李 璟，伍 旭，彭 倩，王晨旭，楊 凡*

（1. 湖南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，長沙 410016；2. 中南大學(xué)腫瘤研究所，長沙 410078）

介孔材料是一類孔徑介于2～50 nm之間的多孔材料，具有有序而穩(wěn)定的納米級孔隙和巨大的比表面積，因此其作為藥物載體系統(tǒng)有著巨大的應(yīng)用前景［1］。介孔碳納米管（mesoporous carbon nanotube,MCN）是介孔材料中的一員，其不僅具有介孔材料本身固有的優(yōu)點，而且還具有出色的光熱轉(zhuǎn)化能力，可以用于腫瘤的光熱治療（photothermal therapy,PTT）［2］。近年來，基于MCN的腫瘤光熱治療體系受到研究人員的廣泛關(guān)注，成為頗為熱門的研究對象［3］。Chen等［4］制備了具有磁性和熱敏感性的有序介孔碳納米球，并裝載了抗腫瘤藥物阿霉素（doxorubicin, DOX），用于腫瘤的化療/光熱協(xié)同治療。Cai等［5］開發(fā)了基于氧化介孔碳納米顆粒的藥物轉(zhuǎn)運體系，在顆粒表面修飾長鏈聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）分子，介孔內(nèi)裝載藥物DOX，并用氨基化的氧化鋅量子點封堵介孔口，用于腫瘤的化療/光熱協(xié)同治療。

白藜蘆醇（resveratrol, Res）是最初從植物中提取得到的一種活性多酚類物質(zhì)，是植物為了抵御細(xì)菌或真菌入侵而產(chǎn)生的抗毒素［6］，其在抗腫瘤和治療心血管疾病、肥胖、糖尿病等方面有一定的療效［7］，是一種極具前景的抗癌分子。然而，Res在臨床中的應(yīng)用效果卻不盡如人意，主要是由于：1）Res為脂溶性物質(zhì)，在水中的溶解度小于68.8 μg/mL，所以通過口服的吸收率極低［8］；2）Res在體內(nèi)代謝迅速，其在人體血液中的半衰期約為8～14 min，難以保持較高的血藥濃度［9］；3）Res有順式（cis-）和反式（trans-）兩種異構(gòu)體，其活性形式為trans-Res，然而，trans-Res的穩(wěn)定性非常差，暴露在紫外光下會迅速異構(gòu)化為無活性的cis-Res［10］。因此，Res的生物利用度非常低，因到達(dá)體內(nèi)作用位點的藥物濃度達(dá)不到有效濃度，導(dǎo)致其在體內(nèi)的實際效果有限。

本文擬發(fā)展一種基于MCN的Res載藥系統(tǒng)，希望能夠高效地增加Res的水溶性、穩(wěn)定性及生物利用度。同時，利用MCN的光熱轉(zhuǎn)化能力，實現(xiàn)近紅外（near infrared, NIR）激光刺激-響應(yīng)的藥物定點釋放，進一步通過修飾葉酸靶向分子實現(xiàn)藥物的靶向定點釋放。更為重要的是，將腫瘤的化療與光熱治療有機地結(jié)合起來，可發(fā)揮兩者各自的優(yōu)勢，以達(dá)到最大的療效，產(chǎn)生最小的毒副作用，避免多藥耐藥的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MCN購自南京先豐納米材料科技有限公司；Res、atto647N-生物素（atto647N-biotin, ATTO）、鏈霉親和素（streptavidin, SA）購自美國Sigma-Aldrich公司；1,2-二肉豆蔻?；字８视停?,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, DMPG）購自美國Avanti公司 ；葉酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺［1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly（ethylene glycol）5000-folate, FA-PEG-DSPE］、生物素-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺［1,2-distearoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly（ethylene glycol）2000-biotin, biotin-PEG-DSPE］購自美國 Nanocs公司 ；噻唑藍(lán)（methylthiazole tetrazolium, MTT）購自上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；胎牛血清、羅斯威爾帕克紀(jì)念研究所 -1640（roswell park memorial institute-1640,RPMI-1640）培養(yǎng)基和細(xì)胞消化液購自美國Gibco公司 ；Hoechst 33342購自美國Invitrogen公司 ；所有試驗用水均為超純水（電阻率＞18.2 MΩ·cm）；人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7（Michigan cancer foundation-7）、人肺癌細(xì)胞A549由本實驗室細(xì)胞中心提供；雌性BALB/c裸鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。

F-20型高分辨透射電鏡（transmission electron mi-croscope, TEM）（日本電子光學(xué)研究所）；F-7000型熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；DU-800型紫外-可見分光光度計（美國Beckman公司）；3000HS型Zetasizer分析儀（美國Malvern公司）；E60型紅外熱成像儀（美國FLIR公司）；LSM900型激光共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss）；SB2200-T型超聲波清洗器（美國Branson公司）；Synergy LX型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；Direct Q8型超純水裝置（法國Merck Millipore公司）；HERAcell 150i型細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Thermo公司）。

