孫娟，楊莉娜 ，崔昊晶，胡文良，蘇琳，2

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，呼和浩特010000；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

喉癌作為頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人們健康。目前，喉癌的診療取得了一定進展，但尚未獲得令人滿意的診療策略，多數(shù)患者確診時已為中晚期，總體預(yù)后較差。喉癌預(yù)后預(yù)測仍是臨床一大難題。因此，尋找能夠預(yù)測患者預(yù)后的分子標(biāo)志物和治療新靶標(biāo)意義重大。鐵死亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡的一種方式，逐漸成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點。研究表明，鐵死亡具有抑制腫瘤（胰腺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤）細胞增殖，增加化療藥物敏感性等作用［1-4］。此外，鐵死亡與頭頸部鱗狀細胞關(guān)系密切，抑制Glutaredoxin5基因表達能夠使順鉑耐藥的頭頸部鱗癌細胞發(fā)生鐵死亡［4］。可見鐵死亡基因在頭頸部腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但迄今尚無獨立研究喉癌與鐵死亡基因關(guān)系的文獻報道。本研究基于美國癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)方法篩選與喉癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因，并建立預(yù)后預(yù)測模型，以期為喉癌的診療及預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取TCGA數(shù)據(jù)庫中2000—2020年收錄并具有完整隨訪信息的喉鱗狀細胞癌樣本96例，均來自術(shù)后喉鱗狀細胞癌患者，均經(jīng)病理檢查確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未進行放療或化療；首次進行手術(shù)治療；隨訪時間均超過1年；病歷資料完整?；颊吣?2例，女14例；年齡≤65歲65例，＞65歲31例；腫瘤等級G1～G2級40例，G3～G4級56例；腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期51例；原發(fā)腫瘤浸潤T1～T2期17例，T3～T4期79例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期41例，N1～N3期55例。下載該喉癌數(shù)據(jù)集相關(guān)轉(zhuǎn)錄組測序RNAseq數(shù)據(jù)及樣本相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，用于后續(xù)分析。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2017MS0838）。

1.2 喉癌中鐵死亡基因篩選 基于美國國家生物信息中心數(shù)據(jù)庫挖掘能夠調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的鐵死亡基因60個，用于后續(xù)對照分析。用R語言limma包提取96例喉癌樣本中鐵死亡基因，并進行差異表達分析，錯誤發(fā)現(xiàn)率檢驗（FDR）＜0.05為基因差異表達。

1.3 與喉癌預(yù)后有關(guān)的鐵死亡基因篩選 用R語言limma包提取TCGA喉癌樣本的存活時間及存活狀態(tài)（96例患者存活60例，死亡36例，隨訪時間2000—2020年），用R語言survival包對基因與喉癌預(yù)后時間的關(guān)系進行COX單因素回歸分析，P＜0.05被認為與預(yù)后相關(guān)，風(fēng)險比（HR）＞1代表該基因表達量與預(yù)后呈負相關(guān)，即基因表達量越高，預(yù)后越差；HR＜1則相反。將差異表達鐵死亡基因與預(yù)后相關(guān)基因取交集后，獲得與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因。同時繪制森林圖，HR＞1為高風(fēng)險基因，HR＜1為保護基因。用R語言pheatmap包繪制預(yù)后相關(guān)鐵死亡基因表達熱圖。

1.4 喉癌中鐵死亡基因相關(guān)風(fēng)險模型建立及效能評估 基于LIANG等［5］的研究方法，利用LASSO回歸對TCGA樣本進行風(fēng)險評分，風(fēng)險值根據(jù)以下公式得出：風(fēng)險值表示回歸系數(shù)，xi表示基因相對表達值。獨立變量是鐵死亡相關(guān)預(yù)后基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達矩陣，而響應(yīng)變量是TCGA隊列中患者的總體生存率和生存狀態(tài)。確定模型的懲罰參數(shù)（λ）并遵循最低標(biāo)準(zhǔn)（即對應(yīng)于最低的部分似然偏差的λ值）進行10倍交叉驗證。根據(jù)每個基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達水平及其相應(yīng)的回歸系數(shù)計算患者的風(fēng)險評分。用這3個鐵死亡基因的表達量進行LASSO回歸分析，在模擬1 000次運算后，計算出基于每個獨立基因，或每兩個基因，或全部3個基因的分組結(jié)果，結(jié)果顯示根據(jù)HSPB1、FTH1基因的風(fēng)險評分中位數(shù)（-2.568分）得到的分組結(jié)果最優(yōu)?；赗語言survival包進行鐵死亡基因聯(lián)合預(yù)測喉癌患者生存率。利用R語言survival ROC包建立時間依賴性的ROC曲線以評估鐵死亡基因相關(guān)風(fēng)險模型對喉癌預(yù)后的預(yù)測價值。

2 結(jié)果

2.1 喉癌中與喉癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因 共篩選出3個鐵死亡基因與喉癌預(yù)后相關(guān)。PHKG2（HR=0.409，95%CI：0.199～0.842，P=0.015）、HSPB1（HR=1.842，95%CI：1.022～3.320，P=0.042）、FTH1（HR=1.708，95%CI：1.131～2.580，P=0.011）。其中，HSPB1、FTH1為高風(fēng)險基因，PHKG2為保護基因。與正常樣本對比，PHKG2在喉癌樣本中低表達，HSPB1、FTH1在喉癌樣本中高表達。

2.2 鐵死亡基因風(fēng)險模型對喉癌預(yù)后的預(yù)測價值 該模型預(yù)測喉癌患者術(shù)后1、2、3年生存率的ROC線下面積分別為0.657、0.691、0.770。且隨時間延長，該模型的敏感度、特異度逐漸升高。

