王倩 ，蘭天翔 ，葉碧波 ，蒲仕明 ，吳瓊

1 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541006；2 廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點實驗室廣西師范大學(xué)

研究表明，無論在正常還是病理狀態(tài)下，成體心肌組織中均存在具有特異性心肌分化潛能的多能干細(xì)胞，即心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞，其在維持心臟穩(wěn)態(tài)和再生中起著關(guān)鍵作用［1］。在心臟中存在的心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞可以在損傷的情況下分化為心肌細(xì)胞，從而提高損傷心臟的修復(fù)能力［2］。心臟來源的Sca-1+細(xì)胞具有心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞特征，即體外長期繁殖能力、體內(nèi)非致瘤性、干細(xì)胞和心臟特異性標(biāo)志物的持續(xù)表達(dá)以及向心肌細(xì)胞譜系的多能分化［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Sca-1+心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞可分為Lin-CD45-Sca-1+CD31+和Lin-CD45-Sca-1+CD31-兩個亞群細(xì)胞，Lin-CD45-Sca-1+CD31+細(xì)胞占總細(xì)胞的比例明顯多于Lin-CD45-Sca-1+CD31-細(xì)胞，但不具有分化與自我更新能力，而Lin-CD45-Sca-1+CD31-細(xì)胞具有分化與自我更新的能力。microRNA和mRNA表達(dá)的綜合分析表明，20 個 microRNA 和 49 個 mRNA 與 Sca-1+CD31-和Sca-1+CD31+亞型細(xì)胞干性特征呈負(fù)相關(guān)［4］。其中，mmu-miR-322-5p具有更多靶向和反向相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子，并且可能具有更高的心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞分化潛力［4］。2018年6月—2019年8月，本研究探討了miR322-5p 對小鼠Sca-1+心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡以及分化的影響，期望可以為心血管疾病治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇60 只C57BL/6 品系小鼠（2～3 月齡雌鼠），購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司［SCXK（湘）2011-0003］。流式細(xì)胞分析儀（FACS Verse，美國Becton Dickinson公司）；流式細(xì)胞分選儀（FACS Aria Ⅱ，美國Becton Dickinson 公司）；多用途臺式高速冷凍離心機(jī)（LABOFUGE 400R，美國Ther?mo Fisher Scientific 公司）；37 ℃ CO2培養(yǎng)箱（HERA?cell240i，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；熒光定量PCR 儀（LightCycler?96，Roche公司）；梯度PCR 儀（621BR07088）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心臟單細(xì)胞分離 頸椎脫臼法處死小鼠，浸泡于75%乙醇中15 s，用手術(shù)剪剪開小鼠胸腔皮膚，將胸腔打開，快速取出心臟并放入盛有肝素鈉-PBS（1∶9）溶液的培養(yǎng)皿中。在超凈工作臺中將心臟轉(zhuǎn)移到盛有預(yù)冷的PBS 的培養(yǎng)皿中，用鑷子擠壓心臟除去血塊，再用手術(shù)剪將心臟縱向剖開。用預(yù)冷的PBS 沖洗心臟組織3～4 次，至PBS 溶液清澈。將心臟轉(zhuǎn)移至紫色的C 管，加入膠原酶Ⅱ，將C 管置于組織處理器的一個通道上，使用加熱模塊將組織解離體系加熱至37 ℃，運(yùn)行已設(shè)置好的程序。消化結(jié)束后加入等體積的培養(yǎng)基終止消化，用40μm 細(xì)胞篩網(wǎng)過濾至 15 mL 離心管中，4 ℃、1 600 r/min 離心5 min，去除上清，加入PBS，重懸細(xì)胞。

1.2.2 Sca-1+心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞的豐度分析及分選 取1 mL心臟單細(xì)胞懸液置于做好標(biāo)記的1.5 mL EP管中，微量離心機(jī)1 600 r/min離心5 min，去上清。每管分別加入100 μL 稀釋100 倍的Anti-Mouse CD45 FITC、Anti-Mouse Ly-6A/E（Sca-1）PE-Cy7、Anti-Mouse CD31（PECAM-1）APC 以及這 3 種抗體的組合混合液，4 ℃避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，加入適量PBS 重懸，離心5 min，去上清，再加入1 mL PBS 重懸。使用BD FACS Aria Ⅱ流式分選儀無菌分析Sca-1+心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞亞群的豐度并分選CD45-Sca-1+CD31+與CD45-Sca-1+CD31-心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞。