1.2 試驗原理

如圖1所示，首先采用薄膜水化法制備納米脂質(zhì)體。納米脂質(zhì)體的組成成分為：1）DMPG，其能使脂質(zhì)體成型并帶負(fù)電荷；2）具有葉酸受體靶向能力的磷脂F(xiàn)A-PEG-DSPE；3）可修飾熒光染料的磷脂biotin-PEG-DSPE，在脂質(zhì)體合成后通過鏈霉素-親和素的方法將NIR熒光染料ATTO修飾在納米脂質(zhì)體上，用于熒光示蹤。隨后，利用MCN內(nèi)介孔結(jié)構(gòu)吸附抗腫瘤藥物Res。同時，在MCN表面包裹葉酸-聚乙二醇-脂質(zhì)體（folate-polyethylene glycol-liposome, FA-PEGLip），用于對MCN的介孔進行封堵，防止Res提前釋放。FA-PEG-Lip的包裹原理為：在超聲條件下，脂質(zhì)體中的磷脂分子通過親疏水作用發(fā)生重排，磷脂疏水性的尾部傾向于同樣疏水的MCN納米管表面，親水性的磷脂頭部朝向外側(cè)。最終形成裝載Res的FAPEG-Lip包裹的MCN（FA-PEG-Lip@MCN/Res）納米體系。

圖1 FA-PEG-Lip@MCN/Res多功能納米體系的制備及其應(yīng)用于葉酸受體介導(dǎo)的靶向化療/光熱協(xié)同腫瘤治療原理圖Fig. 1 Schematic illustration of the synthesis of FA-PEG-Lip@MCN/Res nanocomposites and their application for folate-mediated targeted chemo/photothermal synergistic cancer therapy

FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系通過尾靜脈注射進入小鼠體內(nèi)，經(jīng)血液循環(huán)進入腫瘤部位后，可以通過葉酸受體的靶向識別停留在腫瘤細(xì)胞表面，并通過細(xì)胞內(nèi)吞過程進入腫瘤細(xì)胞內(nèi)。在NIR激光的照射下，F(xiàn)A-PEG-Lip@MCN/Res納米體系將所吸收的光能轉(zhuǎn)化為熱能。光致升溫不僅可以使納米體系從內(nèi)涵體中逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，而且可以使FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系外層包裹的FA-PEG-Lip磷脂脫落，使MCN的介孔失去封堵物，從而將Res從MCN的介孔內(nèi)釋放出來。釋放在細(xì)胞質(zhì)中的Res可以作用于線粒體，進而作用于細(xì)胞核，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。光致高溫本身也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵蛋白變性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，通過化療/光熱協(xié)同治療可實現(xiàn)高效的腫瘤殺傷。

1.3 FA-PEG-Lip@MCN納米復(fù)合體系的制備

1.3.1 FA-PEG-Lip和FA/biotin-PEG-Lip納米脂質(zhì)體的制備

首先采用薄膜水化法制備FA-PEG-Lip納米脂質(zhì)體［11］。將DMPG、FA-PEG-DSPE按照物質(zhì)的量之比為9∶1（總的物質(zhì)的量為3 μmol）溶于3 mL氯仿/甲醇溶液中。然后，將上述溶液置于圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上37℃水浴條件下減壓蒸干有機溶劑，得到一層附在圓底燒瓶內(nèi)壁的薄脂膜。將含脂膜的圓底燒瓶置于玻璃真空干燥機內(nèi)干燥過夜，以完全去除殘留的有機溶劑。隨后，將4 mL超純水加入脂膜中，60℃水浴超聲10 min，使脂膜在水溶液中自組裝成磷脂雙分子層的納米脂質(zhì)體。最后，使用注射劑將上述脂質(zhì)體溶液過0.22 μm的聚碳酸酯膜2次，得到粒徑分布相對均一的脂質(zhì)體溶液。將該脂質(zhì)體溶液保存在4℃環(huán)境中備用。

含有生物素基團修飾的葉酸/生物素-聚乙二醇-脂質(zhì)體（FA/biotin-PEG-Lip）的制備所加入的組成磷脂為DMPG、FA-PEG-DSPE和biotin-PEG-DSPE，且3種磷脂物質(zhì)的量之比為17∶2∶1，總的磷脂含量保持在3 μmol。其他過程與上述FA-PEG-Lip脂質(zhì)體制備過程基本相同。

1.3.2 FA/ATTO-PEG-Lip納米脂質(zhì)體的制備

為了獲得NIR熒光成像的能力，本文將NIR熒光染料ATTO通過親和素-生物素交聯(lián)的方法修飾到上述合成的FA/biotin-PEG-Lip脂質(zhì)體表面。將0.004 mmol/L SA加入4 mL FA/biotin-PEG-Lip脂質(zhì)體中，在37℃金屬浴中震蕩反應(yīng)1 h，得到FA/SA-biotin-PEG-Lip脂質(zhì)體。最后，將0.040 mmol/L的ATTO加入體系中繼續(xù)反應(yīng)1 h，得到FA/ATTO-SA-biotin-PEGLip。使用截留量為10 kD的透析袋透析過夜，以去除過量的游離染料。簡便起見，下文將FA/ATTO-SA-biotin-PEG-Lip縮寫為FA/ATTO-PEG-Lip。

