施亞磊，于靜芳，吳 珂，周 俊*

（1. 華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631；2. 華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，廣東省激光生命科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631；3. 河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，開(kāi)封 475004）

擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為模式生物已有將近50年的歷史，被廣泛應(yīng)用于植物生物學(xué)的遺傳發(fā)育研究。擬南芥是二倍體，含有5對(duì)染色體，大約27 655個(gè)蛋白編碼基因［1］。目前，基于正向遺傳學(xué)（forward genetics）的突變體篩選仍然是遺傳研究中十分重要的手段，通過(guò)自發(fā)突變或人工誘變獲得感興趣的表型性狀改變，然后找到這些特定性狀變化所對(duì)應(yīng)的突變基因，并揭示其生物學(xué)功能。由此可見(jiàn)，鑒定異常表型的基因突變是解決植物生物學(xué)問(wèn)題的關(guān)鍵一步，然而該過(guò)程通常是困難并且費(fèi)時(shí)的。目前，在擬南芥的研究中已經(jīng)發(fā)展出很多方法來(lái)鑒定突變基因。其中，圖位克隆是較常用的方法，它依賴于染色體上位置已知的遺傳或分子標(biāo)記［2-3］。分子標(biāo)記多指DNA標(biāo)記，是能夠鑒定區(qū)別個(gè)體或物種差異的染色體上的DNA序列，其源自于不同類(lèi)型的突變，如插入、缺失、替換、重構(gòu)或隨機(jī)重復(fù)DNA的復(fù)制錯(cuò)誤等［4］。分子標(biāo)記種類(lèi)很多，如簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（simple sequence length polymorphism, SSLP）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）、酶切擴(kuò)增多態(tài)性（cleaved amplified polymorphisms, CAPS）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat, SSR）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）等［5-8］?？煽糠肿訕?biāo)記的開(kāi)發(fā)將極大地促進(jìn)擬南芥的圖位克隆。

插入或缺失（insertion/deletion, INDEL）標(biāo)記是常用的基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）的分子標(biāo)記。PCR產(chǎn)物通過(guò)電泳分析，可以直接獲得差異信息和連鎖數(shù)據(jù)［3］。目前，許多INDEL標(biāo)記已經(jīng)被開(kāi)發(fā)和報(bào)道，并收集在TAIR（Arabidopsis information resource）數(shù)據(jù)庫(kù)中。然而，一些已報(bào)道的分子標(biāo)記只能在特定的PCR或電泳條件下工作，或者因不同擬南芥生態(tài)型的擴(kuò)增產(chǎn)物差異太小而無(wú)法區(qū)分［9］。此外，這些可利用的標(biāo)記并非均勻地分布在染色體上，通常只有那些與已報(bào)道研究的突變體緊密連鎖的分子標(biāo)記才被提交到了TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)，使得好用的標(biāo)記數(shù)量非常有限，不利于基因定位和連鎖分析［10］。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和測(cè)序成本的大幅降低，越來(lái)越多的生態(tài)型的基因組序列被公布，這使得從全基因組層面開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記成為可能［11］。因此，通過(guò)比較基因組學(xué)的方法，建立一個(gè)精細(xì)的、方便使用的分子標(biāo)記非常有助于擬南芥的圖位克隆。

為了尋找盡可能多的分子標(biāo)記以提高圖位克隆效率，本研究進(jìn)行了哥倫比亞（Columbia, Col）和蘭茲伯格（Landsberg erecta,Ler）的全基因組序列比對(duì)分析，找出了2個(gè)基因組具有差異序列的保守區(qū)域。從插入或缺失染色體物理位置中，篩選得到2 321個(gè)INDEL標(biāo)記。此外，我們提供了對(duì)應(yīng)每個(gè)分子標(biāo)記位點(diǎn)的至少一對(duì)引物序列（共計(jì)4 764對(duì)）。本工作能夠極大地方便相關(guān)研究者找到合適的分子標(biāo)記，提高擬南芥突變體的圖位克隆效率。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

植物培養(yǎng)方法與之前文獻(xiàn)［12-14］所述一致，擬南芥野生型Col、Ler種子經(jīng)含0.05% Triton X-100的75%乙醇震蕩消毒10 min，隨后于超凈臺(tái)中用100%乙醇置換75%乙醇，并將種子轉(zhuǎn)移到滅菌濾紙上，干燥15 min后，撒種于1/2MS固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)板置于4℃冰箱中黑暗處理2 d，然后放置于人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，光周期為16 h（光）/8 h（暗），晝夜溫度為23℃（晝）/21℃（夜）。

1.2 參考基因組的獲取

從 NCBI（national center for biotechnology information）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得擬南芥Col和Ler參考基因組。Col基因組下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001735.4；Ler基因組下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_001651475.1。

