劉麗玲，趙 楊，張啟云，方 杰，陳 麗，艾保全，熊建文*

（1. 華南師范大學(xué)物理與電信工程學(xué)院，廣州 510006；2. 廣東工業(yè)大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，廣州 510006）

光動(dòng)力療法（photodynamic therapy, PDT）是近年興起的一種旨在選擇性消除癌細(xì)胞的非手術(shù)方法，因其具有療效準(zhǔn)確、復(fù)發(fā)率低、創(chuàng)傷性小等優(yōu)點(diǎn)而成為治療白血病的新方法［1-2］。PDT具有三大基本要素：光敏劑、光源及組織氧濃度［3］，其中光敏劑是PDT的核心要素，因此研制新型高效的光敏劑就成為一個(gè)重要的工作。TiO2納米顆粒被認(rèn)為是PDT中的一種潛在光敏劑，但由于純TiO2具有較寬的帶隙（3.2 eV）寬度，使其可見(jiàn)光響應(yīng)較低，表面生成的電子和空穴復(fù)合率高，此外TiO2的熱力學(xué)性能不穩(wěn)定導(dǎo)致其易團(tuán)聚，因而在PDT的臨床應(yīng)用中受到了一定的限制［4］。

為了解決上述難題，國(guó)內(nèi)外諸多研究學(xué)者對(duì)TiO2進(jìn)行了改性研究（例如非金屬摻雜、金屬摻雜、半導(dǎo)體復(fù)合、量子點(diǎn)修飾等［5-9］），使其光催化活性得到了顯著提高。其中鐵的摻雜能很好地改善TiO2的性能，使其在可見(jiàn)光波段的吸收光譜顯著紅移［10］，但暴露在TiO2表面的金屬離子可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。近來(lái)的研究表明，殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然、無(wú)毒、具有良好生物相容性的氨基多糖，可被不同的水解酶降解。該生物聚合物在生物體抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［11-12］，其在酸性介質(zhì)中的聚陽(yáng)離子性質(zhì)有利于與多陰離子的物質(zhì)形成強(qiáng)靜電相互作用，能夠有效地發(fā)揮生物載體的功能［13-14］。

本文選用CS對(duì)Fe-TiO2進(jìn)行包裹，以三聚磷酸鈉為聚陰離子模板分子誘導(dǎo)CS形成CS@Fe-TiO2納米顆粒［12］，將TiO2的吸收光譜拓展至可見(jiàn)光區(qū)，使其具有良好的生物相容性。此外，為了增強(qiáng)CS@Fe-TiO2光動(dòng)力治療白血病的效果，本研究進(jìn)一步使用了對(duì)癌細(xì)胞具有靶向作用的葉酸（folic acid, FA）對(duì)其進(jìn)行修飾，以實(shí)現(xiàn)其對(duì)癌細(xì)胞的特異性結(jié)合，從而達(dá)到提高PDT滅活HL60細(xì)胞的效率。此外，本文將FACS@Fe-TiO2和CS@Fe-TiO2對(duì)HL60細(xì)胞的滅活效果進(jìn)行了對(duì)比，并深入探究了PDT滅活HL60細(xì)胞的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞株

早幼粒細(xì)胞白血病的細(xì)胞系（HL60）由中山大學(xué)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 試劑與儀器

鈦酸丁酯，硝酸，硝酸鐵（FeN3O9·9H2O），三聚磷酸鈉，冰乙酸，無(wú)水乙醇，F(xiàn)A（C19H19N7O6，≥99.9%），CS（脫乙酰度≥95%），二甲基亞砜［（CH3）2SO］，三乙胺（C6H15N，≥99.5%），N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，C4H5NO3，≥98%），臺(tái)盼藍(lán)試劑（美國(guó) Invitrogen），CCK-8（cell counting kit-8）試劑（日本同仁化學(xué)研究所），四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF，天津 致遠(yuǎn)），活性氧檢測(cè)試劑（普利萊），RPMI-1604培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco）。

掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM），X射線粉末演示儀（德國(guó) Bruker），傅里葉紅外光譜儀（Nicolet6700，美國(guó) 熱電尼高力），UV-1700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu），WFY-28型熒光分光光度計(jì)（天津 拓普），超微振蕩器（姜堰 新康），SK2510LHC超聲儀（上海 科導(dǎo)），磁力加熱攪拌器（江蘇 科析），酶標(biāo)儀（美國(guó) Bio Rad），CountessTM型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó) Invitrogen），PDT反應(yīng)室（自行設(shè)計(jì)），SW-CJ型潔凈工作臺(tái)（蘇州 安泰），HH·CP-TW（80 L）二氧化碳培養(yǎng)箱（上海 一恒科技），干燥箱，96孔板及細(xì)胞計(jì)數(shù)板等其他常規(guī)器皿。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制備復(fù)合納米顆粒FA-CS@Fe-TiO2