1.3.3 FA-PEG-Lip@MCN和FA/ATTO-PEG-Lip@MCN納米復(fù)合體系的制備

將 5 mg MCN 粉末加入 20 mL FA-PEG-Lip 溶液中，然后將混合液置于冰水浴中，使用超聲波細(xì)胞破碎儀（功率：200 W）超聲3 h。得到的產(chǎn)物以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，以去除未被脂質(zhì)體包裹的MCN。小心收集上清溶液，即為FA-PEG-Lip包裹的MCN（FA-PEG-Lip@MCN）。通過將FA-PEG-Lip溶液替換成FA/ATTO-PEG-Lip溶液，并使用相同的超聲包裹的方法可以得到FA/ATTO-PEG-Lip包裹的MCN（FA/ATTO-PEG-Lip@MCN）。

1.4 抗腫瘤藥物Res的裝載與NIR激光控制的藥物釋放行為的研究

本試驗以抗腫瘤藥物Res為模式藥物，通過FAPEG-Lip@MCN對Res的裝載來評估所構(gòu)建的藥物轉(zhuǎn)運體系的藥物裝載能力及NIR激光控制的藥物釋放行為。將不同質(zhì)量濃度的Res溶液、1 mg/mL MCN溶液與FA-PEG-Lip溶液混合，并在冰水浴中超聲處理8 h，制備裝載Res的FA-PEG-Lip@MCN（FA-PEGLip@MCN/Res）。未裝載的游離Res分子通過截留分子量為100 kD的超濾管離心去除。

建立Res的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以測量Res在FA-PEGLip@MCN/Res納米體系中的載藥量。然后，采用紫外 -可見分光光度計測定1 mg/mL FA-PEG-Lip@MCN/Res溶液在306 nm處的吸光度（A），同時測定未裝載Res的納米體系FA-PEG-Lip@MCN在306 nm處的吸光度（A0），通過A減去A0即可得到納米體系內(nèi)裝載的Res分子在306 nm的吸光度。根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到Res的裝載質(zhì)量。并通過公式（1）計算得到Res的載藥量：

NIR激光刺激的Res釋放行為的考察在37℃、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）中進行。以780 nm半導(dǎo)體激光器作為NIR光源，同時設(shè)置沒有NIR激光照射的FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系作為對照。取少量FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系置于2 mL離心管中，加入1.5 mL PBS緩沖液溶液。每隔一定時間，采用功率密度為0.8 W/cm2的NIR激光照射樣品10 min，取200 μL激光照射后的樣品高速離心（10 000 r/min，15 min），通過測量上清液中Res分子在306 nm處的紫外-可見吸收值來考察Res從納米體系中釋放的情況。進一步通過已建立的Res標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所釋放Res的質(zhì)量，最后根據(jù)公式（2）求得在NIR激光刺激下的Res釋放曲線。將測量完畢的上清液放回上述樣品體系中以保持體系的總體積不變。

1.5 FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res對腫瘤細(xì)胞的靶向識別效果的考察

以具有熒光示蹤能力的FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res納米體系為對象，考察其對葉酸受體陽性的MCF-7細(xì)胞的特異性識別效果，采用葉酸受體陰性的A549細(xì)胞作為對照。先分別將A549細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞以1×104個/孔的密度均勻地鋪在35 mm的激光共聚焦皿中，培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞充分貼壁。然后，用D-Hanks緩沖液清洗細(xì)胞，加入200 μL無血清培養(yǎng)基，將100 μg/mL FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res納米體系分別加入MCF-7及A549細(xì)胞中，在冰上孵育20 min，以提供納米體系靶向識別機會，避免非特異性吸附。用D-Hanks緩沖液清洗兩組細(xì)胞后，用Hoechst 33342染核10 min。最后將細(xì)胞孵育在PBS緩沖液中，使用激光共聚焦顯微鏡（100倍油鏡）拍照。

1.6 細(xì)胞水平上NIR激光刺激的化療/光熱協(xié)同治療效果的考察

通過細(xì)胞毒性試驗考察納米體系對MCF-7細(xì)胞的化療/光熱協(xié)同殺傷效果。首先，將處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞（1×105個/孔，100 μL）接種于96孔板內(nèi)，在37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)過夜。然后向細(xì)胞中分別加入20 μL不同質(zhì)量濃度的Res、FAPEG-Lip@MCN和FA-PEG-Lip@MCN/Res。37℃條件下孵育3 h后，用D-Hanks緩沖液清洗，并向每孔加入100 μL含10%FBS的新鮮培養(yǎng)基。按照試驗的分組情況，對需要NIR激光照射組采用功率密度為0.8 W/cm2的780 nm激光器照射5 min后，在37℃、5%CO2的環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。隨后，加入 20 μL MTT試劑，孵育4 h。小心去除含MTT的培養(yǎng)基，將150 μL DMSO加入每個孔中。震蕩3 min后，用酶標(biāo)儀測定樣品在490 nm處的吸光值。以上試驗均重復(fù)3次。以沒有經(jīng)過任何處理的細(xì)胞作為對照組，以未加入任何細(xì)胞或者試劑孔的紫外-可見吸收值為空白組，按照公式（3）計算細(xì)胞存活率：