1.2.3 Sca-1+心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng) 將分選得到的CD45-Sca-1+CD31+細(xì)胞與CD45-Sca-1+CD31-細(xì)胞用微量離心機(jī)1 800 r/min 離心5 min，去上清，用含10%Gibco?澳洲胎牛血清、1%青鏈霉素混合液和89%Gibco?DMEM/F-12（1∶1）basic（1×）的完全培養(yǎng)基重懸。按每孔1×104細(xì)胞接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的96 孔板中，置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μL 生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔3 d 換液，待細(xì)胞密度達(dá)到50%左右進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染 本實驗使用的慢病毒（HBLVGFP-PURO 標(biāo)記空病毒液、HBLV-m-mmu-miR322-5p-sponge-GFP-PURO 標(biāo)記敲低病毒液、HBLV-mmmu-mir322-GFP-PURO標(biāo)記過表達(dá)病毒液）由上海漢恒生物提供。病毒存放于-80 ℃冰箱，使用前置于冰上解凍待用。配制Polybrene 工作液：將Poly?brene 加入到生長培養(yǎng)基中，使終濃度為5 μg/mL。將1.2.3 中的96 孔板取出，吸去培養(yǎng)基，每孔加入50 μL 預(yù)熱的 Polybrene 工作液，放入 37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育30 min。孵育結(jié)束后取出96 孔板，以感染復(fù)數(shù)=50 加入相應(yīng)體積的病毒液，放入37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h 后向每孔補(bǔ)充適量培養(yǎng)基使總體積達(dá)到100μL，放入37 ℃CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，吸走含有病毒液的培養(yǎng)基，每孔加入100μL生長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染36 h 后，利用熒光倒置顯微鏡檢測GFP 熒光信號，以對照為1，了解轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染72 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，TRIzol 法提取總RNA，用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后，realtime PCR 測定慢病毒敲低和過表達(dá)CD45-Sca-1+CD31+和CD45-Sca-1+CD31-兩個亞群細(xì)胞的效率。利用特定的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分化，通過熒光倒置顯微鏡檢測分化情況。

1.2.5 miR322-5p 表達(dá)檢測 從37 ℃CO2培養(yǎng)箱取出1.2.4 中轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心棄上清得到細(xì)胞沉淀，每管加入1 mL TRIzol Reagent，吹打混勻。加入 200 μL 三氯甲烷，小心蓋好管蓋，用力振蕩，室溫靜置5 min。4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。取上清至新的EP 管，并加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置20 min。4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。棄上清，加入1 mL的75%乙醇，上下顛倒清洗，4 ℃、12 000 r/min離心2 min，棄上清。室溫靜置2～5 min，加入10 μL RNase-free 水，輕輕吹打混勻，使RNA 充分溶解。按Mir-X ? miRNA First-Strand Synthesis and SYBR?qRT-PCR User Manual 說明書（www.clontech.com）方法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行real-time PCR檢測。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測 配制1×Binding Buffer：取1 mL 10×Binding Buffer，加 9 mL ddH2O 稀釋。從37 ℃CO2培養(yǎng)箱取出1.2.4中轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的2 mL EP管中，用微量離心機(jī)1 600 r/min離心5 min，去上清，加入1 mL PBS 重懸。離心去上清后，每管加入0.5 mL 1×Binding Buffer 潤洗1 次。離心去上清，每管加入100 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，再加入5μL Annexin V，室溫條件下避光孵育15 min。孵育結(jié)束后加入0.5 mL 1×Binding Buffer 混勻，離心去上清。加入100 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，再加入5μL 7-AAD，4 ℃冰箱避光孵育5 min。孵育結(jié)束后每個樣品管加入0.5 mL PBS 重懸細(xì)胞，4 h 內(nèi)進(jìn)行流式檢測。

1.2.7 細(xì)胞分化情況觀察 從37 ℃CO2培養(yǎng)箱中取出1.2.4 中轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，用特定的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化形成心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。誘導(dǎo)14 d 后，吸去培養(yǎng)基，加入PBS，洗2～3 次。吸去PBS，加入50 μL 多聚甲醛，在搖床上固定15 min。吸去固定液，用PBS 洗2～3次。棄上清，加入50 μL 1% Triton X-100 通透細(xì)胞10 min。吸走 Triton X-100，用 PBS 洗 2～3 次。加入50μL 1%BSA，封閉30 min。吸走封閉液，加入50μL用1% BSA 稀釋好的對應(yīng)一抗［Anti-Cardiac Tropo?ninⅠ antibody、Anti-alpha smooth muscle Action anti?body（EPR5368）、Anti-Von Willebrand Factor anti?body］，4 ℃冰箱過夜孵育。第2 天從冰箱取出96 孔板，吸掉一抗，PBS 洗 2～5 次。小心吸走 PBS，加入50 μL 用1%BSA 稀釋好的對應(yīng)二抗［Goat Anti-Rab?bit IgG H ＆ L（DyLight?550）preadsorbed antibody］，37 ℃避光孵育1 h。吸去二抗，PBS 洗2 次。吸去PBS，加入50μL的15μg/mL DAPI，在搖床上避光慢速孵育5 min。吸去DAPI細(xì)胞核染色液，PBS 洗2～3次。吸去PBS，加入1～2 滴抗熒光淬滅封片液封片。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞分化情況。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD45-Sca-1+CD31+、CD45-Sca-1+CD31-心臟細(xì) 胞 豐 度 CD45-Sca-1+CD31+ 、CD45-Sca-1+CD31-細(xì)胞占總細(xì)胞的比例分別為（3.53±0.47）%、（0.61±0.11）%，兩者相比P<0.01。

