朱 琴，張宏江，張春輝，崔紅利，薛金愛(ài)，李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種單細(xì)胞真核綠藻，在分類(lèi)學(xué)上屬于綠藻門(mén)（Chlorophyta）、紅球藻屬（Haematococcus）［1］。雨生紅球藻細(xì)胞在適宜環(huán)境條件下為含少量蝦青素的綠色游動(dòng)形態(tài)，逆境條件下（如高光、高溫、高鹽）轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓r青素的紅色不動(dòng)細(xì)胞［2-3］。蝦青素（astaxanthin）是一種紅色酮式類(lèi)胡蘿卜素，其抗氧化活性遠(yuǎn)大于類(lèi)胡蘿卜素和天然維生素E，被譽(yù)為“超級(jí)抗氧化劑”［4-5］。雨生紅球藻是目前已知的蝦青素含量最高的物種，在脅迫條件下蝦青素含量最高可達(dá)到細(xì)胞干重的6%［6］，因此被認(rèn)為是提取天然蝦青素的理想材料［7］。

雨生紅球藻蝦青素主要是以酯化形式（蝦青素單酯和雙酯）存在，存儲(chǔ)于油體中［8］。油體又稱(chēng)脂滴或脂質(zhì)體，是高等植物種子、花粉、裸子植物種子、真菌和藻類(lèi)中儲(chǔ)存中性脂質(zhì)的細(xì)胞器［9-10］。油體主要分為三酰甘油（triacylglycerols, TAG）內(nèi)層，磷脂單分子（phospholipids, PL）外層及鑲嵌其中的油體結(jié)合蛋白。目前在不同種子的油體中已鑒定出3類(lèi)完整的油體結(jié)合蛋白，即油蛋白（oleosin）、鈣蛋白（caleosin）和甾體蛋白（steroleosin）［11］，它們廣泛存在于高等植物和藻類(lèi)的油體中［12］。

油體結(jié)合caleosin和oleosin的結(jié)構(gòu)相似，都具有穩(wěn)定油體的功能［13］，形成差異的原因主要是這2種蛋白的3個(gè)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度不同：caleosin和oleosin分別有85%和55%的殘基在其N(xiāo)末端和C末端結(jié)構(gòu)域中突出，并覆蓋于油體表面，其余15%和45%的殘基位于中央疏水結(jié)構(gòu)域［14］。據(jù)推測(cè)，當(dāng)使用相同量的三酰甘油時(shí)，等量的caleosin比oleosin能覆蓋更多的油體表面積，可見(jiàn)caleosin似乎是比oleosin更有效（或經(jīng)濟(jì)）的結(jié)構(gòu)蛋白［15］。caleosin在植物體中具有重要的生物學(xué)功能（如參與膜融合和脂肪體融合等過(guò)程）［16］，然而，與其他高等植物芍藥［16］、蓖麻［17］、油菜［18］等相比，藻類(lèi)中油體結(jié)合蛋白的生理和功能特性仍缺乏研究，雨生紅球藻中還未見(jiàn)caleosin基因的相關(guān)報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)雨生紅球藻caleosin（HaeClo）的基因進(jìn)行分子克隆與表達(dá)分析,旨在揭示HaeClo蛋白的生物學(xué)功能，為HaeClo基因在植物基因工程、生物技術(shù)及生物化學(xué)的應(yīng)用上提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而為通過(guò)遺傳改良HaeClo蛋白來(lái)提高雨生紅球藻蝦青素的含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)所用藻種為雨生紅球藻，現(xiàn)存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。將雨生紅球藻接種于MCM（modified Chalmers medium）培養(yǎng)基上，于（22.5±1.0）℃、光照條件下靜置培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1 300 lx，光 /暗周期為12 h/12 h，且每 8 h搖勻1 次。本試驗(yàn)所用受體菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）BL21(DE3)，載體質(zhì)粒為pET-28a(+)，均保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的雨生紅球藻作為試驗(yàn)樣品，通過(guò)Takara公司的試劑盒，用TRizol法提取總核糖核酸（ribonucleic acid, RNA），操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。所提RNA必須于-80℃冰箱中保存以避免降解。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后測(cè)其濃度和純度［19］。

1.2.2 cDNA模板制備和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）模板制備

本試驗(yàn)用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime-ScriptTMRT Reagent Kit with Gdna Eraser）合成 cDNA模板，用Clontech公司的試劑盒（SMARTer TM RACE cDNA Ampli-cation Kit）制備cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid-amplification of cDNA ends, RACE）模板，以上操作步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)［20］。

