張建偉，王華東，郭寶印，李海波，孫鳳亮

天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院，天津301800

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。隨著我國人口老齡化加劇，前列腺癌的發(fā)病率不斷上升，已成為我國男性第五大常見惡性腫瘤［1］。有研究報道，晚期前列腺癌治療后易出現(xiàn)復發(fā)或轉移，這是導致患者生存期較短的主要原因［2］。但目前前列腺癌復發(fā)或轉移的分子機制尚不完全清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（lncRNA）可作為致癌基因或抑癌基因參與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。人漿細胞瘤轉化遷移基因1（PVT1）是lncRNA家族成員之一，基因定位于人染色體8q24.21 上，可參與染色質修飾、蛋白質活性調(diào)節(jié)等生物學過程，與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移密切相關［4-5］。有研究報道，lncRNA PVT1能夠通過多種途徑參與腫瘤惡性進展，并與腫瘤術后復發(fā)和轉移有關［5-6］。但目前l(fā)ncRNA PVT1與前列腺癌關系的報道較少。2018年6月—2020年1月，本研究觀察了lncRNA PVT1對前列腺癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌細胞DU145、人正常前列腺上皮細胞RWPE-1，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心。lncRNA PVT1敲低質粒（lncRNA PVT1 siRNA）、陰性對照質粒（Negative Control siRNA），由湖南豐暉生物科技有限公司設計合成。紫外分光光度計和多功能酶標儀，購自美國賽默飛公司；CFX96 Touch 實時熒光定量PCR 儀，購自美國Bio-Rad 公司；AlphaImager HP 凝膠成像系統(tǒng)，購自美國ProteinSimple 公司。G418，購自美國Amresco 公司。PrimeScript Reverse Transcriptase，購自瑞士Roche公司；SYBR Green Ⅰ核酸染料，購自北京索萊寶科技有限公司。PVT1、β-actin 一抗以及辣根過氧化物酶標記的IgG二抗，購自美國CST公司。

1.2 細胞傳代培養(yǎng) 將DU145 細胞接種于RPMI 1640 培養(yǎng)基，RWPE-1 細胞接種于含5 ng/mL 人重組表皮生長因子的角質形成細胞無血清培養(yǎng)基，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并根據(jù)培養(yǎng)基pH 變化更換新的培養(yǎng)基。當細胞生長融合80%左右時，用含0.25% EDTA 的胰蛋白酶消化處理后，按1∶4傳代。

1.3 lncRNA PVT1 mRNA表達檢測 采用RT-qPCR法。取傳3 代、對數(shù)生長期的DU145、RWPE-1 細胞各1×107個，采用TRIzol 法提取細胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格，可用于后續(xù)實驗。按PrimeScript Reverse Tran?scriptase 說明將總RNA 逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：40 ℃40 min，30 ℃10 min。以cDNA 為模板，按SYBR Green Ⅰ說明進行PCR 擴增。引物序列：lncRNA PVT1 上游引物5"-TAGGGTACGCTGCCG?TATGCT-3"，下游引物5"-CCGTACGTAGCCGTAT?GAGCT-3"；U6 上游引物 5"-CCTAAGTCCCGT?CAGTCGTGA-3"，下游引物 5"-GCTAGCGCCTC?CAGCTGTCG-3"。PCR 反應體系共25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL；反應條件：95 ℃20 s，95 ℃10 s、60 ℃20 s 共40 個循環(huán)，最后75 ℃10 s。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法 計 算lncRNA PVT1 mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 細胞轉染與穩(wěn)轉細胞篩選 取傳3 代、對數(shù)生長期DU145 細胞，以3.5×105個/孔接種于含RPMI 1640 培養(yǎng)基的6 孔板，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，隨機將細胞分為觀察組和對照組，按Lipofectamine2000說明，分別轉染lncRNA PVT1 siRNA和Negative Control siRNA，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱。轉染48 h，加入適量G418，使其終濃度分別為0、200、400、800、1 000 mg/L，每3～4 天更換1 次篩選培養(yǎng)基。培養(yǎng)10～14 d，以細胞全部死亡的最低濃度為G418最佳篩選濃度。以G418最佳篩選濃度的一半維持培養(yǎng)轉染后的細胞，直至獲得穩(wěn)轉細胞株，分別檢測lncRNA PVT1 mRNA和蛋白表達。