1.7 活體水平上NIR激光刺激的化療/光熱協(xié)同治療效果的考察

首先制備MCF-7荷瘤裸鼠模型，通過皮下注射將200 μL分散在PBS緩沖液中的MCF-7細(xì)胞注射在BALB/c裸鼠的后腿上部。等待數(shù)日，當(dāng)腫瘤體積生長到大于100 mm3時，隨機將荷瘤裸鼠分為5個試驗組（n=3）：陰性對照組（PBS + NIR光照）、游離藥物組（Res處理）、單獨化療組（FA-PEG-Lip@MCN/Res處理）、單獨PTT組（FA-PEG-Lip@MCN + NIR光照）、化療/PTT組（FA-PEG-Lip@MCN/Res + NIR光照）。各種不同納米體系通過尾靜脈分別注射進入各試驗組荷瘤小鼠體內(nèi)。以MCN的質(zhì)量計算，納米體系注射劑量為2 mg/kg。需要NIR激光照射時，780 nm激光以0.8 W/cm2功率密度在腫瘤組織上連續(xù)照射5 min。每隔1 d采用游標(biāo)卡尺監(jiān)測腫瘤大小的變化，并根據(jù)公式（4）計算腫瘤的體積。采用相對腫瘤體積（V/V0）描述腫瘤大小的變化，其中V0為第0天測量得到的腫瘤體積，V為第n天測量得到的腫瘤體積。同時，每隔1 d稱量小鼠體重，以監(jiān)測可能產(chǎn)生的藥物急性毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 FA-PEG-Lip@MCN納米復(fù)合體的制備及表征

基于納米脂質(zhì)體中的磷脂與MCN之間的親疏水作用制備得到葉酸-聚乙二醇-脂質(zhì)體包裹的MCN（FA-PEG-Lip@MCN）納米體系。采用TEM表征裸的MCN及經(jīng)過脂質(zhì)體包裹后FA-PEG-Lip@MCN的形貌及粒徑。結(jié)果顯示，MCN具有典型的介孔結(jié)構(gòu)（圖2a），寬為（90±10）nm，長為（900±100）nm。而FA-PEG-Lip@MCN（圖2b）在經(jīng)過納米脂質(zhì)體的包裹后，仍然保留了規(guī)律的介孔結(jié)構(gòu)，寬度也沒有發(fā)生太大變化［（80±10）nm］，但是長度有所降低［（600±100）nm］。FA-PEG-Lip@MCN長度的減少是由于脂質(zhì)體包裹過程中的超聲處理所致。X射線能譜（energy-dispersive X-ray spectrum, EDS）顯示（圖 2c），MCN主要由碳元素組成（另外的銅元素峰來自銅網(wǎng)），說明該碳納米管是由高純度的碳元素構(gòu)成的。FA-PEGLip@MCN納米體系除碳元素外還出現(xiàn)了磷元素的特征峰（圖2d），而磷元素來自MCN表面包裹的脂質(zhì)體。該數(shù)據(jù)初步證實FA-PEG-Lip可以成功地包裹在MCN納米片表面?；瘜W(xué)元素面掃分析顯示（圖2e），F(xiàn)APEG-Lip@MCN納米體系出現(xiàn)了4種元素共定位，其中碳元素來自MCN，氮元素、氧元素和磷元素來自表面包裹的FA-PEG-Lip，這再次證實了FA-PEG-Lip可以成功地包裹在MCN納米片表面。繼續(xù)采用動態(tài)光散射（dynamic light scattering, DLS）法考察制備得到的FA-PEG-Lip@MCN納米體系。如圖3a所示：裸MCN納米管的表面電位為+22.7 mV；由帶負(fù)電荷的納米脂質(zhì)體（Zeta電位：-38.3 mV）包裹形成FA-PEG-Lip@MCN后表面電位下降為-10.2 mV。表面電位測定結(jié)果再次為脂質(zhì)體成功地包裹在MCN上提供了堅實的證據(jù)。綜上所述，通過一系列試驗，從元素組成變化、Zeta電位變化等方面均能證明FA-PEG-Lip@MCN納米體系制備成功。

圖2 不同樣品的透射電鏡、能譜圖和元素面掃描圖Fig. 2 TEM images, EDS data and elemental mapping results of different samples（a）MCN納米管的透射電鏡圖；（b）FA-PEG-Lip@MCN納米體系的透射電鏡圖；（c）MCN納米管的X-射線能譜圖；（d）FA-PEG-Lip@MCN納米體系的X-射線能譜圖（插入圖為放大倍數(shù)更大的透射電鏡圖）；（e）FA-PEG-Lip@MCN納米體系的元素面掃描圖。HAADF：高角度環(huán)形暗場成像圖；C：碳元素維度分布（紅色）；N：氮元素維度分布（橙色）；O：氧元素維度分布（黃色）；P：磷元素維度分布（綠色）。(a) TEM image of MCN nanotubes； (b) TEM image of FA-PEG-Lip@MCN nanocomposites； (c) EDS data of MCN nanotubes； (d) EDS data of FAPEG-Lip@MCN nanocomposites (the insert shows the TEM images with higher magni fication)； (e) Elemental mapping results of FA-PEG-Lip@MCN.HAADF: High-angle annular dark field image； C: Elemental mapping image of C (red)； N: Elemental mapping image of N (orange)； O: Elemental mapping image of O (yellow)； P: EDS elemental mapping image of P (green).