Fe-TiO2的制備：室溫下，將20 mL鈦酸丁酯與10 mL無(wú)水乙醇混合，磁力攪拌30 min后得到A溶液；稱取質(zhì)量為0.458 g的硝酸鐵（FeN3O9·9H2O）加入到無(wú)水乙醇中，超聲分散至完全溶解得到B溶液；在磁力攪拌的狀態(tài)下將B溶液緩慢加入A中，并用適當(dāng)?shù)南跛嵴{(diào)節(jié)溶液的pH，繼續(xù)攪拌1.5 h直至形成均勻透明的溶膠；溶膠經(jīng)陳化、干燥和熱處理得到摻鐵量為2%的Fe-TiO2。用同樣的方法制得純的TiO2。

CS@Fe-TiO2的制備 ：取0.100 g的三聚磷酸鈉溶于10 mL的去離子水中，磁力攪拌30 min后得A液；取0.250 g的CS溶于10 mL的冰乙酸中，磁力攪拌2.0 h 后得 B液 ；取0.500 g的 Fe-TiO2超聲分散于10 mL的無(wú)水乙醇中直至完全溶解得C液；先將A液緩慢滴入B液中，隨后將C液緩慢滴入并不斷攪拌得混合液D；室溫下磁力攪拌3.0 h完成官能化后用去離子水清洗3次，離心后于80℃下真空干燥，所得納米顆粒命名為CS@Fe-TiO2（1:1）。用同樣的方法制得CS@Fe-TiO2（3:2）和 CS@Fe-TiO2（2:1）。

FA的活化及對(duì)CS@Fe-TiO2的修飾：稱0.500 g的CS@Fe-TiO2（1:1）于10 mL的冰乙酸中充分溶解得I液 ；取0.180 g三乙胺和0.500 g FA加入到20 mL的二甲基亞砜中，磁力攪拌2.0 h后，稱取0.260 g羥基琥珀酰亞胺、0.470 g二環(huán)已基碳二亞胺加入到上述混合溶液中，黑暗條件下反應(yīng)12.0 h后過(guò)濾，在濾液中緩慢加入I液，常溫下攪拌12.0 h后離心、干燥、研磨，所制備的納米顆粒命名為FA-CS@Fe-TiO2（1:1）。用同樣的方法制得FA-CS@Fe-TiO2（3:2）和FA-CS@Fe-TiO2（2:1）。

1.3.2 FA-CS@Fe-TiO2復(fù)合納米顆粒的表征手段

用掃描電子顯微鏡對(duì)CS@Fe-TiO2復(fù)合納米顆粒進(jìn)行成像分析，檢測(cè)樣品的分散性；用傅里葉紅外光譜（Fourier transformation infrared spectrum, FTIR）儀測(cè)量顆粒的成分 ；用X射線衍射（X-ray diffraction, XRD）儀檢測(cè)樣品的衍射峰，并根據(jù)衍射圖譜檢測(cè)樣品的組成 ；用熒光光譜（ fl uorescence spectre, FS）分析其激發(fā)、發(fā)射光譜范圍和強(qiáng)度等。

