王雨婷，靳 拓，胡 芳，黃仕林，劉慧君*，金德才

（1. 北京農(nóng)學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站，北京 100125；3. 湖南省長(zhǎng)沙生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，長(zhǎng)沙 410001；4. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，中國(guó)科學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085）

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters, PAEs）是被廣泛應(yīng)用于橡膠用品、塑料、涂料、農(nóng)藥、食品包裝、個(gè)人護(hù)理用品等領(lǐng)域的一類人工合成的持久性有機(jī)化合物［1］。在PAEs被廣泛應(yīng)用的同時(shí)，其對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境安全的威脅也受到了人們的關(guān)注。由于PAEs對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)具有潛伏性、廣泛性和深遠(yuǎn)性的危害，世界各國(guó)都十分重視其污染問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外有大量研究表明，PAEs具有致畸性、致癌性、致突變性及生殖毒性［2］，并對(duì)人體有低濃度長(zhǎng)期危害的特征。目前，鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate, DBP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（benzyl butyl phthalate, BBP）、鄰苯二甲酸二辛酯（dioctyl phthalate, DOP）等多種PAEs已被美國(guó)環(huán)保局（Environmental Protection Agency, EPA）和中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站列為優(yōu)先控制的污染物。

PAEs在塑料中主要通過(guò)氫鍵或范德華力與聚烯烴類分子進(jìn)行連接，在環(huán)境中不易分解。目前在大氣、湖泊、飲用水、土壤甚至室內(nèi)環(huán)境中均可檢測(cè)到PAEs的存在［3］，同時(shí)，PAEs還可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入生物體內(nèi)［4］，對(duì)其造成嚴(yán)重危害。

PAEs已經(jīng)成為我國(guó)環(huán)境中廣泛存在的一類有機(jī)污染物，生物降解是其在環(huán)境中降解的主要途徑［5］。DBP主要作為軟化劑應(yīng)用于聚氯乙烯（polyvinyl chloride, PVC）等合成材料中，是應(yīng)用最廣泛的PAEs化合物之一。其對(duì)環(huán)境污染的主要原因是人為造成的，任何來(lái)源的DBP均可通過(guò)食物鏈進(jìn)入消化道，最終在人體內(nèi)蓄積，從而對(duì)人體健康構(gòu)成威脅［6］。國(guó)內(nèi)外對(duì)DBP的生物降解進(jìn)行了大量的研究，主要包括高效降解菌株的篩選和降解動(dòng)力學(xué)研究以及酶促降解性和降解途徑等方面。目前分離得到對(duì)DBP具有高效降解性能的菌株主要有紅球菌（Rhodococcussp.）［7-8］、分枝桿菌（Mycobacteriumsp.）［9］、假單胞菌（Pseudomonassp.）［10］、戈登氏菌（Gordoniasp.）［11-12］、芽孢桿菌（Bacillussp.）［13］和皮氏伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pickettii）［14］等，但我國(guó)對(duì)于PAEs污染物的微生物降解機(jī)制、降解基因以及降解酶的研究相對(duì)較少，且降解菌菌屬相對(duì)集中，需要擴(kuò)大PAEs的生物降解菌種資源庫(kù)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)冢村菌（Tsukamurella）的研究相對(duì)較少，且關(guān)于冢村菌降解PAEs的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究從土壤中篩選出一株能夠把DBP高效降解的菌株SD2，采用16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建將其鑒定為冢村菌，并分析在不同影響因子條件下菌株SD2的DBP降解特性，為冢村菌降解有機(jī)污染物的研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)基

主要試劑：鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate,DMP）；鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate, DEP）；DBP；DOP；甲醇（分析純）和乙酸乙酯（分析純）。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 ：K2HPO45.8 g/L，KH2PO44.5 g/L，(NH4)SO42.0 g/L，MgCl20.16 g/L，CaCl20.02 g/L，Na2MoO4·2H2O 2.4 mg/L，F(xiàn)eCl31.8 mg/L，MnCl2·2H2O 1.5 mg/L ；將pH值調(diào)至7，121℃高壓滅菌20 min。PAEs固體培養(yǎng)基：在1 L無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂，121℃高壓滅菌20 min［15］。