用小角度X射線衍射（X-ray diffraction, XRD）對合成的MCN進行了表征。結(jié)果如圖3b所示，MCN及FA-PEG-Lip@MCN在2θ≈1°附近均出現(xiàn)了典型的無定型介孔結(jié)構(gòu)的衍射峰，進一步證明了納米脂質(zhì)體的包裹對FA-PEG-Lip@MCN納米體系的介孔結(jié)構(gòu)基本沒有影響，為其作為抗腫瘤藥物載體提供了基礎(chǔ)。此外，廣角XRD（圖3c）的2θ值在24°～43°之間有一個寬的衍射峰，表明合成的MCN納米管具有無定形介孔碳的性質(zhì)。氮氣吸附-解吸表明（圖3d），合成的MCN在相對壓力（P/Po）≈ 0.4處具有典型的IV型曲線，通過Barrett-Joyner-Halenda模型計算得到介孔尺寸為3.4 nm。MCN具有規(guī)則的介孔結(jié)構(gòu)，能夠為藥物的吸附提供巨大的比表面積，因而可作為藥物載體。

2.2 合成FA-PEG-Lip@MCN/Res的表征

圖3 不同樣品的表征結(jié)果Fig. 3 Characterization of different samples（a）Zeta電位結(jié)果；（b）小角度X衍射圖；（c）廣角X衍射圖；（d）氮氣吸附-脫附圖譜（插入圖為相應(yīng)的孔徑分布圖）。(a) Zeta potential results； (b) Small-angle XRD pattern； (c) Wide-angle XRD pattern； (d) N2 adsorption-desorption isotherms (the insert shows the corresponding pore diameter distributions).

在證明FA-PEG-Lip@MCN的成功合成后，本文選擇了Res作為模式藥物研究該納米體系的載藥性能。Res是一種活性多酚類物質(zhì)，其在抗腫瘤、治療心血管疾病、肥胖、糖尿病等方面有一定的防治作用［7］。但是由于其為脂溶性藥物，在體內(nèi)代謝迅速，因此，游離Res到達(dá)體內(nèi)作用位點的藥物濃度達(dá)不到所需的量，在生物體內(nèi)的實際效果有限。本文通過將Res與MCN、FA-PEG-Lip混合并超聲處理制備裝載Res的FA-PEG-Lip@MCN（FA-PEG-Lip@MCN/Res）納米體系，擬提高其水溶性和穩(wěn)定性，以達(dá)到安全、高效地增強Res療效的目的。測定FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的紫外-可見吸收光譜的結(jié)果如圖4a所示。在306 nm處發(fā)現(xiàn)了Res的特征吸收峰，初步證明Res分子可以被成功裝載到FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系中。根據(jù)文獻(xiàn)報道，MCN對吸附在其表面的熒光分子有強烈的淬滅作用［12］，所以本文通過測量同質(zhì)量濃度的Res在裝載進入FA-PEGLip@MCN/Res納米體系前后的熒光發(fā)射光譜來驗證其是否成功裝載。使用325 nm光激發(fā)FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系，在400 nm處觀察Res熒光發(fā)射光譜的強度變化。如圖4b所示，Res在裝載進入FAPEG-Lip@MCN/Res納米體系后，熒光強度明顯下降，僅存在一個微弱的熒光發(fā)射峰。這是由于Res分子吸附在MCN表面后其熒光被MCN淬滅所致。通過紫外-可見分光光度計測量FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的吸收值，并根據(jù)Res的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出Res在FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的載藥量約為 131.59 mg/g MCN。

圖4 不同樣品的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的表征結(jié)果Fig. 4 UV-vis absorption spectra and fluorescence spectra of different samples（a）FA-PEG-Lip@MCN/Res的紫外-可見吸收光譜 ；（b）FA-PEG-Lip@MCN/Res的熒光光譜 ；（c）FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res的紫外-可見吸收光譜；（d）FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res的熒光光譜（插入圖為熒光成像照片）。(a) UV-vis absorption spectra of FA-PEG-Lip@MCN/Res； (b) Fluorescence spectra of FA-PEG-Lip@MCN/Res； (c) UV-vis absorption spectra of FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res； (d) Fluorescence spectra of FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res (the insert shows the fl uorescence images).

