郝慧強(qiáng)，李姝赟，郭松佳，李榮山

1山西醫(yī)科大學(xué)，太原030000；2山西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科；3山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院腎內(nèi)科

外泌體是一種主要存在于細(xì)胞外的小泡，大部分細(xì)胞都可以分泌外泌體。起初認(rèn)為外泌體僅與細(xì)胞內(nèi)代謝廢物排出相關(guān)，近年來研究證實(shí)，外泌體還具有細(xì)胞間通訊功能。細(xì)胞外小泡根據(jù)其發(fā)生部位不同分為外泌體和微泡。外泌體被認(rèn)為是早期內(nèi)體成熟為晚期內(nèi)體（MVB）后與質(zhì)膜融合被釋放，直徑30～100 nm［1］；而微泡是直接從質(zhì)膜脫落，也被稱為微粒體、胞外體等，直徑50 nm～1 μm［2］。外泌體可作為生物標(biāo)記物來發(fā)揮診斷價(jià)值，同時(shí)因外泌體攜帶體內(nèi)的生理病理學(xué)信息，也可用來研究相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制、治療方法。外泌體本身也是很好的載體，可用作藥物的載體靶向作用于相應(yīng)器官。對(duì)外泌體進(jìn)行深入研究將有助于對(duì)其功能的挖掘。因此，本文將對(duì)外泌體生物發(fā)生的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體的發(fā)生途徑

外泌體的生物發(fā)生目前認(rèn)為主要有質(zhì)膜和內(nèi)體兩種途徑。研究最多的是內(nèi)體途徑，即先由質(zhì)膜出芽形成早期內(nèi)體，然后早期內(nèi)體萌發(fā)腔內(nèi)囊泡形成MVB，最終MVB與質(zhì)膜融合釋放外泌體。這一機(jī)制來自于對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的研究，目前很多報(bào)道均基于這一生物發(fā)生機(jī)制定義外泌體［1］。此外，已有多項(xiàng)證據(jù)表明外泌體可以從質(zhì)膜直接出芽形成，即質(zhì)膜途徑。

人類CD4+T細(xì)胞系可以通過質(zhì)膜“內(nèi)體樣結(jié)構(gòu)域”出芽直接分泌外泌體，該結(jié)構(gòu)域富含CD63、CD81以及各種內(nèi)體和外泌體蛋白［3］。有研究通過對(duì)外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD81、CD9進(jìn)行質(zhì)膜和內(nèi)體標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)人胚胎腎細(xì)胞、鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞的質(zhì)膜是外泌體生物發(fā)生的主要部位，這些囊泡與MVB來源的外泌體具有相同大?。?］、標(biāo)記物、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)。因此有理由認(rèn)為外泌體可以直接從質(zhì)膜出芽產(chǎn)生。還有少部分細(xì)胞可能不通過MVB和質(zhì)膜途徑形成外泌體，如巨噬細(xì)胞［3］。巨噬細(xì)胞的質(zhì)膜連接腔室（IPMC）也可能是外泌體產(chǎn)生的一種途徑。與MVB不同的是，IPMC通過頸部與質(zhì)膜相連，并與細(xì)胞外環(huán)境相通，小分子物質(zhì)可以自由通過。感染HIV病毒的巨噬細(xì)胞中，IPMC是主要的病毒萌芽場所，任何打開連接膜通道的刺激都會(huì)導(dǎo)致病毒顆粒以及CD81/CD9的外泌體和其他膜結(jié)構(gòu)的快速釋放［5-6］。這一機(jī)制在其他細(xì)胞中并未發(fā)現(xiàn)?？傊诟鞣N類型的細(xì)胞中，可能有不同的或主要發(fā)生途徑不同的外泌體產(chǎn)生機(jī)制。

