì)檢測

(1) 精子常規(guī)指標(biāo)：細(xì)管凍精解凍后，利用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)檢測精子活力；使用姬姆薩染料對精子進(jìn)行染色后鏡檢，檢測精子頂體完整率.檢測全程須避光操作.

(2) 精子生化指標(biāo)：使用相應(yīng)的試劑盒對凍精解凍后精漿中的GSH、MDA進(jìn)行檢測，其中GSH檢測依據(jù)二硫代二硝基甲酸比色法，比色波長為420 nm；MDA檢測依據(jù)硫代巴比妥酸比色法原理，比色波長為532 nm.以上檢測的相關(guān)操作嚴(yán)格按照南京建成生物工作有限公司試劑盒說明書要求進(jìn)行.

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件整理，然后用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對湖羊精液冷凍解凍后精子活力的影響

由圖1可知，在冷凍稀釋液中添加20 mg/mL褪黑素，試驗(yàn)2組得出的結(jié)果是：湖羊凍精解凍后的精子活力最高，為0.432，顯著高于對照組的0.395(P<0.05)；試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組得出的結(jié)果是：湖羊凍精解凍后精子活力與對照組相比差異不顯著(P>0.05).

2.2 褪黑素對湖羊精液冷凍解凍后精子頂體完整率的影響

由圖2可知，冷凍稀釋液中添加20 mg/mL的褪黑素后，試驗(yàn)2組得出的結(jié)果是：湖羊精液冷凍解凍后精子頂體完整率最高，為0.512，極顯著高于對照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組(P<0.01)；對照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組得出的結(jié)果是：湖羊精液冷凍解凍后各組精子的頂體完整率差異不顯著(P>0.05).

2.3 褪黑素對湖羊精液冷凍解凍后精漿中MDA含量的影響

由圖3可知，湖羊精液冷凍解凍后各組精漿中的MDA含量存在極顯著差異(P<0.01)，添加褪黑素各試驗(yàn)組精漿中的MDA含量極顯著低于對照組，為1 082 nmol/L(P<0.01)，且試驗(yàn)2組精漿中的MDA含量最低，極顯著低于試驗(yàn)1組和3組(P<0.01).

2.4 褪黑素對湖羊精液冷凍解凍后精漿中GSH含量的影響

由圖4可知，湖羊精液凍精解凍后，各組精漿中GSH含量存在極顯著差異(P<0.01)，試驗(yàn)2組精漿中GSH含量最高，為167.5 μmol/L，極顯著高于對照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組(P<0.01)，且試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組精漿中的GSH含量極顯著低于對照組(P<0.01).

3 討 論

3.1 褪黑素對精子活力的影響

在動(dòng)物精液的冷凍保存過程中，精液的稀釋、冷凍、解凍等處理不可避免地產(chǎn)生包括活性氧(ROS)在內(nèi)的各種自由基[7]，對精子結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性造成不可逆的損傷.研究表明，活性氧(ROS)是造成精子過氧化損傷最常見的因素[8]，其過氧化作用可引起精子膜結(jié)構(gòu)與功能的改變，還可引起精子線粒體和DNA損傷[9]，導(dǎo)致精子保存質(zhì)量急劇下降.線粒體是ROS形成的主要場所，ROS會(huì)導(dǎo)致電子傳遞鏈的中斷，從而降低精子活力，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng).本研究中添加20 mg/mL褪黑素可顯著提高湖羊精液冷凍解凍后的精子活力，這可能與褪黑素是一種能清除ROS的外源性非酶抗氧化劑，對不同類型細(xì)胞都有抗氧化和抗凋亡作用[10-11]有關(guān).杜少銀等[12]、李博玲等[13]證實(shí)將褪黑素作為外源性抗氧化劑的補(bǔ)充物，可顯著減少豬精液稀釋保存過程中產(chǎn)生的ROS水平.梁嵐[14]發(fā)現(xiàn)低濃度褪黑素可以促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，從而使精子得以長時(shí)間存活.在動(dòng)物精液保存的研究中Rodriguez-Osorio等[15]將10-3mol/L濃度的褪黑素添加到公羊精液冷凍擴(kuò)增劑中，發(fā)現(xiàn)可以提高精子的活力、運(yùn)動(dòng)參數(shù)、細(xì)胞內(nèi)ATP濃度和DNA完整性，明顯減輕低溫保存期間的精子損傷.王淑娟等[16]發(fā)現(xiàn)添加10-7mol/L褪黑素可提高公豬精子的運(yùn)動(dòng)性、活力、存活率、膜完整性和線粒體活性.李博玲等[13]發(fā)現(xiàn)0.25 mg/mL褪黑素可以顯著提高精子的活率、活力、線粒體活性和頂體完整性.本研究證實(shí)，合理濃度的褪黑素可顯著提高湖羊精液冷凍解凍后的精子活力.本研究中褪黑素的最適合濃度為20 mg/mL，這與宋博宇[17]的研究結(jié)果一致，但與絨山羊[3]、豬[4，13]、牛[1，18]中的最適合濃度不一致，這可能與品種和精液自身褪黑素基礎(chǔ)量不同有關(guān).

