周 萌，肖 揚，劉曉冰*

土壤活性有機質(zhì)組分的光譜分析方法及應(yīng)用①

周 萌1,2,3，肖 揚1,2，劉曉冰1,2*

(1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081；3 哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物中心，哈爾濱 150028)

光譜分析方法是利用光譜學(xué)的原理和實驗方法，來確定所測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其化學(xué)組成和相對含量的方法。土壤活性有機質(zhì)(labile organic matter，LOM)是生態(tài)系統(tǒng)管理措施早期且快速的敏感指標(biāo)，對土壤質(zhì)量的變化研究有重要意義。近年來，土壤LOM的含量變化逐漸成為土壤科學(xué)工作者研究的焦點。土壤LOM的組分有物理、化學(xué)、生物學(xué)和聯(lián)合分組所分離出來的各種不同組分。土壤LOM組分的數(shù)量測定方法具有不確定性和難比較性，而應(yīng)用光譜特性的質(zhì)量變化的分析方法可以補充和驗證數(shù)量變化的規(guī)律，由此獲得準(zhǔn)確、詳實的結(jié)果。本文對利用現(xiàn)代分子技術(shù)進行有機質(zhì)結(jié)構(gòu)表征的紫外-可見光譜(UV-vis)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、三維熒光光譜(3DEEM)和固態(tài)核磁共振碳譜(13C-NMR)的光譜分析方法進行了詳述，并對這些方法在LOM研究的應(yīng)用進展進行了概述。提出應(yīng)針對不同的研究目的，選擇適合的光譜分析技術(shù)，推薦了每種土壤LOM組分所適用的光譜分析方法，為研究解析土壤LOM的數(shù)量和質(zhì)量變化規(guī)律提供了技術(shù)參考。

土壤活性有機質(zhì)；光譜技術(shù)；結(jié)構(gòu)分析；土壤質(zhì)量

土壤有機質(zhì)(soil organic matter, SOM)是生態(tài)系統(tǒng)中非常重要的物質(zhì)，它不僅對土壤團聚體結(jié)構(gòu)和透水性有改善作用，對土壤物理化學(xué)和生物學(xué)以及“溫室效應(yīng)”有調(diào)控作用，而且對重金屬的吸收與轉(zhuǎn)化也有促進作用[1-3]。SOM對陸地生態(tài)系統(tǒng)(尤其是生物圈和大氣圈)的可持續(xù)發(fā)展有決定作用[4]，研究SOM的含量變化可以為土壤質(zhì)量、土地利用以及土壤健康評價等方面提供一定的理論依據(jù)，同時為全球氣候變化和碳氮循環(huán)研究提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[5]。

但是，Stevenson[6]研究發(fā)現(xiàn)，SOM降解慢并存在滯后性，研究其短期含量變化實際意義不大，而土壤活性有機質(zhì)(labile organic matter，LOM)的含量雖然較少，其對環(huán)境條件的變化比SOM更敏感，是生態(tài)系統(tǒng)管理措施的早期且快速的指標(biāo)。土壤LOM指的是土壤有機質(zhì)的活性部分，其在土壤中具有較高的有效性和一定的溶解性，容易被土壤微生物氧化、礦化，而且對植物的養(yǎng)分供應(yīng)有最直接的作用[7]。土壤LOM在生態(tài)系統(tǒng)中至少起著3方面作用：①它對土壤物質(zhì)循環(huán)具有表征意義，有助于土壤質(zhì)量的評價；②它對土壤結(jié)構(gòu)有一定的穩(wěn)定作用，對團粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的維持具有重大意義；③它是植物的養(yǎng)分庫，對養(yǎng)分周轉(zhuǎn)有重要作用，能夠提供氮、磷、硫等植物需要的養(yǎng)分。因此，土壤LOM具有很大的研究潛力和研究價值，是近些年來土壤科學(xué)工作者研究的焦點[8]。

土壤LOM通過物理、化學(xué)、生物學(xué)[9]以及聯(lián)合分組[10]的方法可以分離出不同的組分，諸如：①物理組分：輕組有機質(zhì)(light fraction organic matter，LFOM)、顆粒有機質(zhì)(particulate organic matter，POM)、大團聚體有機質(zhì)(macro-aggregate organic matter，MAOM)；②化學(xué)組分：酸堿提取有機質(zhì)(富啡酸，fulvic acid， FA)、溶解性有機質(zhì)(dissolved organic matter，DOM)、酸水解有機質(zhì)(acid hydrolyze organic carbon，AHOC)和易氧化有機質(zhì)(readily oxidized organic matter，ROOM)；③生物學(xué)組分：微生物生物量碳、氮(microbial biomass carbon and nitrogen，MBC、MBN)和潛在可礦化碳、氮(potentially mineralizable carbon and nitrogen，PMC、PMN)；④聯(lián)合分組組分：物理保護有機質(zhì)(iPOM)和游離活性有機質(zhì)(cPOM、fPOM)[11]。