1.2.3 同源克隆及RACE擴(kuò)增

從NCBI GenBank中查找出與HaeClo基因序列親緣關(guān)系較近的4種綠藻：盤(pán)藻（Gonium pectoral）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、團(tuán)藻（Volvox carteri f. nagariensis）和小球藻（Chlorellavulgaris）。序列比對(duì)獲得高度保守的氨基酸序列，用CODEHOP軟件設(shè)計(jì)HaeClo的同源克隆引物（F1，R1和F2，R2）。以制備的cDNA為模板結(jié)合設(shè)計(jì)的引物，按照TaKaRa LA Taq?擴(kuò)增體系進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），從而獲得HaeClo的同源克隆片段。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收目的條帶用于后續(xù)試驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)5'和3'端引物（5'RACE R3，R4和3'RACE F3，F(xiàn)4），以制備的RACE cDNA、5'和3'端引物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后通過(guò)DNAStar軟件拼接，得到HaeClo基因cDNA序列全長(zhǎng)，并據(jù)此設(shè)計(jì)表達(dá)框引物（F5，R5）。以上設(shè)計(jì)的引物信息均由上海生工生物工程公司合成，詳見(jiàn)表1。

1.3 生物信息學(xué)分析

HaeClo的生物信息學(xué)分析需要用到大量在線軟件和本地軟件，現(xiàn)將本試驗(yàn)分析所用軟件名稱(chēng)、用途及網(wǎng)址收集整合至表2。

表1 文中用到的引物信息Tab. 1 Primer information used in the article

表2 生物信息學(xué)分析資源Tab. 2 Bioinformatics analysis resources

1.4 HaeClo基因在脅迫條件下的表達(dá)分析

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的雨生紅球藻作為試驗(yàn)樣品，混勻后均分為6組，每組設(shè)3個(gè)平行，根據(jù)給予不同的脅迫處理分為以下試驗(yàn)組別：正常光全氮組、高白光全氮組、高藍(lán)光全氮組、1/4氮組、高白光+1/4氮組及高藍(lán)光+1/4氮組，分別記為CK、HLW、HLB、1/4N、HLW+1/4N及HLB+1/4N。全氮及1/4氮處理根據(jù)MCM培養(yǎng)基中（NH4）MO7O24·4H2O和KNO3的濃度換算配制，高白光和高藍(lán)光光照強(qiáng)度為3 000 lx。在處理第0、1、2、3、4天時(shí)分別收集雨生紅球藻細(xì)胞樣品制備cDNA模板，然后進(jìn)行熒光定量PCR分析HaeClo基因的表達(dá)。

1.5 HaeClo蛋白的原核表達(dá)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

為了研究HaeClo蛋白的特性，本研究設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行ORF的PCR擴(kuò)增，獲得了克隆載體，抽提質(zhì)粒后將其與表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a(+)分別進(jìn)行雙酶切，切膠回收后的HaeCloORF片段和pET-28a(+)載體片段連接構(gòu)成重組質(zhì)粒pET-28a(+)-HaeClo，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中誘導(dǎo)原核表達(dá)，以上操作步驟參考于曉娜［21］的方法。在28℃下用0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21菌株，同時(shí)以相同條件處理的pET-28a(+)空載體做對(duì)照，分別在12 h和24 h取樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取與HaeClo基因克隆

圖1 雨生紅球藻總RNA的提取及HaeClo基因克隆電泳圖Fig. 1 Extraction of total RNA from H. pluvialis and electrophoresis of HaeClo gene cloningM ：Marker DL2000。M: Marker DL2000.

圖2 雨生紅球藻中HaeClo的核苷酸序列和氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide sequences and amino acid sequences of HaeClo in H. pluvialis紅色框標(biāo)出的“ATG”代表起始密碼子，“TAG”代表終止密碼子。The “ATG” marked in the red box represents the initiation codon, and the “TAG” represents the termination codon.