2.2 miR322-5p在CD45-Sca-1+CD31+與CD45-Sca-1+CD31-細(xì)胞中的表達(dá)比較 miR322-5p 在CD45-Sca-1+CD31+、CD45-Sca-1+CD31-細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為1.00 ± 0.03、0.04 ± 0.00，兩者比較P<0.01。

2.3 CD45-Sca-1+細(xì)胞miR322-5p基因修飾效果在miR322-5p 基因敲低的CD45-Sca-1+CD31+細(xì)胞中，miR322-5p 相對表達(dá)量（0.09 ± 0.02）減少，P<0.001；在miR322-5p 基因過表達(dá)的CD45-Sca-1+CD31-細(xì)胞中，miR322-5p 相對表達(dá)量（19.33 ±4.52）增多，P<0.01。

2.4 miR322-5p對小鼠CD45-Sca-1+CD31+、CD45-Sca-1+CD31-心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞存活的影響 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示：與CD45-Sca-1+CD31+細(xì)胞凋亡率（0.760 ± 0.114）相比，miR322-5p 基因被敲低的CD45-Sca-1+CD31+細(xì)胞凋亡率（0.556 ± 0.116）降低（P<0.05）。與 CD45-Sca-1+CD31-細(xì)胞凋亡率（0.830 ± 0.013）相比，miR322-5P 基因過表達(dá)的CD45-Sca-1+CD31-細(xì)胞凋亡率（0.903 ± 0.017）升高（P<0.05）。

2.5 miR322-5p對小鼠CD45-Sca-1+CD31+、CD45-Sca-1+CD31-心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞分化的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，在CD45-Sca-1+CD31+細(xì)胞中敲低miR322-5P 基因后，細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的能力無明顯變化，分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力增強(qiáng)；在CD45-Sca-1+CD31-細(xì)胞中過表達(dá)miR322-5p 基因后，其分化為心肌細(xì)胞的能力增強(qiáng)，分化為平滑肌細(xì)胞的能力無明顯變化，分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力降低。

3 討論

心臟Sca-1+細(xì)胞在梗死后心肌中的移植促使毛細(xì)血管的密度增加，將此細(xì)胞移植到心肌可減輕心肌損傷后不良的心臟重塑［5-6］。心臟Sca-1+細(xì)胞還指導(dǎo)心臟炎癥過程中滲透到心臟的免疫細(xì)胞的類型，并驅(qū)動心力衰竭的發(fā)展［7］。天然存在的micorRNA 是21～25 個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小 RNA 分子［8］，其從不產(chǎn)生蛋白質(zhì)或氨基酸鏈，但在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平的細(xì)胞過程期間調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)［9］。microRNA存在于細(xì)胞外囊泡包裝的體液中，從而使其非常穩(wěn)定［10］。近年來的研究表明，microRNA 可影響多種生物學(xué)過程，包括發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和凋亡［11］；mi?croRNA 還與多種疾病進(jìn)程相關(guān)聯(lián)，例如癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等［12-14］。microRNA 干擾靶mRNA 的翻譯并控制多種生理和病理過程［15］，還可微調(diào)整個信號網(wǎng)絡(luò)的激活，從而調(diào)節(jié)復(fù)雜的細(xì)胞反應(yīng)［16］。

miR-322是人miR-424的嚙齒動物同源物，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及不同組織和器官的代謝活動，是各種生物過程中至關(guān)重要的調(diào)節(jié)劑［17］。在小鼠中，miR-322（嚙齒類 miR-424 直系同源物）的過度表達(dá)引起纖維萎縮，并減少上游結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和核糖體 RNA 水平［18］。YANG 等［19］通過體外缺氧誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)后的小鼠心肌細(xì)胞凋亡增加，同時miR-322 顯著上調(diào)，下調(diào)miR-322 的表達(dá)可有效保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。miR-322 可直接或間接上調(diào)許多與通路有關(guān)的基因，從而改善脂肪酸代謝并改善線粒體呼吸能力，這可能有助于減弱脂肪酸毒性和氧化應(yīng)激，在心臟重塑的病理生理中起著重要作用［20］。

急性心肌梗死后，用于心肌再生的心臟Sca-1+心臟細(xì)胞治療由于細(xì)胞生存力不足和高細(xì)胞凋亡率而受到限制［21］。本研究結(jié)果表明，miR322-5p 基因被敲低后，Sca-1+CD31+心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡率降低，分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的能力無明顯差異，分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力增強(qiáng)；miR322-5p 基因過表達(dá)后，Sca-1+CD31-心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡率增加，其分化為心肌細(xì)胞的能力增強(qiáng)，分化為平滑肌細(xì)胞的能力無明顯差異，但分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力降低。由此推測miR322-5P 基因很可能是調(diào)控CD45-Sca-1+CD31+與CD45-Sca-1+CD31-心臟內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡與分化的一個關(guān)鍵因子。