1.2 菌株篩選、形態(tài)觀察及生理生化鑒定

稱取 1 g 的樣品于 100 mL 含 100 mg/L PAEs（DMP、DEP、DBP、DOP的質(zhì)量濃度均為25 mg/L）的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，采用梯度壓力法馴化，在30℃下振蕩培養(yǎng)7 d。隨后逐步轉(zhuǎn)接至質(zhì)量濃度分別為200、300、400、500 mg/L的PAEs無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度下均馴化7 d左右。用接種環(huán)蘸取少量菌液，采用平板劃線法在PAEs固體平板上進(jìn)行劃線分離純化。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種到PAEs固體平板上，重復(fù)此操作，直至得到純的單菌落，并通過(guò)肉眼觀察法對(duì)分離得到的單菌落的形態(tài)進(jìn)行觀察。生理生化鑒定參考文獻(xiàn)［16］的方法進(jìn)行。

1.3 細(xì)菌底物廣譜性測(cè)試

在20 mL的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入200 mg/L DBP、200 mg/L DMP、200 mg/L DEP、200 mg/L DOP、200 mg/L鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯［di-(2-ethylhcxyl) phthalate, DEHP］、200 mg/L 甲苯、200 mg/L鄰苯二甲酸單丁酯（mono-n-butyl phthalate, MBP）、200 mg/L 原兒茶酸（protocatechuic acid, PCA）、200 mg/L 鄰苯二甲酸二異辛酯（diisooctyl phthalate,DIOP）、200 mg/L鄰苯二甲酸（phthalic acid, PA）作為菌株生長(zhǎng)的唯一碳源，用高壓蒸汽鍋121℃下高壓滅菌20 min。取1 mL菌液至無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)7 d，重復(fù)2次，觀察菌株的生長(zhǎng)情況。

1.4 細(xì)菌的16S rDNA的擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增16S rDNA 片段［17］。50 μL 反應(yīng)體系含有 10×PCR buffer 5.0 μL、10 mmol/L dNTP 1.0 μL、25 mmol/L MgCl24.0 μL、Taq 酶 0.5 μL、引物 27F 1.0 μL、引物l492R l.0 μL、DNA模板 4.0 μL，其余成分為 ddH2O。反應(yīng)條件 ：94℃預(yù)變性 5 min ；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 90 s，共35個(gè)循環(huán) ；72℃延伸10 min，4℃保存。取5.0 μL的反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）產(chǎn)物的測(cè)序工作由睿博興科公司完成，并通過(guò)MEGA7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。為了進(jìn)一步確定該菌的分類地位，本研究將所得到的16S rRNA基因序列通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)EzBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）和細(xì)菌模式菌種進(jìn)行了相似性比對(duì)［18］。

1.5 DBP的生物降解試驗(yàn)

取菌株于含有50 μL DBP的100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)7 d，離心（轉(zhuǎn)速為10 000 r/min）5 min，用pH為7、濃度為0.02 mol/L的Na2HPO4·NaH2PO4緩沖液洗滌3次，收集菌體于錐形瓶中。吸取1 mL菌懸液，根據(jù)不同條件在含500 mg/L DBP的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.6 高效液相色譜分析法

1.6.1 樣品處理

將培養(yǎng)后的培養(yǎng)基菌液搖勻，全部轉(zhuǎn)移至50 mL無(wú)菌離心管中，加入10 mL乙酸乙酯，離心（轉(zhuǎn)速為6 000 r/min）5 min ；收集有機(jī)相至燒杯中，用10 mL乙酸乙酯萃取水相1次，并再次收集有機(jī)相至燒杯中。在通風(fēng)櫥中揮發(fā)一晚后，用甲醇定容至10 mL，稀釋至原濃度的1/5；用高效液相色譜儀測(cè)定DBP的殘留量。