將NIR熒光染料ATTO通過鏈霉素-親和素交聯(lián)的方法修飾到納米體系上制備ATTO交聯(lián)的FA-PEGLip@MCN/Res（FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res），以獲得NIR熒光示蹤能力。如圖4c所示，采用紫外-可見分光光度計測定FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res的吸收光譜，發(fā)現(xiàn)在647 nm處出現(xiàn)了ATTO的特征吸收峰。隨后測定FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的熒光光譜發(fā)現(xiàn)（圖4d），F(xiàn)A-PEG-Lip@MCN/Res沒有任何熒光，而在修飾帶ATTO染料的脂質(zhì)體后，F(xiàn)A/ATTOPEG-Lip@MCN/Res納米體系發(fā)出了較強的熒光信號，證明FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res確實具有較好的熒光示蹤能力。

為考察FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的光熱升溫能力，本文采用780 nm激光以0.8 W/cm2的功率密度照射不同質(zhì)量濃度的FA-PEG-Lip@MCN/Res溶液，實時監(jiān)測溶液的溫度變化。結(jié)果如圖5a所示，超純水對照的溫度僅輕微上升到30.5℃。而不同質(zhì)量濃度的FA-PEG-Lip@MCN/Res溶液則有明顯的升溫，質(zhì)量濃度為31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 μg/mL 的 FA-PEG-Lip@MCN/Res溶液經(jīng)過5 min的NIR激光照射后，溫度分別上升到44.5、48.1、53.2、56.4和61.2℃。紅外熱成像儀拍攝的熱成像圖則更為直觀地展示了溫度的變化情況。如圖5b所示，F(xiàn)A-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的溫度表現(xiàn)出與質(zhì)量濃度及NIR激光照射時間呈正相關(guān)。此外，經(jīng)過5輪的反復(fù)升溫，該納米體系的升溫能力未發(fā)生明顯衰減（圖5c），說明該FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系具有良好的光熱穩(wěn)定性。有文獻(xiàn)報道，大于45℃的溫度就能夠引起腫瘤細(xì)胞的凋亡［13］。所以，F(xiàn)A-PEGLip@MCN/Res納米體系能夠作為光熱試劑應(yīng)用于腫瘤的PTT。

圖5 光熱升溫效率的考察Fig. 5 Investigation of photothermal transduction efficiency（a）不同質(zhì)量濃度的FA-PEG-Lip@MCN/Res用NIR激光（780 nm，0.8 W/cm2）照射后的溫度變化 ；（b）不同質(zhì)量濃度的FA-PEG-Lip@MCN/Res在NIR激光照射下的紅外熱成像圖；（c）FA-PEG-Lip@MCN/Res經(jīng)過5輪循環(huán)的光熱穩(wěn)定性考察。(a) Photothermal heating curves of FA-PEG-Lip@MCN/Res with different concentrations upon NIR laser exposure (780 nm, 0.8 W/cm2)；(b) Thermal imaging photographs of different concentrations of FAPEG-Lip@MCN/Res upon NIR laser illumination； (c) The photothermal stability of FA-PEG-Lip@MCN/Res for five cycles.

2.3 NIR激光觸發(fā)的藥物控制釋放行為的考察

能使所包裹的藥物分子以NIR激光刺激-響應(yīng)的方式釋放是本文的主要設(shè)計意圖之一。故本文對比了FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系在有、無NIR光刺激的情況下藥物的釋放行為。如圖6所示，在沒有NIR激光照射的情況下，F(xiàn)A-PEG-Lip@MCN/Res納米體系中Res的釋放較少，在整個240 min的考察期間，僅有不到40%的藥物釋放。而加入NIR激光照射刺激后，F(xiàn)A-PEG-Lip@MCN/Res納米體系表現(xiàn)出瀑布型的藥物突釋。例如：在第50分鐘使用780 nm激光以0.8 W/cm2的功率密度進行10 min照射后，藥物的釋放量由15.47%增加到34.41%。當(dāng)停止NIR光照之后，藥物的釋放速率則隨之降低。重新進行光照后，藥物釋放再次加速，以此往復(fù)。具體的情況為：在第110分鐘進行NIR激光照射后，Res的釋放量由43.95%增加到60.66%；在第170分鐘進行NIR激光照射后，藥物的釋放量由68.73%增加到80.75%；經(jīng)過第230 分鐘NIR激光照射后，藥物的釋放量由85.71%增加到90.88%。綜上所述，F(xiàn)A-PEG-Lip@MCN/Res納米體系中的Res可以在NIR激光照射刺激下實現(xiàn)可控釋放。

圖6 FA-PEG-Lip@MCN/Res溶液在有、無NIR激光（780 nm，0.8 W/cm2）照射下Res的釋放曲線Fig. 6 NIR-laser-triggered release behavior of FA-PEG-Lip@MCN/Res with or without NIR laser (780 nm, 0.8 W/cm2) illumination

2.4 FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res對腫瘤細(xì)胞的靶向識別效果考察

為驗證所構(gòu)建的FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系對腫瘤細(xì)胞的靶向識別效果，本文采用修飾了NIR熒光染料ATTO的FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res考察其對葉酸受體陽性腫瘤細(xì)胞的特異性識別情況。如圖7所示，激光共聚焦（confocal laser scanning microscopy, CLSM）試驗表明，葉酸受體陽性的MCF-7細(xì)胞表面出現(xiàn)較強的紅色熒光信號，而葉酸受體陰性的A549細(xì)胞表面則僅有微弱的熒光信號，這是由于FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res納米體系經(jīng)由葉酸受體介導(dǎo)的識別作用特異性結(jié)合到了MCF-7細(xì)胞上所致。以上結(jié)果可以證實，F(xiàn)A/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res納米體系確實能夠靶向識別葉酸受體陽性的MCF-7細(xì)胞。