針對土壤LOM組分的數(shù)量，學(xué)者們已經(jīng)開展了廣泛的研究[12-17]。但由于土壤LOM組分的數(shù)量測定的分析方法至今還沒有完全統(tǒng)一，加之每次試驗外部條件的控制不可能完全相同，分析結(jié)果通常存在不確定性和難比較性，需要對土壤LOM組分的質(zhì)量(分子結(jié)構(gòu))進行深入研究。光譜分析不僅可以了解LOM內(nèi)部分子的結(jié)構(gòu)特性，而且具有操作簡便、分析速度快、選擇性好、靈敏度高和所需樣品量少等優(yōu)勢[18]，越來越受到科研工作者的關(guān)注。各種結(jié)構(gòu)的物質(zhì)都有其獨一無二的特征光譜，光譜分析是利用光譜學(xué)的原理(特征光譜)和實驗方法來確定所測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其化學(xué)組成和相對含量(化學(xué)成分分析)的方法[19]，它的基礎(chǔ)理論為原子光譜學(xué)和分子光譜學(xué)。光譜法主要分為吸收光譜(物質(zhì)粒子對光的吸收)和發(fā)射光譜(光源所發(fā)出的光譜)，吸收光譜是在連續(xù)發(fā)射光譜的背景中所呈現(xiàn)出的暗線[20-21]。常見的吸收光譜有紫外–可見吸收光譜、紅外吸收光譜和原子吸收光譜等，而常見的發(fā)射光譜有熒光發(fā)射光譜和原子發(fā)射光譜等[22]。

對于土壤LOM組分來說，由于生物學(xué)分組分離出的組分是氣態(tài)的已知成分，因此沒有必要進行光譜分析，而其他3種分組方法分離出的組分并不是單一的物質(zhì)，而是混合物，因而有必要對它們進行光譜分析，探究其內(nèi)部物質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成。本文對研究土壤LOM內(nèi)部結(jié)構(gòu)的紫外–可見光譜(ultraviolet-visible spectrum，UV-vis)、傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR)、三維熒光光譜(three-dimensional fluorescence spectrum，3DEEM)和固態(tài)核磁共振碳譜(solid-state13C nuclear magnetic resonance spectroscopy，13C-NMR)分析技術(shù)進行了詳述，并提出了每種土壤LOM組分所適宜的光譜分析方法，以期為研究解析土壤LOM的數(shù)量和質(zhì)量變化規(guī)律提供技術(shù)參考。

1 紫外光譜

1.1 紫外光譜的基本原理

紫外和可見吸收光譜是由分子中價電子的躍遷所產(chǎn)生的，分子中價電子經(jīng)紫外或可見光照射時，電子從低能級躍遷到高能級的過程中吸收了相應(yīng)波長的光[23]。紫外吸收光譜的波長范圍是100 ~ 400 nm，其中，100 ~ 200 nm為遠紫外區(qū)，200 ~ 400 nm為近紫外區(qū)，一般的紫外光譜是指近紫外區(qū)，也就是UV-vis光譜[24]。

1.2 紫外光譜分析方法的優(yōu)缺點

UV-vis光譜具有需樣量小、操作簡便、樣品破壞少和靈敏度高等優(yōu)勢。但是，在對被測物質(zhì)進行分析時主要振動鍵有時會結(jié)合，而且由于在近紫外區(qū)只能觀察到π→π*和 n→π*躍遷，因此，它只適用于具有不飽和結(jié)構(gòu)的化合物[25]。

1.3 紫外光譜分析方法的適用對象和條件

UV-vis光譜分析方法可用于DOM的半定量分析，用來揭示土壤和水體中有機質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成與性質(zhì)[26]。對于土壤中的活性有機質(zhì)組分，利用化學(xué)分組得到的FA、AHOM、DOM和ROOM的液態(tài)物質(zhì)都可以用UV-vis光譜測定其結(jié)構(gòu)特征，以下把這些組分統(tǒng)稱為“液態(tài)有機質(zhì)”。