1.6.2 液相色譜條件

色譜柱為SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×200 mm×5 μm），柱溫為 35℃，V流動(dòng)相甲醇∶V水=9∶l，流速為0.5 mL/min。檢測(cè)器波長(zhǎng)為228 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

1.7 氣相質(zhì)譜分析

1.7.1 樣品處理

將培養(yǎng)完的菌液轉(zhuǎn)移至50 mL無(wú)菌離心管中，加入10 mL乙酸乙酯，離心（轉(zhuǎn)速為6 000 r/min）5 min。收集有機(jī)相至燒杯中，用10 mL乙酸乙酯萃取水相1次，并再次收集有機(jī)相至燒杯中。在通風(fēng)櫥中揮發(fā)干后，用色譜純的正己烷定容至10 mL，稀釋至原濃度的1/5。

1.7.2 氣相質(zhì)譜條件

Thermo Trace DSQ Ⅱ色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀條件 ：1）初始溫度為60℃，以 20℃/min升溫至220℃并保留10 min，隨后以5℃/min升溫至300℃并保留5 min；2）離子源溫度為230℃，全掃描方式進(jìn)行；3）進(jìn)樣口溫度為260℃，接口溫度為280℃，流速為1.0 mL/min ；4）進(jìn)樣量為1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAEs降解菌SD2的分離與分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)肉眼觀察法可觀察到菌株SD2在平板上呈白色，菌落較大，表面呈不規(guī)則形狀，粗糙，微隆起，不透明，短桿狀，革蘭氏陽(yáng)性（圖1），專性好氧氣，無(wú)鞭毛。

圖1 菌株SD2的革蘭氏染色結(jié)果（×100）Fig. 1 Gram staining result of strain SD2 (×100)

本文采用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得了菌株SD2的16S rDNA序列，測(cè)序的長(zhǎng)度為1 378 bp。用MEGA 7軟件中的Clustal W將其與GenBank中已知菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比較，然后用neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，SD2與多種冢村菌的16S rRNA基因相似性高達(dá)99%（圖2）。同時(shí)，在數(shù)據(jù)庫(kù)EzBioCloud上的比對(duì)結(jié)果顯示，和SD2最相似的前十二個(gè)有效發(fā)表模式菌株均為冢村菌，其中SD2和Tsukamurella tyrosinosolvensDSM 44234T相似度為100%，和Tsukamurella ocularisHKU63T相似度為99.85%，和其他屬的相似度均低于96%。因此可以判定SD2屬于冢村菌屬。

圖2 菌株SD2的16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建Fig. 2 16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree construction of strain SD2

2.2 底物廣譜性試驗(yàn)

底物廣譜性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。由表1可見(jiàn)，SD2可以利用常見(jiàn)的且在污染環(huán)境中含量較高的PAEs類化合物（如DMP、DEP、DBP等），但無(wú)法利用支鏈較長(zhǎng)的PAEs（如DOP）。同時(shí)，SD2對(duì)主要的PAEs類化合物中的代謝產(chǎn)物（如PA、PCA）具有一定的利用能力。這預(yù)示著SD2具備將PAEs及其代謝產(chǎn)物完全降解的能力。

表1 PAEs降解菌株SD2的底物廣譜性Tab. 1 Substrate utilization profile for strain SD2

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)菌株降解DBP的影響

2.3.1 初始pH值對(duì)菌株降解DBP的影響

用0.1 mol/L的鹽酸和0.1 mol/L的NaOH調(diào)整無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH值分別至4、5、6、7、8、9、10，以DBP為唯一碳源，在溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)3 d。初始pH值對(duì)菌株降解DBP的影響如圖3所示。

圖3 初始pH值對(duì)菌株SD2降解DBP的影響Fig. 3 Effects of initial pH on DBP degradation by strain SD2