3 討論

研究認為細胞死亡主要分為凋亡和壞死。隨著研究不斷深入，細胞還可通過自噬、脹亡、焦亡等方式死亡［6-7］。此外，鐵死亡是2012年發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴的細胞程序性死亡形式之一，涉及多種疾病，有望成為腫瘤治療的新方式［8］。研究發(fā)現(xiàn)，細胞鐵死亡過程會受復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，如核因子E2相關(guān)因子2能夠通過調(diào)控鐵死亡和線粒體功能障礙參與神經(jīng)變性過程［9］。腫瘤抑制因子TP53可通過抑制溶質(zhì)載體家族7成員11或過表達亞精胺/亞精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶1、谷氨酰胺酶2，影響鐵死亡基因網(wǎng)絡(luò)，從而促進細胞鐵死亡［10］。

本研究通過文獻挖掘收集了與鐵死亡相關(guān)的基因60個，并以此為靶點進行分析。本研究共發(fā)現(xiàn)喉癌預(yù)后相關(guān)鐵死亡基因3個，分別為兩個高危基因PHKG2、FTH1，1個保護基因HSPB1。研究發(fā)現(xiàn)，抑制谷胱甘肽過氧化物酶4的小分子會引起脂質(zhì)過氧化物的致死性積累，并導(dǎo)致鐵死亡。在這個過程中，PHKG2能夠調(diào)節(jié)脂氧合酶的鐵利用量，進而使不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，從而驅(qū)動鐵死亡［11］。PHKG2在喉癌中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)PHKG2高表達是喉癌預(yù)后的高危因素，這可能與PHKG2通過調(diào)節(jié)鐵死亡通路來促進喉癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究證實，F(xiàn)TH1能夠通過吞噬鐵蛋白來抑制鐵死亡的發(fā)生，這使得FTH1能夠抑制鐵死亡促進多種癌癥（肝癌、膀胱癌等）的發(fā)生發(fā)展［12-13］，但FTH1在喉癌中的作用還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TH1是喉癌預(yù)后的高危因素，提示FTH1可能在喉癌中也具有促癌作用。HSPB1是癌細胞鐵死亡的負性調(diào)節(jié)劑。蛋白激酶C介導(dǎo)的HSPB1磷酸化可通過減少鐵介導(dǎo)的脂質(zhì)反應(yīng)性氧化而抑制鐵死亡，從而提高抗癌活性［14］。在裸鼠成瘤實驗中過表達HSPB1后，癌細胞的鐵死亡明顯增強。本研究發(fā)現(xiàn)，HSPB1是喉癌預(yù)后的保護因素。以上結(jié)果提示HSPB1、PHKG2、FTH1能夠通過調(diào)控鐵死亡過程影響癌癥的發(fā)生發(fā)展，然而它們在喉癌中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)它們與喉癌的預(yù)后關(guān)系密切，可能是喉癌發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子。

目前，臨床主要根據(jù)腫瘤組織病理、淋巴結(jié)活檢及遠處轉(zhuǎn)移來預(yù)測喉癌患者的預(yù)后。然而，以上預(yù)測也存在較大差異，需要補充其他輔助手段進而提高預(yù)測準(zhǔn)確性［15］。本研究通過LASSO回歸等方法建立喉癌預(yù)后預(yù)測模型，以期為喉癌患者的預(yù)后預(yù)測找尋新的靶點。該模型基于鐵死亡基因HSPB1和FTH1的表達將喉癌患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，生存曲線證實兩組生存率有顯著差異，survStat分析結(jié)果也佐證了這一結(jié)果。ROC曲線提示該模型隨生存時間延長其敏感度和特異度隨之升高。這提示該模型具有較強的預(yù)后預(yù)測能力。然而，該模型對喉癌患者的危險評分能夠與腫瘤分期作用相當(dāng)，提示該模型具有重要的臨床價值。在未來，臨床中可能通過檢測喉癌患者樣本中HSPB1和FTH1的表達量，來判斷喉癌患者是否處于高風(fēng)險組，從而達到預(yù)測預(yù)后的目的。此外，與其他研究［16］相比，本研究的創(chuàng)新點在于將研究范圍精準(zhǔn)縮小，重點探索鐵死亡基因?qū)戆╊A(yù)后的判斷及影響，有助于喉癌發(fā)生新機制以及喉癌預(yù)后預(yù)測等方面的深入研究。這是首個根據(jù)鐵死亡基因建立的喉癌預(yù)后預(yù)測模型。結(jié)果顯示，這一模型能夠準(zhǔn)確區(qū)分高危風(fēng)險與低危風(fēng)險喉癌患者，而且具有很高的敏感度和特異度，具有成為輔助預(yù)后預(yù)測靶點的潛力。此外，在獨立危險因素分析中，喉癌的腫瘤分期是獨立危險因素之一，這符合惡性腫瘤的性質(zhì)特點。與腫瘤分期相比，本研究中的預(yù)測模型同樣能夠作為喉癌預(yù)后獨立危險因素。盡管得出上述結(jié)論，但有關(guān)這3個鐵死亡基因在喉癌中的作用及機制的臨床、基礎(chǔ)研究很少，仍需進一步研究證實三者在喉癌中的作用。

綜上所述，基于TCGA和生物信息學(xué)方法構(gòu)建喉癌預(yù)后預(yù)測模型，結(jié)果顯示HSPB1是喉癌預(yù)后的保護因素，PHKG2和FTH1是喉癌預(yù)后的高危因素。該模型具有較高的敏感度和特異度，可能為喉癌的診療及預(yù)后評估提供新的切入點。