lncRNA PVT1 mRNA 表達檢測采用RT-qPCR法，檢測步驟同1.3。

lncRNA PVT1蛋白表達檢測采用Western blotting法。收集上述穩(wěn)轉細胞，加入適量細胞裂解液充分裂解，提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量合格。然后加入等體積的上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE（5%濃縮膠、10%分離膠）分離蛋白。采用濕轉法將蛋白電泳產(chǎn)物轉印至PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入PVT1、β-actin 一抗（稀釋比均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日，吸棄一抗，TBST沖洗，加入辣根過氧化物酶標記的IgG 二抗（稀釋比為1∶4 000），室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光，在AlphaImager HP 凝膠成像系統(tǒng)中自動曝光。以β-actin 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞增殖活性檢測 采用MTT法。收集上述穩(wěn)轉細胞，用完全培養(yǎng)基重懸制成密度為1×104個/mL的細胞懸液，取細胞懸液200 μL 接種于96 孔板，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱。分別于培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，室溫孵育4 h；棄上清液，加入DMSO 150 μL，充分混勻。酶標儀于570 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值。以OD570值代表細胞增殖活性。每個時間點設6個平行孔。實驗重復3次，取平均值。

1.6 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 小室實驗。收集上述穩(wěn)轉細胞，用無血清的培養(yǎng)基制成密度為2.5×104個/mL的細胞懸液。取細胞懸液500 μL加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基。然后將Transwell 小室置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，用棉簽拭去未穿膜細胞，經(jīng)多聚甲醇固定和結晶紫染色，倒置相差顯微鏡下拍照觀察。隨機選取5個200倍不重疊視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。以穿膜細胞數(shù)表示細胞侵襲能力。實驗重復3次，取平均值。

1.7 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。收集上述穩(wěn)轉細胞，用完全培養(yǎng)基重懸，制成密度為2×106個/mL 的細胞懸液，取細胞懸液2 mL 接種于6孔板，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞生長融合70%左右時，用10 μL 移液器吸頭垂直于孔底劃5 條平行劃痕，PBS 沖洗去除懸浮細胞，顯微鏡下拍照觀察并記錄劃痕距離（即0 h 劃痕距離）。吸棄原培養(yǎng)基，加入含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下拍照觀察并記錄劃痕距離（即24 h 劃痕距離），計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h劃痕距離-24 h劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。每組設3 個復孔，實驗重復3 次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DU145、RWPE-1 細胞lncRNA PVT1 mRNA 表達比較 DU145、RWPE-1 細胞lncRNA PVT1 mRNA相 對 表 達 量 分 別 為3.41 ± 0.81、1.00 ± 0.21，DU145細胞lncRNA PVT1 mRNA相對表達量明顯高于RWPE-1細胞（t=7.938，P＜0.01）。

2.2 兩組lncRNA PVT1 表達比較 觀察組與對照組lncRNA PVT1 mRNA 相對表達量分別1.35 ±0.31、3.14±0.47，lncRNA PVT1蛋白相對表達量分別 為0.24 ± 0.04、0.88 ± 0.05。觀 察 組lncRNA PVT1 mRNA 和蛋白相對表達量均低于對照組（t分別為5.053、18.110，P均＜0.01）。

2.3 兩組細胞增殖活性比較 觀察組培養(yǎng)60、72 h時細胞增殖活性均低于對照組同期（P均＜0.01），而兩組培養(yǎng)12、24、36、48 h 時細胞增殖活性比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 兩組培養(yǎng)不同時間細胞增殖活性比較（±s）

注：與對照組同時間比較，*P＜0.01。

組別對照組觀察組細胞增殖活性培養(yǎng)72 h 0.96±0.08 0.70±0.05*培養(yǎng)12 h 0.11±0.03 0.12±0.03培養(yǎng)24 h 0.10±0.03 0.18±0.05培養(yǎng)36 h 0.40±0.04 0.39±0.04培養(yǎng)48 h 0.56±0.04 0.52±0.05培養(yǎng)60 h 0.72±0.08 0.64±0.04*