圖7 特異性識別效果的考察Fig. 7 Specific binding assay將FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res分別與葉酸受體陰性的A549細(xì)胞和葉酸受體陽性的MCF-7細(xì)胞孵育后的激光共聚焦顯微鏡成像圖。其中藍(lán)色代表Hoechst 33342的熒光，紅色代表ATTO染料的熒光。CLSM images of folate receptor-negative A549, and folate receptorpositive MCF7 cells treated with FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res.Blue represents the fl uorescence of Hoechst 33342, red represents the fl uorescence of ATTO dye.

2.5 腫瘤細(xì)胞化療/光熱協(xié)同殺傷效果的考察

良好的生物相容性是一個具有臨床應(yīng)用前景的納米藥物運輸載體的必備條件之一。在考察納米體系腫瘤治療效果之前需先評價藥物載體FAPEG-Lip@MCN本身的生物安全性。如圖8a所示，與FA-PEG-Lip@MCN孵育后的MCF-7細(xì)胞表現(xiàn)出良好的存活率，即使FA-PEG-Lip@MCN的質(zhì)量濃度高達(dá)80 μg/mL時，MCF-7細(xì)胞的存活率仍然保持在92.43%。以上結(jié)果說明藥物載體FA-PEG-Lip@MCN擁有良好的生物相容性。

圖8 細(xì)胞水平上的協(xié)同治療Fig. 8 Synergistic therapy in vitro（a）不同質(zhì)量濃度的FA-PEG-Lip@MCN對MCF-7細(xì)胞的毒性考察；（b）不同治療方式對MCF-7的殺傷效果。(a) Cytotoxicity assays of different concentration of FA-PEG-Lip@MCN with MCF-7 cells； (b) Cytotoxicity assays of MCF-7 cells following various treatments as indicated.

同時，本文進一步開展了細(xì)胞水平上的化療/光熱協(xié)同腫瘤治療的研究。如圖8b所示，游離Res（黑色柱）對MCF-7細(xì)胞的殺傷能力較弱，即便將游離Res的質(zhì)量濃度提高到10.5 μg/mL，其對腫瘤細(xì)胞的治療效果仍然非常有限。當(dāng)將Res裝載到FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系內(nèi)時，F(xiàn)A-PEG-Lip@MCN/Res（綠色柱）對MCF-7細(xì)胞的殺傷效果有一定提升（Res：85.03% vs FA-PEG-Lip@MCN/Res：75.02%）。同時，單獨PTT組（紅色柱）也展現(xiàn)出了一定的腫瘤細(xì)胞殺傷能力，用質(zhì)量濃度為80 μg/mL（以復(fù)合體系中MCN的質(zhì)量濃度計算）的FA-PEG-Lip@MCN + NIR處理后的MCF-7細(xì)胞存活率為59.11%。而化療/光熱協(xié)同治療組（紫色柱）取得了最好的腫瘤細(xì)胞治療效果，用質(zhì)量濃度為80 μg/mL（以復(fù)合體系中MCN的質(zhì)量濃度計算）的FAPEG-Lip@MCN/Res + NIR處理后的MCF-7細(xì)胞存活率僅僅為31.23%。以上結(jié)果初步證明FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系具有化療/光熱協(xié)同腫瘤治療的能力。

2.6 活體水平上的化療/光熱協(xié)同腫瘤治療效果的考察

圖9 活體水平上的協(xié)同治療Fig. 9 Synergistic therapy in vivo（a）具有代表性的荷瘤小鼠經(jīng)過不同處理的照片；（b）不同治療組荷瘤小鼠的腫瘤生長曲線；（c）不同治療組的荷瘤小鼠的體重變化曲線。(a) Digital photographs of representative mice with different treatments； (b) Tumor growth curves of different groups of tumor-bearing mice after various treatment； (c) Body weight curves of different groups of tumor-bearing mice after various treatment.