1.4 紫外光譜分析方法的研究進展和應(yīng)用

利用UV-vis光譜研究DOM的π-π 共軛雙鍵在紫外光區(qū)的吸光性，可以揭示有機質(zhì)結(jié)構(gòu)以及判定其來源[27-28]，因此UV-vis光譜被廣泛用于土壤DOM的研究[29-31]。李璐璐等[29]利用新鮮沉積物質(zhì)的降解程度的光譜斜率之比(S)，對三峽庫區(qū)典型消落帶的土壤和沉積物中DOM的光譜特性進行了研究，揭示出表層沉積物的芳香性、腐殖化程度和疏水性要明顯高于深層土壤中的DOM。研究認為，土壤中的紫外光譜在不同地理條件下不同，而在同一地點因植被的不同也有所差異[30-31]。

此外，DOM的分子量大小、含量組成、疏水性、腐殖化、團聚化、取代基復(fù)雜程度等性質(zhì)，可以通過UV-vis光譜特定波長下的紫外–可見吸光度值和兩個特定波長下的吸光度比值表示(表1)[32-33]。Nishijima和Speitel[34]通過對DOM在254 nm處的紫外光譜研究發(fā)現(xiàn)，在濃度一致時，DOM的吸光度值和芳香性碳含量與腐殖化程度呈正相關(guān)，即其比值越高，所測物質(zhì)芳香性越強、腐殖質(zhì)類物質(zhì)含量越高。已有研究認為，DOM在280 nm處的紫外吸光度與分子量大小呈正相關(guān)[35-36]。然而，土壤活性有機質(zhì)的其他化學(xué)組分(FA、AHOM和ROM)在UV-vis光譜上應(yīng)用研究得很少，有必要加強紫外光譜分析在土壤活性有機質(zhì)組分研究上的應(yīng)用。

表1 紫外–可見光譜特征參數(shù)的特性及表征意義

注：A240/A420指波長240 nm和420 nm處的紫外吸光度比值，其余指標(biāo)參數(shù)含義類推。

2 紅外光譜

2.1 紅外光譜的基本原理

任何樣品都可以得到一張紅外光譜，基于被測物質(zhì)紅外光譜中吸收峰的位置、強度和形狀，能夠確定其分子中含有哪些基團，從而推斷其分子結(jié)構(gòu)[42]。土壤LOM中最常用的紅外光譜是FTIR，連續(xù)波長的光源照射紅外樣品后，樣品中的分子會吸收某些波長的光，檢測器將檢測到的未被吸收的光信號經(jīng)過模數(shù)轉(zhuǎn)換，再經(jīng)過傅里葉變化，即得到所測樣品的單光束光譜[42]。在紅外光譜中，被吸收的光的波長或波數(shù)位置會出現(xiàn)吸收峰，某一波長的光被吸收得越多，透射率越低、吸收峰越強，當(dāng)樣品中分子吸收多種波長的光時，所得的譜圖中就會出現(xiàn)很多吸收峰[42]。表2是土壤有機質(zhì)的紅外光譜特征吸收峰的歸屬信息。

2.2 紅外光譜分析方法的優(yōu)缺點

20世紀(jì)70年代，F(xiàn)TIR光譜的出現(xiàn)為紅外光譜在土壤有機質(zhì)結(jié)構(gòu)測定中的研究提供了強有力的保障[42]。然而，由于紅外光譜很復(fù)雜，至今還不能完全得到所有有機質(zhì)的內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)信息，但是它所提供的現(xiàn)有信息已經(jīng)對探究土壤有機質(zhì)的結(jié)構(gòu)起到了至關(guān)重要的推動作用[43]。FTIR光譜具有靈敏度高、所需樣品少、破壞性小、波數(shù)準(zhǔn)確、重復(fù)性好、信噪比好、分辨率高等優(yōu)點[44]，其不僅可以分析超薄薄膜(納米級)的樣品，而且利用紅外光譜附件(例如紅外顯微鏡)可以分析微克級甚至納克級的樣品[42]。此外，F(xiàn)TIR光譜不僅可以用于定性和定量(半定量)分析，還可以對未知物的結(jié)構(gòu)組成進行剖析；其應(yīng)用范圍特別廣泛，固液氣各種形態(tài)、單一組分的純凈物和多種組分的混合物都可以用FTIR光譜測定[45]。