如圖1中泳道所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到RNA未發(fā)生明顯降解，其濃度和純度均在適宜范圍內(nèi)，質(zhì)量較好，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。雨生紅球藻總RNA反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA模板，結(jié)合設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得HaeClo的同源克隆片段，以制備的RACE cDNA和5'、3'端引物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的雨生紅球藻5'端、中間片段和3'端序列拼接起來(lái)得到HaeClo基因的cDNA全長(zhǎng)序列（NCBI注冊(cè)號(hào)：MT612719）。分析表明（圖2），HaeClo的cDNA序列全長(zhǎng)為1 088 bp，共編碼262個(gè)氨基酸，編碼區(qū)從62～847共786 bp，其中5'-非翻譯區(qū)（5'-untranslation region, 5'-UTR）和3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）的長(zhǎng)度分別為61 bp和241 bp，還帶有一個(gè)poly（A）尾巴。通過(guò)BLAST在線對(duì)HaeClo的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果表明，其與盤(pán)藻和萊茵衣藻來(lái)源的caleosin（NCBI檢索號(hào)見(jiàn)表3）相似性分別達(dá)到66%和61%。

2.2 HaeClo蛋白的理化性質(zhì)分析

ProtParam軟件分析結(jié)果表明，雨生紅球藻中Hae-Clo蛋白的分子式為C1345H2067N351O378S9，理論等電點(diǎn)為7.73，屬于堿性蛋白。編碼該蛋白的氨基酸共有20種，其中含量較高的氨基酸為脯氨酸（Pro，8.8%）、賴(lài)氨酸（Lys，8.0%），而半胱氨酸（Cys，0.8%）和組氨酸（His，2.3%）的含量較低。帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）與帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)分別為31和30個(gè)。該蛋白的消光系數(shù)為53 525，吸光系數(shù)為1.815，平均親水系數(shù)為-0.413，不穩(wěn)定性指數(shù)(II)為47.61，脂肪酸系數(shù)為77.74，因此我們將該蛋白質(zhì)歸類(lèi)為不穩(wěn)定蛋白。

ProtScale軟件分析結(jié)果顯示：HaeClo蛋白親水性/疏水性分析最高值為2.556，位于第105和第106位氨基酸，最低值為-2.744，位于第167位氨基酸；該蛋白在中間區(qū)域存在一個(gè)明顯的疏水區(qū)，有較強(qiáng)的疏水性，在N端和C端氨基酸殘基區(qū)域都表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性。這表明HaeClo蛋白是一個(gè)兩末端區(qū)域?yàn)橛H水性、中間區(qū)域?yàn)槭杷缘牡鞍住?/p>

使用PSORT軟件對(duì)HaeClo蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，HaeClo蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，為胞內(nèi)蛋白。NetPhos-3.1軟件預(yù)測(cè)到HaeClo蛋白的絲氨酸（Ser）最多，有29個(gè)，在C端分布比較緊密。蘇氨酸（Thr）的磷酸化位點(diǎn)有8個(gè)，酪氨酸（Tyr）的磷酸化位點(diǎn)最少，為4個(gè)。

2.3 HaeClo蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

SOPMA軟件預(yù)測(cè)HaeClo蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示（圖3a），HaeClo蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲（圖3a中紫色線條區(qū)域）所占蛋白質(zhì)的比例最高（42.15%），α-螺旋（藍(lán)色線條區(qū)域）所占蛋白質(zhì)比例次之（41.38%），此外，延伸鏈（紅色線條區(qū)域）和β-折疊（綠色線條區(qū)域）分別占10.34%和6.13%，由此可推測(cè)，HaeClo蛋白為混合型蛋白。圖3b為HaeClo蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。NCBI-CDD軟件預(yù)測(cè)HaeClo蛋白在122～291位存在一個(gè)結(jié)構(gòu)域，屬于典型的caleosin家族。SignalP 5.0軟件信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，編碼HaeClo蛋白的氨基酸序列中沒(méi)有信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，由此可知，HaeClo為非分泌蛋白。

2.4 HaeClo蛋白的多序列比對(duì)分析

為了更好地研究HaeClo，本研究通過(guò)Clustal W和BioEdit軟件對(duì)HaeClo進(jìn)行了多序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示（圖4），目標(biāo)序列HaeClo（用紅色標(biāo)出)與從團(tuán)藻（Volvocales）、小球藻（Chlorella）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativaL.）及芝麻（Sesamum indicum）等中分離的caleosin有相似的結(jié)構(gòu)，參照Pasaribu等［22］的研究結(jié)果，將caleosin結(jié)構(gòu)從上到下分隔標(biāo)出區(qū)域，分別為N末端親水性鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域、中央疏水性油體錨定結(jié)構(gòu)域和C末端親水性磷酸化結(jié)構(gòu)域。以上相關(guān)序列信息在表3中顯示。

表3 caleosin序列物種名稱(chēng)及其登錄號(hào)Tab. 3 Caleosin sequence species name and their GenBank accession numbers