在pH值為4～8時(shí)，瓶中殘留DBP的質(zhì)量濃度呈緩慢下降趨勢(shì)，菌株生長(zhǎng)緩慢，其對(duì)DBP的降解作用受到抑制。在初始pH值為9時(shí)，DBP質(zhì)量濃度為0，表示DBP已經(jīng)完全被降解，菌株可以良好生長(zhǎng)。在初始pH值為10時(shí)，菌株生長(zhǎng)緩慢，其對(duì)DBP的降解作用受到抑制。酸堿度是影響微生物生長(zhǎng)的重要因素之一，不同pH值可以影響酶的活性，從而影響菌株降解DBP的能力。由此可見(jiàn)，SD2降解DBP的最適pH值為9。該菌株在偏堿性條件下可以生長(zhǎng)，且較適宜降解DBP，同時(shí)，初始pH值過(guò)低不利于菌株的生長(zhǎng)以及DBP的降解。

2.3.2 初始溫度對(duì)菌株降解DBP的影響

DBP為唯一碳源，在溫度分別為25、30、35、40和45℃，pH值為7，轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)3 d，初始溫度對(duì)菌株降解DBP的影響如圖4所示。

圖4 初始溫度對(duì)菌株SD2降解DBP的影響Fig. 4 Effect of initial temperature on DBP degradation by strain SD2

在25～35℃時(shí)，DBP已基本上被SD2完全降解，菌株可以良好生長(zhǎng)，具有較高的降解能力。在30℃時(shí)，DBP的質(zhì)量濃度為0，表示DBP已被完全降解。超過(guò)35℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)較慢。溫度也是影響微生物生長(zhǎng)的重要因素之一，不同的溫度會(huì)影響酶的活性，從而影響微生物的生長(zhǎng)與降解有機(jī)物的能力［19］。由此可見(jiàn)，該菌株適宜在30℃左右溫度下生長(zhǎng)，且降解DBP的能力較高。溫度過(guò)高會(huì)抑制SD2的生長(zhǎng)和DBP的降解。

2.3.3 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株降解DBP的影響

以DBP為唯一碳源，在溫度為30℃，pH值為7，轉(zhuǎn)速分別為0、75、150、225 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)速對(duì)菌株降解DBP的影響如圖5所示。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株SD2降解DBP的影響Fig. 5 Effect of rotation speed on DBP degradation by strain SD2

在靜止時(shí)，SD2對(duì)DBP降解的能力較強(qiáng)，菌株可以正常生長(zhǎng)。隨著轉(zhuǎn)速的增加，SD2在不同轉(zhuǎn)速條件下對(duì)降解DBP的影響差別較小，DBP均可以被降解，在不同轉(zhuǎn)速下菌株都能良好生長(zhǎng)。與其他轉(zhuǎn)速相比，最適宜降解DBP的轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2.3.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株降解DBP的影響

以DBP為唯一碳源，在溫度為30℃、pH值為7、轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)3 d，分別于12、24、36、48、60、72 h時(shí)取樣。培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株降解DBP的影響如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)SD2降解DBP的影響Fig. 6 Effect of culture time on DBP degradation by strain SD2

在培養(yǎng)初期，菌株的生長(zhǎng)及DBP的降解速度較快，SD2可以很快利用DBP提供的碳源。在72 h時(shí)，DBP可以被完全降解，充分說(shuō)明SD2是一株高效降解菌。

2.4 代謝產(chǎn)物分析

通過(guò)氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS）檢測(cè)DBP降解過(guò)程中的產(chǎn)物，并與氣質(zhì)聯(lián)用的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)可知，在SD2降解DBP 12 h后，在保留時(shí)間（待測(cè)組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間）為9.40 min和8.10 min時(shí)檢測(cè)到了DBP和鄰苯二甲酸丁基甲酯；SD2降解DBP 36 h后，在保留時(shí)間為5.69 min時(shí)檢測(cè)到了PA。質(zhì)譜圖如圖7所示。