2.3 紅外光譜分析方法的適用對象和條件

對于土壤LOM的組分來說，物理分組和聯(lián)合分組得到的都是固態(tài)有機質(zhì)，而化學(xué)分組分離的是液態(tài)有機質(zhì)，雖然上文中提到FTIR對物質(zhì)的各種形態(tài)都可以進行分析，但是液態(tài)有機質(zhì)在FTIR上的測試效果并不理想，最理想的物質(zhì)形態(tài)為固態(tài)，這是因為水是強極性溶劑，其體系中含有大量的氫鍵，水溶液中的溶質(zhì)會發(fā)生水化作用，使得溶質(zhì)的光譜發(fā)生變化，最終導(dǎo)致水溶液中溶質(zhì)的光譜和固態(tài)的光譜會有很大的差異[42]。因此，如果不是特意研究水溶液狀態(tài)下溶質(zhì)的光譜，就應(yīng)該將水分除去，最后測試固態(tài)樣品的光譜。去除水分的方法有自然晾干、低溫(40℃)烘箱烘干、氮氣吹干和在干燥器中除水，切忌不要用加熱的方法或是真空泵除水，以防止揮發(fā)性大的物質(zhì)損失掉或樣品發(fā)生化學(xué)變化[46]。

表2 土壤有機質(zhì)紅外光譜特征吸收峰的歸屬[9,43]

注：v強度變化，w弱，v w很弱，m中等，s強，sh肩吸收，br寬吸收；伸縮振動，as不對稱伸縮振動，s對稱伸縮振動，U面內(nèi)彎曲振動，W變形振動，Ws對稱變形振動；*為腐殖酸含有雜質(zhì)時出現(xiàn)的吸收。

2.4 紅外光譜分析方法的研究進展和應(yīng)用

紅外光譜能夠得到土壤的不同組分(如總碳、有機碳、無機碳、活性有機碳和可用碳等)信息[46-47]，可以預(yù)測土壤有機質(zhì)物理分組的團聚體不同粒徑以及POM不同大小的結(jié)構(gòu)組成[47]。任雅閣等[48]利用紅外光譜技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，不同粒徑的土壤水穩(wěn)性團聚體中的有機質(zhì)組成一致，其豐度有差別；微團聚體中穩(wěn)定的芳香碳趨多，而大團聚體有機碳中含有活性較高的碳(如脂肪碳、多糖碳等)。

紅外光譜能夠解析不同耕作措施下土壤FA的結(jié)構(gòu)特征，土壤FA主要以脂肪族碳(烷基碳和烷氧碳)為主，隨著土壤深度的增加，免耕促進土壤FA中羰基、羧基和酚羥基含量的增加，降低甲氧基和醇羥基的含量，使其芳構(gòu)化程度和氧化程度增強[49]，2920/1620的比值最低，脂肪鏈烴分支程度最高[50]；而在壟作措施下，土壤FA的芳香性較弱、脂族性較強[50]。同時，利用紅外光譜也可以揭示施入秸稈后，土壤FA的結(jié)構(gòu)變化。土壤中施入玉米秸稈后，F(xiàn)A的羧基含量減少，并且由羧酸鹽的形式向游離的羧基形式逐漸過渡，降低了芳香碳的含量、氧化程度和芳香度，增加了酰胺成分和脂族鏈烴結(jié)構(gòu)成分，最終使FA的分子結(jié)構(gòu)趨于簡單化[51]。隨著水稻秸稈燃燒次數(shù)的增加，土壤FA中含有脂肪族的C-O和羥基碳含量也增加[52]。

此外，紅外光譜在不同的信號峰區(qū)間能夠鑒別出DOM中不同的基團大小，同時也可以用于不同樣本間的比較。DOM的主要組成物質(zhì)是碳水化合物，多糖成分較多，芳香族不飽和烷基鏈烴物質(zhì)少且支鏈短，分子結(jié)構(gòu)簡單[53-54]。倪文海等[55]利用FTIR光譜研究水稻秸稈腐殖化過程中的DOM結(jié)構(gòu)變化特性，發(fā)現(xiàn)DOM的成分變化呈階段性發(fā)展，最初多為小分子物質(zhì)的降解，中期是纖維素分解，最后是腐殖化時期，因此DOM的分子結(jié)構(gòu)逐漸從簡單到復(fù)雜化。Santos等[56]還將FTIR光譜應(yīng)用到雨水DOM的探索上，研究表明，雨水中的脂肪族 C-Hx官能團多于自然水體。因此，應(yīng)用紅外光譜分析方法將為深入探討有機質(zhì)活性組分及其結(jié)構(gòu)的變化提供更多的信息。但是，基于我們的認知，發(fā)現(xiàn)LFOM、AHOC、ROOM和聯(lián)合分組的組分在紅外光譜上的應(yīng)用不多，今后應(yīng)該加強這些組分在紅外光譜上的探討。