2 外泌體的發(fā)生機(jī)制

目前研究最多的外泌體發(fā)生機(jī)制是內(nèi)體途徑。早期內(nèi)體產(chǎn)生后逐漸成熟為MVB，MVB的形成有內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（ESCRT）依賴和ESCRT非依賴兩種機(jī)制。ESCRT系統(tǒng)包括異源二聚體ESCRT-0（由HRS和STAM兩個(gè)蛋白組成）、異源四聚體ESCRT-Ⅰ（由 TSG1010亞基、VPS28、VPS37以及MVB12組成）、異源四聚體ESCRT-Ⅱ（由EAP45、EAP30和2個(gè)EAP20組成）、ESCRT-Ⅲ（由CHMP2、CHMP3、CHMP4和CHMP6等組成）和液泡蛋白分選蛋白4（VPS4）等5個(gè)復(fù)合物以及Bro1蛋白家族（ALIX、HD-PTPT等）組成［7］。ESCRT依賴機(jī)制產(chǎn)生MVB需要貨物聚集、膜內(nèi)陷、貨物運(yùn)輸至新生囊泡以及囊泡頸分裂4個(gè)步驟，ESCRT參與了全過程［8］。首先通過HRS：STAM（ESCRT-0）和相關(guān)的接頭將貨物聚集在內(nèi)體膜上［7］。要想完成這一過程需要先將貨物蛋白進(jìn)行泛素化，然后把HRS：STAM接頭通過HRS網(wǎng)格蛋白綁定盒連接到內(nèi)體膜并形成蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，最后通過接頭捕獲泛素化的貨物蛋白完成聚集［9］。除上述接頭外，ESCRT-I中VPS27、MVB12的C末端結(jié)構(gòu)域和ESCRT-Ⅱ的EAP45 GLUE域也可與泛素化蛋白結(jié)合［10］幫助貨物聚集。完成聚集后，HRS：STAM 的 HRSPASP 基序招募 TSG101［11］，形成ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ復(fù)合體，使聚集的貨物定位至芽頸部并且負(fù)責(zé)背負(fù)泛素化蛋白和含有PT/SAP基序的蛋白到腔內(nèi)囊泡［12］。在貨物運(yùn)輸過程中，ESCRT-Ⅰ的VPS28的C末端結(jié)構(gòu)域招募ESCRT-Ⅱ形成復(fù)合體，負(fù)責(zé)膜彎曲出芽和貨物的封存，并將ESCRT-0泛素結(jié)構(gòu)域募集到芽體中，在芽頸部組織ESCRT 復(fù)合物的組裝［8，13］。隨后 ESCRT-Ⅲ被 ESCRT-Ⅱ或ALIX招募，輔助ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ復(fù)合體完成貨物封存，并通過VPS4復(fù)合體催化膜的分裂和因子的循環(huán)，最終形成 MVB［7-8］。此外，Syndecan-Syntenin-ALIX機(jī)制控制著約50%的外泌體生物發(fā)生。這一機(jī)制是通過定位于細(xì)胞膜的多配體聚糖（Syndecan）作用于其胞質(zhì)受體Syntenin，并通過Syntenin的LYPXnL基序與ALIX結(jié)合，招募ALIX至胞內(nèi)囊泡，刺激腔內(nèi)囊泡形成和外泌體生物發(fā)生，是CD63陽性的腔內(nèi)囊泡萌發(fā)必需條件［14］。

ESCRT機(jī)制并不唯一，因?yàn)槎鄠€(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)ESCRT機(jī)制被抑制后外泌體生物發(fā)生無實(shí)質(zhì)性降低［15］。總結(jié)目前報(bào)道的其他產(chǎn)生途徑，把他們均歸入ESCRT非依賴機(jī)制。ESCRT非依賴機(jī)制中神經(jīng)酰胺（nSMase）途徑報(bào)道最多。研究蛋白脂蛋白（PLP）在Oli-neu細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制發(fā)現(xiàn)，PLP不依賴于ESCRT進(jìn)入內(nèi)體。而nSMase抑制劑，如GW4869，可顯著減少外泌體和PLP的釋放，提示神經(jīng)酰胺可產(chǎn)生另一類不被運(yùn)往溶酶體，而作為外泌體分泌的腔內(nèi)囊泡［16］。這一觀點(diǎn)在其他研究中被證實(shí)。如巨噬細(xì)胞通過外泌體向樹突狀細(xì)胞進(jìn)行抗原遞呈［17］，供體細(xì)胞miRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)［18］，都部分依賴于神經(jīng)酰胺途徑。在神經(jīng)酰胺途徑中，它分解產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺代謝物鞘氨醇1磷酸（S1P）被抑制后阻斷了神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的CD63外泌體的分泌，而不減少外泌體的分泌的數(shù)量，證實(shí)了S1P在腔內(nèi)囊泡的貨物分選中起著關(guān)鍵作用［19］。除神經(jīng)酰胺途徑外，在人類黑色素瘤細(xì)胞中CD63直接參與前黑素小體蛋白（PMEL）的ESCRT非依賴性分選，而CD63抑制后PMEL以ESCRT依賴的方式進(jìn)行降解［20］；在人胚腎293細(xì)胞（HEK293），CD82和CD9促進(jìn)裝載β-連環(huán)蛋白的外泌體排出［21］；在胰腺癌中通過四旋蛋白8募集特定的蛋白和mRNA到外泌體［22］。這些機(jī)制均被發(fā)現(xiàn)是非依賴ESCRT的外泌體形成途徑。但無論通過抑制哪種產(chǎn)生途徑，都不能完全消除外泌體的產(chǎn)生［15］。這提示，同一種細(xì)胞有多種產(chǎn)生MVB的途徑，同一個(gè)MVB會(huì)同時(shí)存在不同途徑來源的腔內(nèi)囊泡。此外，也有研究報(bào)道了在同一種細(xì)胞存在不同的MVB亞群，通常會(huì)與溶酶體結(jié)合而降解，而一部分會(huì)與質(zhì)膜結(jié)合進(jìn)行胞吐，將外泌體釋放入細(xì)胞外空間［23］。