2.4 兩組細胞侵襲能力比較 觀察組穿膜細胞數(shù)為（79.3±6.4）個，對照組為（144.7±9.5）個，觀察組穿膜細胞數(shù)明顯低于對照組（t=6.982，P＜0.05）。

2.5 兩組細胞遷移能力比較 觀察組細胞遷移率為（23.3±2.1）%，對照組為（57.3±3.1）%，觀察組細胞遷移率明顯低于對照組（t=11.782，P＜0.01）。

3 討論

前列腺癌的發(fā)病率在全球男性所有惡性腫瘤中居第2位，病死率居第5位［7］。近年來隨著我國人口老齡化加劇，前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為我國男性第五大常見惡性腫瘤［1］。內(nèi)分泌治療是目前前列腺癌的主要治療方法，幾乎所有患者在疾病早期屬于雄激素依賴型，雄激素剝奪療法的治療緩解率超過80%［8］。但經(jīng)過中位生存期14.30 個月以后，多數(shù)患者發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌，變得難以控制且易于轉移，這是導致晚期前列腺癌死亡的主要原因。由于前列腺癌發(fā)病的分子機制尚不完全清楚，臨床對于去勢抵抗性前列腺癌缺乏有效的治療手段［9］。因此，深入研究前列腺癌的發(fā)病機制，對其早期診斷和后續(xù)治療均具有重要意義。

lncRNA 是一類轉錄本長度超過200 nt 的非編碼RNA 分子，雖然不編碼蛋白，但可以RNA 的形式在表觀遺傳調(diào)控、轉錄調(diào)控、轉染后調(diào)控等層面上調(diào)控基因的表達。近年研究證實，lncRNA 可作為致癌基因或抑癌基因參與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［10］。PVT1 是lncRNA 家族成員之一，是人類多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的重要調(diào)控分子［11］。在乳腺癌和卵巢癌細胞中抑制lncRNA PVT1 表達，可促進腫瘤細胞凋亡［12］。在結直腸癌細胞中下調(diào)lncRNA PVT1表達可激活轉錄生長因子β 信號通路和凋亡信號通路，促進結直腸癌細胞凋亡［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1 在膀胱癌組織中異常表達，并與腫瘤臨床分期和淋巴結轉移有關，是預測膀胱癌總體生存率的獨立危險因素［14］。前期研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織lncRNA PVT1 表達明顯高于癌旁正常組織，并且lncRNA PVT1高表達與前列腺癌淋巴結轉移和遠處轉移密切相關［15］。由此推測，lncRNA PVT1 可能參與前列腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。但目前相關證據(jù)不足。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，DU145 細胞lncRNA PVT1 mRNA 相對表達量明顯高于RWPE-1 細胞，與之前在前列腺癌組織中的報道一致。通過瞬時轉染技術將lncRNA PVT1 siRNA 轉染至DU145 細胞中，下調(diào)lncRNA PVT1 表達并通過G418 篩選出穩(wěn)轉細胞株，進一步觀察lncRNA PVT1 表達對DU145 細胞增殖、侵襲和遷移的影響，結果發(fā)現(xiàn)，觀察組培養(yǎng)60、72 h時細胞增殖活性明顯低于對照組同期，即下調(diào)lncRNA PVT1 表達能夠抑制前列腺癌細胞增殖；觀察組穿膜細胞數(shù)和細胞遷移率均低于對照組，即下調(diào)lncRNA PVT1 表達能夠抑制前列腺癌細胞侵襲和遷移。結果表明lncRNA PVT1 可促進DU145 細胞增殖、侵襲和遷移，與以往在卵巢癌細胞［16］、非小細胞肺癌細胞［17］中的報道一致。但目前對lncRNA PVT1在前列腺癌中的具體作用機制尚不清楚，還需進一步研究。

綜上所述，前列腺癌細胞lncRNA PVT1 高表達，下調(diào)lncRNA PVT1 表達可抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。lncRNA PVT1 有望成為前列腺癌早期診斷和靶向治療潛在的腫瘤生物標志物。