3 熒光光譜

3.1 熒光光譜的基本原理

分子熒光光譜是利用某些物質(zhì)分子受光照射所發(fā)生的熒光特性和強度，進行定性或定量分析的檢測方法[57]。其主要原理是：當(dāng)被測物質(zhì)吸收了特征頻率的光子后，由最初的基態(tài)能級躍遷至電子激發(fā)態(tài)的各個不同振動能級，激發(fā)態(tài)分子經(jīng)與周圍分子撞擊而消耗了部分能量，迅速下降至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，并停留約10–9秒之后，直接以光的形式釋放出多余的能量[58]。

3.2 熒光光譜分析方法的優(yōu)缺點

熒光光譜包括熒光發(fā)射光譜、熒光激發(fā)光譜、同步熒光光譜和三維熒光光譜(three-dimensional excitation emission matrix fluorescence spectroscopy，3DEEM)等[58]。熒光發(fā)射光譜是在掃描過程中保持激發(fā)光的波長和強度不變，讓熒光物質(zhì)所發(fā)出的熒光通過發(fā)射單色器照射于檢測器上，以熒光波長和熒光強度分別為橫縱坐標(biāo)所作出的譜圖[59]。熒光激發(fā)光譜是在掃描過程中保持發(fā)射光的波長和強度不變，讓不同波長的激發(fā)光激發(fā)熒光物質(zhì)使之發(fā)生熒光，而讓熒光以固定的發(fā)射波長照射到檢測器上，以激發(fā)光波長和熒光強度分別為橫縱坐標(biāo)所繪制的譜圖[59]。同步熒光光譜是在掃描過程中保持激發(fā)光與發(fā)射光的波長差不變，它與前兩種相比，可以提供更多的官能團和結(jié)構(gòu)信息，但是其受拉曼散射的影響程度很大，導(dǎo)致檢測的選擇性差、靈敏度低[59]。3DEEM 可以同時獲得激發(fā)波長和發(fā)射波長的熒光強度信息，是一種有用的光譜指紋技術(shù)[60]，與前面三者相比，其具有靈敏度高、破壞性和所需樣品量小、操作簡單、選擇性好、信息量豐富、檢測線低等優(yōu)勢[18, 58, 60]，以下主要對 3DEEM 進行介紹。

3.3 熒光光譜分析方法的適用對象和條件

3DEEM和UV-vis光譜的適用范圍類似，都是適合測定液態(tài)有機質(zhì)的化合物，如上述1.3中提到的利用土壤有機質(zhì)化學(xué)分組所得到的液態(tài)組分(FA、AHOM、DOM和ROM)均可以用3DEEM進行分析。

3.4 熒光光譜分析方法的研究進展和應(yīng)用

3DEEM的研究有普通尋峰法(peak picking)、平行因子分析(PARAFAC)和熒光區(qū)域積分(FRI)等方法。普通尋峰法基于激發(fā)和發(fā)射波長分成的5個區(qū)域(表3)所代表的不同物質(zhì)種類可以追蹤活性有機質(zhì)的來源和比較腐殖化程度的大小[61-62]。PARAFAC和FRI技術(shù)可以克服所測樣品中單個熒光組分的異質(zhì)性困難[63]，其分析簡便并且適用于多變量的數(shù)據(jù)分析，PARAFAC將熒光光譜(EEM)分解成各自單獨的熒光成分，并提供相對完整的有機質(zhì)組分(例如FA)的數(shù)據(jù)分析[64]；FRI能夠分析每個激發(fā)發(fā)射區(qū)域下的體積積分，并分析從EEM得到的所有波長的相關(guān)熒光強度的光譜數(shù)據(jù)[65]。

表 3 激發(fā)和發(fā)射波長范圍的 EEM 峰的位置歸屬和特征描述[61-62]