3.2 褪黑素對精子頂體完整性的影響

在精子的保存過程中，精子頂體形態(tài)的完整性對精子能否成功授精起關(guān)鍵作用.研究表明，精子冷凍解凍后頂體完整性會(huì)顯著下降.解凍后精子質(zhì)膜的完整性對維持精子自身頂體反應(yīng)、獲能和新陳代謝等起著至關(guān)重要的作用，但質(zhì)膜在精子冷凍解凍過程中卻容易受到氧化損傷，精子質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化會(huì)導(dǎo)致膜通透性增加，進(jìn)而影響精子抗凍能力[19].有關(guān)研究表明，稀釋液中添加褪黑素可以保護(hù)精子質(zhì)膜對抗環(huán)境的影響.López等[20]研究證實(shí)褪黑素能減少精子中堿性磷酸酶的流失，防止精子質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化.Mayo等[21]發(fā)現(xiàn)在冷凍稀釋液中添加褪黑素會(huì)引起內(nèi)源性抗氧化酶活性的上調(diào)，減少冷凍解凍過程中產(chǎn)生的ROS，可有效保護(hù)頂體形態(tài)的完整性.張建瑞等[22]的研究證明，褪黑素可抑制ROS的活性以及NO的過度產(chǎn)生，對質(zhì)膜和頂體具有保護(hù)功能.Martm-Hidalgo等[23]的研究證實(shí)，褪黑素可保護(hù)線粒體并抑制質(zhì)膜的過氧化反應(yīng).本研究也證實(shí)，添加20 mg/mL褪黑素可極顯著提高湖羊精子解凍后的頂體完整率，這與在絨山羊[3]、豬[4，12-13]、牛[1，18]身上取得的試驗(yàn)結(jié)果基本一致.

3.3 褪黑素對精漿中GSH和MDA含量的影響

精漿、精子內(nèi)具有一定的抗精子脂質(zhì)過氧化物質(zhì)，此種物質(zhì)又被稱為精液抗氧化系統(tǒng).精子抗氧化系統(tǒng)中的成分主要有：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、維生素E和輔酶Q10等.這些物質(zhì)可以清除ROS等.相關(guān)研究表明，褪黑素不僅具有抗精子膜多聚不飽和脂肪酸過氧化損傷的保護(hù)性功能，也可激活或增強(qiáng)過氧化歧化酶和GSH過氧化物酶的抗氧化酶活性，間接發(fā)揮抗氧化作用[24-25].李博玲等[13]的研究證實(shí)，在豬冷凍稀釋液中添加0.25 mg/mL褪黑素可以顯著降低冷凍后精子的ROS含量，顯著提升GSH的抗氧化效能.霍敏等[3]的研究證實(shí)，在絨山羊冷凍稀釋液中添加褪黑素可降低ROS水平，減少冷凍保存后精子受到的氧化損傷.本研究證實(shí)，在湖羊精液冷凍稀釋液中添加20 mg/mL褪黑素，精漿中的GSH含量顯著增加，說明GSH過氧化物酶活性顯著增強(qiáng)，系統(tǒng)的整體抗氧化性顯著提高.

由于ROS攻擊精細(xì)胞質(zhì)膜引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生MDA等脂質(zhì)過氧化物，而ROS等會(huì)對精子造成過度的氧化損傷，導(dǎo)致精子的運(yùn)動(dòng)能力和受精能力下降.任俊玲等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度可根據(jù)MDA的濃度判斷，濃度越高，精子中氧自由基代謝程度越強(qiáng)烈，表明精子質(zhì)量越差.本研究發(fā)現(xiàn)，添加20 mg/mL褪黑素，試驗(yàn)2組在凍精解凍后精漿中的MDA含量極顯著降低，間接地證實(shí)了精漿中的ROS水平降低，且對精子的抗氧化損傷減輕.

4 結(jié) 論

在冷凍稀釋液中添加20 mg/mL褪黑素能顯著提高湖羊精液冷凍保存的效果.褪黑素可通過提高GSH抗氧化活性和減輕冷凍解凍過程中精子受氧化損傷來提高精子的活力和頂體完整性.