圖3 雨生紅球藻中HaeClo蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（a）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（b）的預(yù)測(cè)Fig. 3 The secondary structure (a) and tertiary structure (b) prediction of HaeClo in H. pluvialis

圖4 雨生紅球藻HaeClo與其他來(lái)源caleosin的部分序列比對(duì)Fig. 4 Partial sequence alignment of HaeClo in H. pluvialis with caleosins from other species鈣結(jié)合基序、脯氨酸結(jié)基序和酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)的片段用紅色方框標(biāo)出，名稱(chēng)在底部標(biāo)出。The fragments of calcium binding motif, proline knot motif and casein kinase II phosphorylation site are marked with red boxes and the names are marked at the bottom.

2.5 HaeClo蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

我們從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜集到20個(gè)物種的caleosin序列（包括高等植物和藻類(lèi)）并進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析（MEGA-7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)），以便更好地研究HaeClo與其他來(lái)源caleosin的進(jìn)化關(guān)系。分析結(jié)果顯示（圖5），HaeClo與團(tuán)藻、萊茵衣藻和盤(pán)藻等藻類(lèi)來(lái)源的caleosin明顯聚為一支，高等植物類(lèi)caleosin另聚為一支，兩支最終匯在一起。由此可見(jiàn)，HaeClo與其他藻類(lèi)來(lái)源的caleosin親緣關(guān)系比高等植物類(lèi)的caleosin親緣關(guān)系更近一些，追溯根源，它們可能具有共同的祖先和相似的功能。以上相關(guān)序列信息（包括物種名稱(chēng)、簡(jiǎn)寫(xiě)及其登錄號(hào)）在表3中顯示。

圖5 雨生紅球藻HaeClo的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 5 Phylogenetic analysis of HaeClo in H. pluviali

2.6 HaeClo基因在脅迫條件下的表達(dá)分析

本文檢測(cè)了HaeClo基因在正常培養(yǎng)和其他不同脅迫條件下的表達(dá)譜（圖6a），結(jié)果顯示，在6種不同脅迫條件下，0 ～ 3 d時(shí)HaeClo基因的表達(dá)量逐漸上升，第3天時(shí)表達(dá)量均達(dá)到最高值，4 d后HaeClo基因的表達(dá)量開(kāi)始下降。在處理第3天時(shí)，HLB+1/4N組HaeClo的表達(dá)量達(dá)峰值，比CK組的表達(dá)量提高了2.4倍，HLW+1/4N組HaeClo的表達(dá)量次之，HLB組HaeClo的表達(dá)量高于HLW組、1/4N組和CK組。取表達(dá)量最高的第3天進(jìn)行半定量PCR分析檢測(cè)（圖6b），結(jié)果與圖6a表達(dá)一致。

圖6 雨生紅球藻HaeClo基因在不同處理下的表達(dá)分析Fig. 6 Expression analysis under different treatments of HaeClo gene in H. pluviali（a）熒光定量PCR；（b）半定量PCR(a) Quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction(qRT-PCR)； (b) Semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction (sqRT-PCR)

2.7 HaeClo蛋白的原核表達(dá)和SDS-PAGE分析

由圖7分析結(jié)果可以看出，與pET-28a(+)空載體相比較（泳道1、2），pET-28a(+)-HaeClo在29.5 kD的位置出現(xiàn)了新條帶（泳道3、4），大小均與預(yù)測(cè)蛋白大小相吻合，初步證明了pET-28a(+)-HaeClo在BL21菌株中表達(dá)成功。而比較不同的IPTG誘導(dǎo)時(shí)間可以看出，誘導(dǎo)24 h的蛋白表達(dá)量較誘導(dǎo)12 h的蛋白表達(dá)量有明顯提高。

3 討論

TAG是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脂肪酸合成相關(guān)酶催化合成的，caleosin合成后被運(yùn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與已經(jīng)合成的TAG結(jié)合形成復(fù)合體（即油體的前體），復(fù)合體經(jīng)過(guò)多次融合后脫離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成油體［23］。由此可見(jiàn)，caleosin是油體合成必不可少的物質(zhì)。本研究通過(guò)克隆獲得雨生紅球藻caleosin基因，并對(duì)其編碼蛋白的理化特征及功能進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，HaeClo的cDNA序列全長(zhǎng)為1 088 bp，共編碼262個(gè)氨基酸，含量最高的是脯氨酸（Pro），其中5'端和3'端長(zhǎng)度分別為61 bp和241 bp，帶有一個(gè)poly（A）尾巴。HaeClo的氨基酸序列與盤(pán)藻和萊茵衣藻來(lái)源的caleosin相似性分別達(dá)到66%和61%，暗示該基因在雨生紅球藻中可能編碼caleosin蛋白，是油體合成必不可少的物質(zhì)。