3 外泌體內(nèi)容物的組裝

外泌體內(nèi)有核酸（包括miRNA、IncRNAs、mRNAs、DNA）、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等，其內(nèi)容物的攝取可能經(jīng)過精細(xì)的調(diào)控。相對(duì)于細(xì)胞和微囊，外泌體富含特定的RNA種類［24］。關(guān)于RNA如何被選擇性的裝載到外泌體，目前文獻(xiàn)報(bào)道可能與以下幾種方式相關(guān)。RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）參與miRNA和miRNA-mRNA復(fù)合物在外泌體中的分泌［25］。RISC的關(guān)鍵組件Argonaute 2（Ago2）的水平和Ago2磷酸化都控制著特定miRNA分泌到外泌體中，并受KRASMEK-ERK通路的調(diào)節(jié)［26］。除RISC之外，其他蛋白也可將特定蛋白的RNA裝載至外泌體中。如主穹窿蛋白在腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)可將miR-193a裝載入外泌體排出而減少了其在細(xì)胞質(zhì)中的濃度，這有利于腫瘤細(xì)胞的生長［27］；人ELAVL蛋白在饑餓應(yīng)激反應(yīng)期間控制miR-122向外泌體中的運(yùn)輸；RNA Y盒結(jié)合蛋白1在分選小非編碼RNA（tRNA、Y-RNA、Vault-RNA、miRNA）到外泌體中發(fā)揮作用。上述報(bào)道可見外泌體RNA的分選依賴于某些特定的蛋白，這些蛋白如何從眾多的RNA中識(shí)別需要分選的RNA目前還不清楚，但在上述報(bào)道中提示可能與RNA的修飾和特定的基序相關(guān)。部分RNA分選到外泌體已被證實(shí)需要依靠特定基序，如在原代T淋巴母細(xì)胞中，異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A2B1通過識(shí)別特定的miRNA基序?qū)iRNA載入外泌體中，而SYNCRIP蛋白與另一種外泌體特定miRNA基序結(jié)合將裝載到外泌體中，并且上述兩種蛋白對(duì)靶向的miRNA具有專一性。此外，有研究通過對(duì)人類B細(xì)胞外泌體RNA進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，3'端尿苷化的miRNA在外泌體中富集［28］。研究均證明靶向外泌體的RNA具有特定的序列。因此，通過對(duì)RNA的修飾或具有特定的RNA基序是RNA靶向外泌體的關(guān)鍵。除RNA外，DNA也存在于外泌體中，包含線粒體DNA、單鏈DNA、雙鏈DNA、基因組DNA、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RNA轉(zhuǎn)錄體等，但其分選入外泌體的具體機(jī)制尚不清楚。

上文已提到泛素化或含有PT/SAP基序的蛋白可通過ESCRT載入外泌體。除此外，通過低聚物寡聚化（或稱為高階寡聚化）和質(zhì)膜結(jié)合的方式也可以將蛋白靶向到外泌體中，并且用抗體誘導(dǎo)細(xì)胞表面蛋白高階寡聚化和添加質(zhì)膜錨給高度寡聚的胞質(zhì)蛋白兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證［29］。有研究進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論，并且發(fā)現(xiàn)了多種質(zhì)膜錨，但出芽率存在較大差異。其中二磷酸和肉豆蔻酰化最高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)內(nèi)體膜錨并不能將蛋白質(zhì)靶向外泌體和微囊中［30］。此外，許多外泌體蛋白均是與膜相關(guān)、高階化、同源寡聚和（或）異源寡聚的蛋白復(fù)合物，如四跨膜蛋白（如CD63、CD81、CD9）、逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag蛋白、ESCRT機(jī)制蛋白、多種支架蛋白等［12］。外泌體還富含膽固醇、鞘磷脂、鞘糖脂和磷脂酰絲氨酸，并且脂質(zhì)參與了外泌體的結(jié)構(gòu)組成，在外泌體的形成和釋放中也發(fā)揮重要作用［31］。

目前研究可見外泌體不僅通過MVB與質(zhì)膜融合釋放，也可以通過質(zhì)膜直接產(chǎn)生，并且某些細(xì)胞還可能有特殊的產(chǎn)生途徑。外泌體內(nèi)容物組裝的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)和核酸需具備特定的條件，才可以裝載入外泌體中。這些研究為進(jìn)一步向外泌體裝載特定的貨物提供了依據(jù)。外泌體生物發(fā)生機(jī)制的研究雖未明了，但對(duì)于它功能的研究已經(jīng)全面展開。外泌體的通訊功能已被發(fā)現(xiàn)參與多種生理病理過程，例如免疫調(diào)節(jié)、血管生成、止血、凝血、癌癥、細(xì)菌病毒感染等。有多項(xiàng)研究通過提取尿液、血液中的外泌體進(jìn)行內(nèi)容物分析后發(fā)現(xiàn)其中的miRNA、circRNA、mRNA等分子具有顯著的表達(dá)差異，但仍需要大樣本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。外泌體可以作為載體，通過定向改造進(jìn)行大分子遞送和基因組修飾來發(fā)揮治療作用，這將是一場革命。對(duì)外泌體發(fā)生作用機(jī)制的深入理解，將有助于外泌體的分離提純、靶向、改造等多方面的應(yīng)用。