3DEEM的普通尋峰法適用于研究非根際和根際(如玉米和大豆)土壤DOM的結(jié)構(gòu)和組分[66-68]：蘇打鹽堿型水稻土中類富里酸、類腐殖物質(zhì)以及含有不飽和雙鍵的芳香族化合物含量隨種植年限而增加；施用有機肥有利于增加水稻土中DOM的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[69]，中國東部土壤DOM具有相似的熒光光譜特征[70]。應(yīng)用EEM-PARAFAC和FRI方法，可以研究河口環(huán)境中有色溶解有機物(CDOM)[63,71]、填埋型城市固體廢棄物中的水提取有機物(DOM)[72]以及土壤、堆肥中的DOM和FA的來源及腐殖化程度[62,73]。Wu等[74]利用EM-PARAFAC和EEM-FRI兩種方法對DOM的物質(zhì)組成進行劃分，能夠快速準(zhǔn)確地評價城市生活垃圾的生物學(xué)穩(wěn)定性。谷思玉等[75]利用EEM-PARAFAC技術(shù)對FA組分進行分析，揭示出鹽漬土施用有機肥后主要增加生物可利用富里酸組分的比例，其次可增加陸生來源富里酸組分的比例。Zhao等[62]同樣應(yīng)用EEM-PARAFAC技術(shù)對不同材料的堆肥中FA組分的含量和分布進行研究，表明其腐殖化程度存在明顯差異的原因是不同物料堆肥中的FA組成相似但其各組分的分布不同。楊威衫等[76]應(yīng)用EEM-PARAFAC技術(shù)揭示了草甸土DOM的來源、組成和性質(zhì)對不同海拔氣候條件的響應(yīng)特性。

由此可見，對于土壤中的活性有機質(zhì)組分，土壤中DOM和FA組分應(yīng)用熒光光譜進行研究的很多，但是，尚無利用化學(xué)分組提取出的AHOC和ROC進行3DEEM的研究，而利用該項技術(shù)研究這兩個活性有機碳組分的來源，將為深入剖析土壤有機質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征提供有價值的信息。

4 核磁共振

4.1 核磁共振的基本原理

20世紀(jì)40 年代，鑒定化合物結(jié)構(gòu)的核磁共振(NMR)技術(shù)開始發(fā)展起來[77]。原子核在外加磁場中發(fā)生能級裂分，在與外磁場垂直的方向上加交變電場，當(dāng)射頻頻率等于進動頻率時，發(fā)生共振，低能態(tài)原子核吸收射頻能量，躍遷至高能態(tài)，稱為核磁共振[78]。產(chǎn)生核磁共振有3個必要條件：①原子核為磁性原子核(自旋量子數(shù)I≠0)；②磁性原子核處于強的外磁場中發(fā)生能級裂分，能級差與磁場強度成正比；③輻射的射頻能量等于兩個能級之間的能級差[79]。

4.2 核磁共振分析方法的優(yōu)缺點

NMR是一種無損檢測技術(shù)，樣品預(yù)處理簡單，譜圖內(nèi)容豐富，可以全面地提供被測物質(zhì)的成分信息[78-80]。此外，NMR由于其分析測定技術(shù)的多樣化，可以分析固態(tài)和液態(tài)樣品[81]。鑒于此，NMR技術(shù)在土壤科學(xué)(有機質(zhì))、植物科學(xué)(生物多樣性)和生命科學(xué)(醫(yī)藥、生理和發(fā)育)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[82-86]。但是，在被測物質(zhì)檢測時，有時不同功能組的光譜峰由于重疊而不能區(qū)分開，其使用和分析成本也很高；而且，檢測要求必須是純物質(zhì)，對混合物檢測前必須進行萃取分離等預(yù)處理，這就對科研工作者處理土壤樣品的技術(shù)提出了更高的要求[78]。

4.3 核磁共振分析方法的適用對象和條件

SOM檢測中常用的NMR技術(shù)有1H-NMR、液態(tài)13C-NMR 和固態(tài)13C-NMR。1H-NMR 是發(fā)展最早且最簡單的一維氫譜，具有靈敏度高、信息豐富、技術(shù)成熟、參數(shù)選擇簡單和規(guī)范性強等優(yōu)勢[27]。SOM成分很復(fù)雜(如土壤腐殖質(zhì)中包括富啡酸、胡敏酸和胡敏素等多種多樣的有機化學(xué)成分)，利用1H-NMR譜圖可以快速地鑒定這些成分，也可以用于物質(zhì)的指認和追蹤測量等方面，為科學(xué)試驗提供指示性信息。但是，1H-NMR只能測定液態(tài)樣品，由于樣品中殘留的水可能會干擾試驗結(jié)果，其檢測的譜圖具有較差的直觀性和較低的分辨率[87]。表4是1H-NMR圖譜的劃分區(qū)域及其具體的結(jié)構(gòu)信息。