1.3 基于基因組比較的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

使用MUMmer3.23軟件對(duì)Col和Ler的基因組進(jìn)行比較，鑒定全基因組中具有INDEL差異的保守區(qū)域。取出INDEL在Col參考基因組的上游和下游各150 bp序列，通過(guò)Primer3批量設(shè)計(jì)引物（條件：引物長(zhǎng)度為23個(gè)堿基，GC含量約43%，Tm值約53℃，引物對(duì)應(yīng)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為80～150 bp）。使用MFEprimer2軟件對(duì)引物的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量、引物3'端穩(wěn)定性、退火溫度、GC含量等進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 DNA提取

DNA提取采用TPS方法［15］。取一片4周擬南芥葉片于 1.5 mL EP 管中，加入 200 μL TPS 緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 ；10 mmol/L乙二胺四乙酸鈉，pH 8.0；1 mol/L氯化鉀），電動(dòng)研磨均勻后，于60℃放置20 min，隨后 12 000 r/min離心 10 min。取上清，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，12 000 r/min離心10 min后棄上清，沉淀用70%酒精懸浮，12 000 r/min再次離心10 min后棄去上清，干燥1 d，獲得DNA樣品。

1.5 PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳

從擬南芥全基因組中選取23個(gè)均勻分布在5條染色體上的候選標(biāo)記合成引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳［16］。PCR 體系（20 μL）：10 μL 2×Green Taq Mix（Vazyme）；2 μL 引物 ；1 μL DNA 模板 ；7 μL H2O。PCR 擴(kuò)增條件如下 ：94℃預(yù)變性 3 min ；94℃變性30 s；53℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳條件：在120 V電場(chǎng)強(qiáng)度下，經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳30 min后，在紫外光下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Col和Ler全基因組INDEL標(biāo)記開(kāi)發(fā)和統(tǒng)計(jì)

為了開(kāi)發(fā)Col和Ler全基因組的INDEL標(biāo)記，我們先使用MUMmer3軟件將Col的基因組和Ler的基因組進(jìn)行比對(duì)，找出含有INDEL的保守序列片段，再使用Primer3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過(guò)MFEprimer2軟件對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證。表1為各個(gè)染色體上的INDEL及分子標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)。從表1可知，基因組中平均每0.1 Mbp染色體長(zhǎng)度大約有2個(gè)分子標(biāo)記，平均每4到5個(gè)基因就有1個(gè)分子標(biāo)記。圖1展示的是全基因組的INDEL（≥6 bp）及分子標(biāo)記的長(zhǎng)度分布。我們可以看到，隨著分子標(biāo)記差異長(zhǎng)度的增加，INDEL及分子標(biāo)記的數(shù)量呈遞減趨勢(shì)。

表1 Col和Ler之間INDEL數(shù)量的鑒定Tab. 1 Identification of INDEL numbers between Col and Ler

圖1 Col和Ler基因組INDEL（≥6 bp）及分子標(biāo)記的長(zhǎng)度分布Fig. 1 Length distribution of INDEL and putative markers between Col and LerINDEL長(zhǎng)度不小于6 bp，藍(lán)色代表INDEL，紅色為分子標(biāo)記。隨著長(zhǎng)度增加，INDEL及分子標(biāo)記的數(shù)量呈遞減趨勢(shì)。Col基因組為參考序列。The length of INDEL (blue) is no less than 6 bp, the molecular markers are labeled whth red. As the length increases, the number of INDEL and molecular markers decreases. The reference genome is from Col.

2.2 INDEL標(biāo)記在各個(gè)染色體上精細(xì)分布

從10 449個(gè)不小于6個(gè)堿基插入或缺失染色體的物理位置中，我們篩選得到2 321個(gè)INDEL標(biāo)記。為了更好地展示INDEL標(biāo)記在各個(gè)染色體上的分布，我們將基因、INDEL和分子標(biāo)記按照每50 kb的區(qū)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。圖2最外側(cè)為染色體的具體起始位置，基因（橙色）、INDEL（藍(lán)色）和分子標(biāo)記（深灰色）依次排開(kāi)。分子標(biāo)記數(shù)目最多的是第一號(hào)染色體，有591個(gè)，而分子標(biāo)記密度最大的是第五號(hào)染色體，平均每0.1 Mbp的染色體物理長(zhǎng)度有2.09個(gè)（表1和圖2）。同樣，從圖3可以看到第一號(hào)染色體的15 Mbp處、第三號(hào)染色體14 Mbp處和第五號(hào)染色體的14 Mbp處的基因、INDEL和分子標(biāo)記數(shù)量都較其他區(qū)域少，應(yīng)為著絲粒的區(qū)段。

2.3 隨機(jī)分子標(biāo)記的驗(yàn)證分析

圖2 INDEL及分子標(biāo)記在Col和Ler全基因組上的分布Fig. 2 Distribution pattern of INDEL and markers of Col against Ler最外側(cè)為染色體。從第2圈向內(nèi)，依次為基因（橙色）、INDEL（≥6 bp，藍(lán)色）和分子標(biāo)記（深灰色），每50 kb為1個(gè)統(tǒng)計(jì)單位。The outermost part represents Col chromosome. From the second circle inward, there are genes (orange), INDEL (≥6 bp, blue) and molecular markers(dark gray) in order, with a statistical unit of every 50 kb.