1.3.3 HL60細(xì)胞的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

將HL60細(xì)胞接種于完全RPMI-1640培養(yǎng)基中，再把整個(gè)培養(yǎng)基放入37℃、5%CO2、95%空氣濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后換液打散至細(xì)胞液均勻，取此細(xì)胞液與臺(tái)盼藍(lán)按1:1的體積比混合并迅速滴至細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，隨后將細(xì)胞計(jì)數(shù)板插入CountessTM型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)量滿足試驗(yàn)要求后，取此處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4 FA-CS@Fe-TiO2復(fù)合納米顆粒對(duì)HL60細(xì)胞的暗毒性試驗(yàn)及PDT試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)內(nèi)容規(guī)劃96孔培養(yǎng)板，分為非光照組和光照組。非光照組包括遮光板（A板、C板），光照組包括光照板（B板、D板），每個(gè)板均設(shè)置對(duì)照組和試驗(yàn)組。為了減少試驗(yàn)誤差，同一條件下均設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期濃度為3.5×105個(gè)/mL的HL60細(xì)胞接種到已規(guī)劃好的96孔板中，對(duì)照組和試驗(yàn)組每孔均接種100 μL的細(xì)胞液；接著在試驗(yàn)組中加入終值質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、80、160 μg/mL的TiO2、Fe-TiO2、CS、CS@Fe-TiO2、FA-CS@Fe-TiO2溶液各100 μL，而對(duì)照組中每孔各加入100 μL血清含量為10%的RPMI-1640培養(yǎng)液，隨后把96孔板放到微量震蕩儀中震蕩3 min，再用無(wú)水乙醇擦拭96孔板消毒后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，光照板（B、D板）培養(yǎng)12.0 h后置入波長(zhǎng)為 410 nm、光功率為5 mW/cm2的光動(dòng)力輻照室中光照1.0 h再繼續(xù)培養(yǎng)；而遮光板（A、C板）則連續(xù)避光培養(yǎng)12.0 h。然后每孔均加入20 μL的CCK-8試劑［15］，震蕩均勻后用無(wú)水乙醇擦拭消毒，置入培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)3.0 h。使用酶標(biāo)儀對(duì)上述的試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行細(xì)胞活性的吸光度檢測(cè)，設(shè)定450 nm為測(cè)量波長(zhǎng)，630 nm為參比波長(zhǎng)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)主要采用Origin8、Mathtype、SPSS11.5軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合納米顆粒FA-CS@Fe-TiO2的表征

2.1.1 SEM成像分析

圖1 TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2納米顆粒的SEM圖Fig. 1 SEM images of TiO2, Fe-TiO2, CS@Fe-TiO2 nanoparticles（a）TiO2納米顆粒SEM圖 ；（b）Fe-TiO2納米顆粒SEM圖 ；（c）CS@Fe-TiO2納米顆粒SEM圖。(a) SEM image of TiO2 nanoparticles； (b) SEM image of Fe-TiO2 nanoparticles； (c) SEM image of CS@Fe-TiO2 nanoparticles.

采用掃描電子顯微鏡對(duì)樣品的表面形貌進(jìn)行觀察。如圖1所示分別為TiO2、Fe-TiO2和CS@Fe-TiO2納米顆粒的SEM圖像。由圖1a、1b可知，F(xiàn)e的摻雜可以很好地改善TiO2的團(tuán)聚現(xiàn)象，但Fe摻雜后的納米顆粒較大。而由圖1c可知，經(jīng)CS的包裹后，納米顆粒的外觀形貌發(fā)生了改變，在更高的放大倍率下，可見(jiàn)納米化的CS@Fe-TiO2結(jié)構(gòu)致密，成橢球形或扁球形顆粒，雖然存在少數(shù)小的聚集體，但其粒徑大約在30～50 nm之間，細(xì)胞仍能攝?。?，13］。

2.1.2 XRD分析

如圖2所示，由曲線a可知，在2θ為25.38°、37.85°、48.13°、53.96°、55.18°、62.79°、68.86°、75.40°等處出現(xiàn)了分別對(duì)應(yīng)銳鈦礦（101）、（004）、（200）、（105）、（211）、（204）、（116）、（215）晶面的衍射峰；由曲線f可知，在2θ=10.62°、19.88°處出現(xiàn)了純CS的2個(gè)主要特征峰，在29.60°、35.88°和40.10°附近呈現(xiàn)出小的額外峰值，這種類似的結(jié)果與Zhu等［16］的研究結(jié)果一致。此外可看出，曲線c、d、e的衍射峰值除了與TiO2材料的銳鈦礦相相關(guān)外，在2θ=10.62°處還出現(xiàn)了屬于CS的特征峰。因此，XRD結(jié)果證實(shí)了CS@Fe-TiO2納米復(fù)合材料體系的形成。

圖2 TiO2、CS@Fe-TiO2納米顆粒的X射線衍射譜Fig. 2 XRD patterns of TiO2, CS@Fe-TiO2 nanoparticles

2.1.3 傅里葉紅外光譜分析

圖3為各納米顆粒的傅里葉紅外光譜圖。在圖3a中，曲線（1）、（2）均在804.00 cm-1左右出現(xiàn)了Ti-O鍵相對(duì)應(yīng)的特征峰，但曲線（2）中Ti-O鍵的伸縮振動(dòng)峰明顯減弱，說(shuō)明Fe已取代Ti成功地?fù)饺隩iO2內(nèi)部。曲線（3）為純CS的光譜圖，在1 592.32 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為氨基的振動(dòng)峰，在1 061.98 cm-1和1 150.79 cm-1處分別出現(xiàn)了歸因于N-H的伸縮振動(dòng)峰和-OH的伸縮振動(dòng)峰，并且在3 360.95 cm-1和2 871.75 cm-1處出現(xiàn)了屬于羥基和C-H基團(tuán)的振動(dòng)峰［17-18］。通過(guò)對(duì)曲線（4）的紅外光譜分析可知，復(fù)合納米顆粒中的C-O、氨基和羥基的伸縮振動(dòng)與CS的官能團(tuán)一致，表明CS生物大分子包裹了納米顆粒Fe-TiO2［19］。