表4 土壤有機質(zhì)1H-NMR圖譜的劃分區(qū)域及其結(jié)構(gòu)信息[9,72]

注：R代表烷基；X代表鹵素、–OR、–NHCOR和–OCOR。

13C-NMR可以檢測液態(tài)和固態(tài)的物質(zhì)，液態(tài)13C-NMR具有較大的譜寬和很高的分辨率，可以指示更明確的信息，這為復(fù)雜體系的土壤樣品中信號的歸屬提供了有力支撐[88]。直到20世紀(jì)70年代，固態(tài)13C-NMR分析技術(shù)才開始應(yīng)用于土壤學(xué)領(lǐng)域[89]，盡管其固態(tài)物質(zhì)的偶極-偶極相互作用很強，分辨率沒有液態(tài)13C-NMR高，但是，固態(tài)13C-NMR技術(shù)的預(yù)處理簡單方便，不需要用化學(xué)或者其他破壞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的方法提取有機物質(zhì)，譜圖內(nèi)容豐富，能夠全面地提供被測物質(zhì)的原始成分信息[78]。表5是13C-NMR圖譜的劃分區(qū)域及其具體的結(jié)構(gòu)信息，DOM各組分的1H 和13C 圖譜可參考代靜玉等[92]的研究。

表5 土壤有機質(zhì)13C-NMR圖譜的劃分區(qū)域及其結(jié)構(gòu)信息[89-91]

基于上面的分析，對于土壤活性有機質(zhì)的不同組分來說，經(jīng)過物理分組和聯(lián)合分組分離出的固態(tài)活性有機質(zhì)組分可以直接通過固態(tài)13C-NMR檢測，而經(jīng)過化學(xué)分組提取出的液態(tài)活性有機質(zhì)組分則要去除水分呈固態(tài)后再通過固態(tài)13C-NMR檢測，務(wù)必保證所提取的土壤活性有機質(zhì)組分的雜質(zhì)降到最低，這與紅外光譜的適用范圍相似。

4.4 核磁共振分析方法的研究進展和應(yīng)用

利用固態(tài)13C-NMR分析方法可以揭示出不同粒徑團聚體組分的結(jié)構(gòu)差異。通常情況下，隨著團聚體粒徑的減小，有機碳中的烷氧碳所占比例降低[93-94]，烷基碳和羧基碳相對含量逐漸增高[95]，但是芳香碳所占比例在不同土壤中變化不一致，有的增加[96]，有的減少[97-98]。這可能是由于植物殘體有機碳的組成部分50% ~ 70% 為烷氧碳[99]，外源植物殘體進入土壤后，優(yōu)先聚集在大團聚體的有機碳中，大粒徑的團聚體比微團聚體的植物分解程度低，隨著植物殘體的分解程度增加，逐漸轉(zhuǎn)移至小粒徑的團聚體有機碳中[88]；相對來說，隨著分解過程的增加，選擇性保留的有機物質(zhì)(如軟木脂和角質(zhì)等)和微生物再次合成的物質(zhì)會在小粒徑的團聚體中積累，這導(dǎo)致了烷基碳和羧基碳的比例增加；芳香碳比例減少的原因可能是在分解初期，大團聚體中植物殘體來源的木質(zhì)素選擇性保留的結(jié)果[100]。

此外，利用固態(tài)13C-NMR技術(shù)也可以對LFOM、POM和DOM的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行解析。LFOM的來源主要是植物，其含有豐富的脂肪酸、軟木脂、木質(zhì)素二聚物、固醇和油脂，且LFOM對木質(zhì)素進行選擇性富集的時候，烷氧碳含量同時減少[101-102]。不同土地利用方式下，LFOM中烷氧碳的比例約為50%，烷基碳和芳香碳次之；LFOM比閉蓄態(tài)有機質(zhì)中的烷氧碳多，而烷基碳少[96,103]。江西水稻土的POM是由烷氧碳、烷基碳、芳香碳和羰基酚基碳組成，其所占比例分別為46% ~ 53%、20% ~ 26%、15% ~ 21% 和6%[104]。DOM中腐殖酸和富里酸的組成大約為25% ~ 50%, 其他的組分主要是多糖、蛋白質(zhì)和親水性有機酸[105]。目前對于土壤活性有機質(zhì)的液態(tài)組分應(yīng)用NMR技術(shù)研究的很少，今后可以嘗試這些組分在NMR上的應(yīng)用，以期為土壤活性有機質(zhì)不同狀態(tài)的組分研究提供全面的技術(shù)參考。