在獲得FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系對腫瘤細(xì)胞有高效的化療/光熱協(xié)同殺傷結(jié)果后，本文進一步在更為復(fù)雜的活體水平上開展了腫瘤協(xié)同治療試驗。將荷瘤裸鼠隨機分為以下5個試驗組：1）陰性對照組（PBS + NIR光照）；2）游離藥物組（Res處理）；3）單獨化療組（FA-PEG-Lip@MCN/Res處理）；4）單獨PTT組（FA-PEG-Lip@MCN + NIR光照）；5）化療/PTT協(xié)同治療組（FA-PEG-Lip@MCN/Res + NIR光照）。在進行完各組治療后，每隔1 d使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的大小，根據(jù)公式算出腫瘤的相對體積，并繪制腫瘤的生長曲線，以此判斷各組的治療效果。如圖9a和9b所示：試驗組1（PBS + NIR光照）中荷瘤裸鼠的腫瘤生長基本沒有受到任何抑制，其腫瘤仍然以較快的速度在長大；試驗組2（游離Res處理）對腫瘤生長抑制的能力仍然非常有限，可能由于游離Res在活體內(nèi)被快速代謝所致；試驗組3（FA-PEG-Lip@MCN/Res單獨化療）中腫瘤的治療效果明顯好于同質(zhì)量濃度游離Res的療效，這可能是由于Res在裝載進入FAPEG-Lip@MCN/Res后，其穩(wěn)定性及生物利用度有所提升［14］；試驗組4（FA-PEG-Lip@MCN + NIR光照）中腫瘤的生長速度同樣有所減緩，說明單獨PTT也有一定的療效；令人印象深刻的是，試驗組5（FA-PEGLip@MCN/Res + NIR光照）中腫瘤生長被完全抑制。試驗組5之所以取得良好的治療效果，是因為該納米體系所具有的葉酸受體靶向運輸能力、抗腫瘤藥物的控制釋放以及化療與PTT的協(xié)同殺傷多種功能共同作用的結(jié)果。同時本文監(jiān)測了各組小鼠在治療過程中體重的變化情況（圖9c），結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)小鼠體重減輕的情況，說明各個組治療后均沒有產(chǎn)生急性毒副作用。以上結(jié)果說明，F(xiàn)A-PEG-Lip@MCN/Res納米體系在活體水平上取得了良好的化療/光熱協(xié)同腫瘤治療效果。

3 討論

惡性腫瘤已經(jīng)成為中國人的主要死亡原因之一［15］，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院赫捷院士團隊［16］的最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在我國，全年惡性腫瘤發(fā)病約392.9萬人，死亡約233.8萬人。這意味著，我國每1分鐘即有7.4人被確診患癌，4.4人死于惡性腫瘤，其防控形勢異常嚴(yán)峻。而化療、放療、手術(shù)治療等傳統(tǒng)的腫瘤治療方法存在靶向能力差、毒副作用大及復(fù)發(fā)率高等缺陷［17］。并且腫瘤存在異質(zhì)性，即腫瘤組織內(nèi)部的腫瘤細(xì)胞并不是完全一樣的，各個腫瘤細(xì)胞從基因型到表現(xiàn)型均存在差異，并由此導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長速度、侵襲能力差異較大，且對抗腫瘤藥物的敏感程度也有所不同［18］。長期采用一種方式進行腫瘤治療很容易造成腫瘤的多藥耐藥，從而失去治療效果。而根據(jù)腫瘤異質(zhì)性設(shè)計更精準(zhǔn)的治療方法組合才能發(fā)揮最大的療效、產(chǎn)生最小的毒副作用，避免多藥耐藥的發(fā)生?；诖?，發(fā)展一種協(xié)同治療體系來進行腫瘤治療是十分必要的。

光熱治療是利用納米材料優(yōu)異的吸光能力將光能轉(zhuǎn)換為熱能，通過加熱病灶部位來達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞目的的一種治療方式，其能夠通過“雙選擇”實現(xiàn)對腫瘤部位的特異性治療。首先，納米治療體系所修飾的靶向分子對腫瘤組織有特異性識別的能力，此為第一重選擇過程；其次，可以通過控制治療激光的照射部位、照射激光強度以及照射時間實現(xiàn)對腫瘤部位的特異性殺傷［19］，此為第二重選擇過程。因此，光熱治療具有高特異性和低毒副作用的優(yōu)勢。MCN具有獨特的表面效應(yīng)、超大的比表面積、良好的光熱轉(zhuǎn)換效率以及較好的生物相容性等物理化學(xué)性質(zhì)，在腫瘤的化療/光熱協(xié)同治療領(lǐng)域潛力巨大［20］。

本文基于MCN為藥物運輸載體運載抗腫瘤藥物Res，同時選用FA-PEG-Lip包裹，構(gòu)建了裝載Res的FA-PEG-Lip包裹MCN（FA-PEG-Lip@MCN/Res）納米體系。該納米體系能夠通過葉酸受體介導(dǎo)的靶向識別過程特異性進入葉酸受體陽性的腫瘤細(xì)胞。由于Res能通過氫鍵和疏水作用吸附在MCN的介孔結(jié)構(gòu)內(nèi)［21］，所以該納米體系能夠提高Res的水溶性、穩(wěn)定性、生物利用度，從而提高Res的抗腫瘤治療效果。同時，利用FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系中MCN的高效光熱轉(zhuǎn)化能力，一方面可以提高腫瘤部位的局部溫度，進而直接殺死腫瘤，實現(xiàn)腫瘤的PTT；另一方面，光致升溫可以作為一種刺激信號，控制藥物在腫瘤部位定點釋放。此外，適度高溫也可以增加腫瘤組織對化療藥物的敏感性，實現(xiàn)化療、光熱作用效果的疊加，從而達(dá)到腫瘤的協(xié)同治療。細(xì)胞水平上以及動物水平上的試驗表明，該納米體系能夠?qū)崿F(xiàn)高效的腫瘤化療/光熱協(xié)同治療?；谄鋬?yōu)異的協(xié)同治療效果及良好的生物安全性，我們相信FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系有望應(yīng)用于實際的臨床腫瘤治療。