圖7 雨生紅球藻HaeClo原核表達(dá)和純化SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression and purification of HaeClo in H. pluvialiM ：蛋白質(zhì)Marker；1～2 ：pET-28a（+）空載誘導(dǎo)12 h、24 h ；3～4 ：pET-28a（+）-HaeClo誘導(dǎo)12 h、24 h ；5 ：鎳柱親和純化后的目的蛋白。箭頭代表目的蛋白。M: Protein Marker； 1～2: pET-28a(+) no-load induction for 12 h, 24 h；3～4: pET-28a(+)-HaeClo induction for 12 h, 24 h； 5: Puri fied target protein after af finity puri fication on nickel column. Arrow represents the target protein.

丁勇等［24］的研究表明，caleosin的N末端親水性鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有能結(jié)合1個(gè)鈣離子的EF-hand模體，這可能與鈣離子調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。中間疏水性錨定結(jié)構(gòu)域中的脯氨酸-結(jié)模體與α-螺旋域相鄰，一方面能在caleosin與油體及雙層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（endoplasmic reticulum, ER）的靶向過(guò)程中發(fā)揮作用，另一方面可以增加caleosin蛋白的疏水性，從而增加種子油體的穩(wěn)定性［25］。HaeClo屬于典型的caleosin家族，其C末端結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)酪蛋白激酶II（casein kinase II, CKII）磷酸化位點(diǎn)，位于第142、144和163位氨基酸，可能參與鈣結(jié)合和翻譯后修飾（如二硫鍵和部分絲氨酸磷酸化），并在油體成熟及動(dòng)員中傳遞信號(hào)，這與Purkrtova等［26］、丁勇等［24］的研究結(jié)果一致。多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析驗(yàn)證了HaeClo與其他來(lái)源的caleosin具有共同的祖先和相似的功能，進(jìn)一步暗示了該基因在雨生紅球藻中可能編碼caleosin蛋白，從而增加油體的穩(wěn)定性。

caleosin的特殊結(jié)構(gòu)保持了油體之間的相互獨(dú)立和穩(wěn)定，其中間疏水區(qū)域插入到油體內(nèi)部，C末端和N末端留在油體表面，像許多樹(shù)杈將油體表面緊密包裹起來(lái)，形成一道屏障來(lái)保護(hù)油體［17］，從而使油體對(duì)高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等有了一定的耐受能力［27］。在干旱［28］、低溫［29］、鹽脅迫［30］等逆境脅迫條件下，caleosin基因上調(diào)表達(dá)，同時(shí)植物合成大量油體。也有研究表明，caleosin基因可以調(diào)控脂肪酸的積累［17］。目前caleosin基因的克隆在植物中研究較多，在藻類(lèi)中研究較少，且雨生紅球藻中caleosin的相關(guān)研究分析尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，高白光、高藍(lán)光和缺氮等脅迫均有利于雨生紅球藻caleosin基因的上調(diào)表達(dá)，其中高藍(lán)光培養(yǎng)的效果大于高白光和缺氮培養(yǎng)，多因素組合脅迫（高藍(lán)/白光+1/4氮）效果大于單因素脅迫，這與翟映雪［31］、Katsuda等［32］研究中caleosin基因上調(diào)表達(dá)的同時(shí)植物大量合成油體的結(jié)果一致。Hae-Clo蛋白的原核表達(dá)和SDS-PAGE分析結(jié)果表明，目的蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)，可以進(jìn)行下一步的功能研究。

本研究首次從雨生紅球藻中克隆獲得編碼Hae-Clo的cDNA序列并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)高光和缺氮等不同脅迫條件下的雨生紅球藻進(jìn)行了半定量PCR和熒光定量PCR分析，進(jìn)一步研究了HaeClo基因在雨生紅球藻中的表達(dá)，為HaeClo基因在植物基因工程、生物技術(shù)及生物化學(xué)上的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而為探究雨生紅球藻中HaeClo調(diào)控雨生紅球藻油脂含量、蝦青素含量以及蝦青素在油體儲(chǔ)存的相關(guān)機(jī)制等方面奠定了基礎(chǔ)。