圖3 設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記在染色體上的分布Fig. 3 The distribution of designed molecular markers on chromosomes紅色豎線表示每個(gè)分子標(biāo)記在染色體上的位置，藍(lán)色圓點(diǎn)表示為驗(yàn)證的初定位分子標(biāo)記位點(diǎn)。The red vertical bars indicate the position of each molecular marker on the chromosome, and the blue dots indicate the site of veri fied molecular marker used to first-pass mapping.

針對(duì)這2 321個(gè)INDEL標(biāo)記，我們共設(shè)計(jì)了4 764對(duì)引物，使得每個(gè)位點(diǎn)有一對(duì)或多對(duì)引物可供選擇。詳細(xì)引物序列及其染色體的物理位置可從At_InDel_Marker［23］（https://github.com/zhoujun1988/AtMarker/blob/master/At_InDel_Marker）獲取。在此基礎(chǔ)上，我們選擇了均勻分布在擬南芥5條染色體的20個(gè)分子標(biāo)記（表2），并通過(guò)PCR和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。圖4結(jié)果顯示，這些引物能夠在統(tǒng)一的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件下獲得穩(wěn)定的結(jié)果。Col與Ler混合樣品能夠擴(kuò)增出明顯差異條帶，使得該套分子標(biāo)記可直接應(yīng)用于突變基因的初步定位分析。

圖4 PCR驗(yàn)證用于鑒定突變位點(diǎn)的初定位分子標(biāo)記Fig. 4 Verified the molecular markers used to first-pass mapping by PCR3個(gè)泳道的DNA模板依次來(lái)自于Col、Ler及Col與Ler混合樣品。DNA templates for the three lanes were obtained from the Col, Ler, Col and Ler mixed samples.

3 討論

圖位克隆是鑒定基因突變位點(diǎn)的經(jīng)典方法，其實(shí)施離不開(kāi)可靠的遺傳標(biāo)記或分子標(biāo)記。Col和Ler是擬南芥最常用的2個(gè)生態(tài)型。基于這2種生態(tài)型間的多態(tài)性，本研究利用比較基因組學(xué)，篩選得到應(yīng)用于擬南芥基因圖位克隆的2 321個(gè)新的INDEL標(biāo)記，并通過(guò)PCR驗(yàn)證了隨機(jī)均勻分布在5條染色體的20個(gè)分子標(biāo)記，后者可直接應(yīng)用于基因的快速初定位。本工作提供的精細(xì)分子標(biāo)記，能夠極大地方便研究者找到合適的候選標(biāo)記，提高圖位克隆作圖效率。

經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記已經(jīng)從最初的基于印跡反應(yīng)的RFLP，到基于PCR的SSLP、AFLP、SSR和INDEL，再到基于測(cè)序技術(shù)的SNP［17-18］。早期的RFLP、AFLP等雖然都對(duì)物種鑒定、進(jìn)化分析和基因圖位克隆等有巨大的幫助和促進(jìn)，但由于各自的不足（如試驗(yàn)條件要求高、操作復(fù)雜、或者不是共顯性等），這些分子標(biāo)記的應(yīng)用還是受到了極大的限制［19-20］。SNP的分子標(biāo)記數(shù)量最多，卻因?yàn)殍b定需要特殊的條件（如酶切或者測(cè)序），使其應(yīng)用成本較高［23］。SSR和INDEL都可以通過(guò)PCR和凝膠電泳來(lái)使用［21］。SSR也屬于INDEL的范疇，然而，INDEL存在數(shù)量更大、對(duì)基因組的覆蓋更廣、應(yīng)用更便捷高效的優(yōu)勢(shì)。

在眾多分子標(biāo)記中，PCR檢測(cè)多態(tài)性（如CAPS、SSLP、AFLP、RAPD）因操作相對(duì)簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀可靠成為標(biāo)記首選［3，22］。針對(duì)擬南芥而言，在TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)中，由于大多數(shù)分子標(biāo)記并非同時(shí)開(kāi)發(fā)，研究者需要事先對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，一些分子標(biāo)記往往不能使用相同的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，使得操作變得繁瑣。本研究針對(duì)新開(kāi)發(fā)的2 321個(gè)INDEL標(biāo)記，設(shè)計(jì)了至少1對(duì)或多對(duì)（共計(jì)4 764對(duì)）可供選擇的引物（At_InDel_Marker［23］和表2）。重要的是，我們初步測(cè)試的20個(gè)分布于5條染色體的分子標(biāo)記可采用相同的PCR條件得到穩(wěn)定的結(jié)果（圖4），這大大提高了工作效率。通過(guò)該研究能夠方便研究者找到合適的分子標(biāo)記，在常見(jiàn)的儀器條件和較低的試驗(yàn)成本下可快速進(jìn)行突變體基因定位。