5 結(jié)語與展望

綜上所述，土壤LOM常用的光譜分析方法有UV-vis、FTIR、3DEEM和固態(tài)13C-NMR，基于各種分析方法的優(yōu)勢，總結(jié)出每種活性有機質(zhì)組分所對應(yīng)適用的光譜分析方法(圖1)以及作用和劣勢(表6)。鑒于以上每種光譜的作用和劣勢，我們認為今后的研究應(yīng)該從以下幾個方面開展。

1) 將光譜學(xué)的定性、(半)定量分析和物理化學(xué)傳統(tǒng)方法的定量分析有機結(jié)合，共同探討土壤LOM組分的數(shù)量和質(zhì)量(內(nèi)部分子結(jié)構(gòu))變化規(guī)律，并根據(jù)不同的研究目的篩選切實可行的光譜分析技術(shù)，多種分析技術(shù)相互印證，才可能得出更為準(zhǔn)確、詳實的結(jié)果。

2) 將光譜分析方法與化學(xué)計量學(xué)結(jié)合，利用各種模型深入、全面、準(zhǔn)確地探討土壤各活性有機質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。

3) 要真正了解有機化合物的分子量和官能團碎片的結(jié)構(gòu)，腐殖化過程中所形成的復(fù)雜化合物在聚合、縮合和多環(huán)芳烴共軛等性質(zhì)方面的信息，以及物質(zhì)內(nèi)部原子在空間分布狀況結(jié)構(gòu)的真正三維圖像，其他技術(shù)，諸如熱解-氣相色譜法 (pyrolysis-gas chromatography，Py-GC)[115]、質(zhì)譜(mass spectro-metry，MS)[116]、拉曼光譜(raman spectroscopy，RS)[117]、X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)圖譜分析[118]、掃描電子顯微鏡(scanning electron micro-scope，SEM)、透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)和電子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)[119]，也是研究的有力工具。

圖1 土壤各個活性有機質(zhì)組分所適用的光譜分析方法

表6 土壤活性有機質(zhì)光譜分析方法的作用和劣勢

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Methods and Applications of Spectral Analysis for Soil Labile Organic Matter Components

ZHOU Meng1,2,3, XIAO Yang1,2, LIU Xiaobing1,2*

(1 College of Resources and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2 Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China; 3 Department of Biological Center, Harbin Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150028, China)

Spectral analysis is a method that applies the principles of spectroscopy and experimental means to determine the structure, chemical composition and relative content of the measured substance. Soil labile organic matter (LOM) is an early and rapid sensitive indicator to ecosystem management measures, which is of significance to the study of soil quality changes. Soil LOM has been a study focus in recent years, it has various components separated by physical, chemical, biological and combined grouping. The quantitative methods in determining soil LOM components have uncertainty and difficulty, in which the analytical approach of quality change by applying spectral analysis can complement and validate the quantitative changes in obtaining accurate and detailed results. In this paper, the spectroscopic analysis methods for structural characterization of organic matter using modern molecular technologies including ultraviolet-visible spectrum (UV-vis), Fourier transform infrared spectrum (FTIR), three-dimensional fluorescence spectrum (3DEEM) and solid-state nuclear magnetic resonance spectrum (13C-NMR) were described in detail, and their applications and advances in soil LOM determination were also summarized. It is proposed that appropriate spectral analysis techniques should be selected according the study purposes. Specific spectral analysis method is recommended suitable for each soil LOM component. The paper could provide a technical reference for examining the quantity and quality changes of soil LOM.

Soil labile organic matter; Spectral technique; Structural analysis; Soil quality

S158.5；O433.4

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.06.001

周萌, 肖揚, 劉曉冰. 土壤活性有機質(zhì)組分的光譜分析方法及應(yīng)用. 土壤, 2020, 52(6): 1093–1104.

國家重點研發(fā)計劃項目 (2017YFC0504202、GX18B028)，國家自然科學(xué)基金項目 (41671274)，ANSO世界黑土聯(lián)合會項目 (ANSO-PA-2020-12)和國家土壤質(zhì)量數(shù)據(jù)中心觀測監(jiān)測項目(ZX02S080400)資助。

(liuxb@iga.ac.cn)

周萌(1988—)，女，黑龍江哈爾濱人，農(nóng)藝師，博士研究生，主要從事土壤肥力管理研究。E-mail: zhoumeng0416@neau.edu.cn