經(jīng)菌株SD2降解12 h后，可以檢測(cè)到DBP的存在。經(jīng)菌株SD2降解36 h后，可以檢測(cè)到PA，通過(guò)降解試驗(yàn)，在降解36 h后，降解速度趨于平緩，可能是因?yàn)榉磻?yīng)生成了中間產(chǎn)物鄰苯二甲酸丁基甲酯和PA，而SD2對(duì)降解鄰苯二甲酸丁基甲酯和PA的能力較弱，從而導(dǎo)致降解速度變慢。降解72 h后幾乎沒(méi)有檢測(cè)到DBP及其中間產(chǎn)物，表明DBP已幾乎被完全降解。

圖7 鄰苯二甲酸二丁酯及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectrum of dibutyl phthalate and its metabolic product（a）鄰苯二甲酸二丁酯的質(zhì)譜圖；（b）鄰苯二甲酸丁基甲酯的質(zhì)譜圖；（c）PA的質(zhì)譜圖。(a) Mass spectrum of dibutyl phthalate； (b) Mass spectrum of butylmethyl phthalate； (c) Mass spectrum of phthalic acid.

研究表明，在好氧微生物的降解過(guò)程中，通過(guò)微生物酯酶將PAEs水解可生成鄰苯二甲酸單酯，并將其再生為PA。而成功降解PA才是完成整個(gè)降解過(guò)程的一個(gè)至關(guān)重要的步驟［20］。結(jié)合底物廣譜試驗(yàn)結(jié)果可知，該菌能繼續(xù)利用PA以及后續(xù)的代謝產(chǎn)物PCA，基本可以推測(cè)該菌能夠完全降解DBP。

3 討論

冢村菌是一類需氧、不產(chǎn)芽孢、無(wú)動(dòng)力的革蘭氏陽(yáng)性菌，主要分布于土壤、水以及活化淤泥的泡沫中［21］。雖然對(duì)于微生物可降解PAEs的研究很多，但是目前有關(guān)于冢村菌的生物降解研究的報(bào)告不多，僅有冢村菌降解十六烷和烷烴的研究報(bào)道［22-23］。本文第一次報(bào)道了該菌屬能夠降解PAEs污染物的研究。

本研究對(duì)冢村菌的降解特性及降解產(chǎn)物進(jìn)行了分析。從農(nóng)田土壤中篩選出一株能夠以DBP為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的微生物SD2。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到其16S rDNA并構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，分析發(fā)現(xiàn)SD2與多種冢村菌的16S rRNA基因的相似性高達(dá)99%。因此，初步鑒定該菌株為冢村菌。通過(guò)底物廣譜性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株SD2可以利用多種常見(jiàn)的PAEs類化合物，是一株能夠廣泛降解PAEs的菌株。本研究利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）測(cè)定了SD2的降解性能，發(fā)現(xiàn)了SD2對(duì)DBP的最佳降解條件：溫度為30℃，pH值為9，轉(zhuǎn)速為150 r/min。在該最佳條件下，SD2在72 h內(nèi)可以完全降解500 mg/L的DBP，表明該菌偏愛(ài)在偏堿性環(huán)境中生長(zhǎng)，并具備較高的DBP降解能力。通過(guò)GC-MS分析可初步推斷，SD2與DBP反應(yīng)生成的中間產(chǎn)物為鄰苯二甲酸丁基甲酯和PA。結(jié)合底物廣譜試驗(yàn)可知，PA及PCA均能被SD2降解，預(yù)示SD2可以完全降解DBP，并將土壤中PAEs轉(zhuǎn)化為CO2和H2O，同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生二次污染。下一步將開展該菌種的降解機(jī)制研究，通過(guò)基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，預(yù)測(cè)相關(guān)的降解基因并測(cè)定相關(guān)的酶活性質(zhì)，為后續(xù)的應(yīng)用開發(fā)提供基礎(chǔ)。

總之，本研究所篩選的冢村菌的底物廣譜性良好，降解速度快，在降解PAEs及其中間代謝產(chǎn)物中起到了重要作用，對(duì)環(huán)境污染的治理及修復(fù)具有一定的應(yīng)用潛力，同時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)大了PAEs生物降解菌資源，并為冢村菌降解有機(jī)污染物的研究提供了有利參考。