如圖3b所示，曲線（1）在2 925.00～3 545.00 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰，表示FA中出現(xiàn)了蝶呤環(huán)的-NH....H伸縮振動(dòng)峰以及谷氨酸的-OH伸縮振動(dòng)峰。在1 694.00 cm-1和 1 640.00 cm-1處出現(xiàn)了歸因于谷氨酸中-COOH基團(tuán)的C=O和-CO-NH-中C=O的伸縮振動(dòng)峰。此外，在1 485.00 cm-1與 1 414.00 cm-1處還顯示出苯環(huán)的伸縮振動(dòng)峰和苯酚-OH的振動(dòng)吸收峰［20］。曲線（2）是NHS-FA的紅外光譜圖，在1 201.00 cm-1和1 068.00 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰值代表C-O和N-O的伸縮振動(dòng)峰。而在1 729.00 cm-1處出現(xiàn)了新的振動(dòng)吸收峰，其原因?yàn)榱u基琥珀酰亞胺中苯環(huán)上的-OH的分裂并與FA的C=O連接形成了琥珀酰亞胺酯。對(duì)比曲線（2）、（3）、（4）可知，NHS-FA與CS@Fe-TiO2在1 400.00 cm-1處均出現(xiàn)了表示-C-O的特征峰。值得注意的是NHS-FA在1 206.34 cm-1的吸收峰即NHS酯上的羰基峰，在修飾后的納米顆粒FA-CS@Fe-TiO2上消失了，說(shuō)明FA活性酯有了明顯的變化。而FA-CS@Fe-TiO2的圖譜中出現(xiàn)了FA的δC-H特征峰和酰胺鍵υC=O特征峰，說(shuō)明FA與CS@Fe-TiO2已成功連接上。

2.1.4 紫外-可見(jiàn)光（UV-Vis）吸收光譜和光源分析

通過(guò)測(cè)試得TiO2、Fe-TiO2和CS@Fe-TiO2的紫外-可見(jiàn)吸收光譜（ultraviolet and visible spectroscopy, UVVis）如圖4a所示，TiO2的吸收光譜主要位于390 nm以下且吸收峰不強(qiáng)，但經(jīng)過(guò)Fe與CS的摻雜后，可以看出CS@Fe-TiO2在410～420 nm UV-Vis范圍內(nèi)吸收明顯增強(qiáng)，說(shuō)明TiO2的團(tuán)聚會(huì)影響其對(duì)光的吸收，而Fe、CS的摻雜能有效提高TiO2在紫外-可見(jiàn)光照下的光催化活性，且隨著CS含量的增加，吸收光譜發(fā)生紅移的現(xiàn)象越來(lái)越明顯。圖4b是本實(shí)驗(yàn)室所使用的光動(dòng)力試驗(yàn)光源（light emitting diode, LED）的發(fā)射光譜，其發(fā)射峰為410.17 nm，滿足可見(jiàn)光激發(fā)此納米材料的條件，能有效發(fā)生光催化反應(yīng)。

2.2 復(fù)合納米顆粒對(duì)HL60細(xì)胞的暗毒性試驗(yàn)

圖3 不同納米顆粒的傅里葉紅外光譜Fig. 3 FTIR of different nanoparticles（a）TiO2、Fe-TiO2、CS、CS@Fe-TiO2 納米顆粒的FTIR圖 ；（b）CS@Fe-TiO2、FA、NHS-FA、FA-CS@Fe-TiO2納米顆粒的FTIR圖。(a) FTIR of TiO2, Fe-TiO2, CS, CS@Fe-TiO2 nanoparticles； (b) FTIR of CS@Fe-TiO2, FA, NHS-FA, FA-CS@Fe-TiO2 nanoparticles.

圖4 納米顆粒的UV-vis吸收光譜與光動(dòng)力試驗(yàn)箱LED陣列的發(fā)射光譜Fig. 4 UV-vis spectrum of nanoparticles and emission spectrum of LED arrays of PDT irradiation chamber（a）納米顆粒的UV-vis吸收光譜；（b）光動(dòng)力試驗(yàn)箱LED陣列的發(fā)射光譜。(a) UV-vis spectrum of nanoparticles； (b) Emission spectrum of LED arrays of PDT irradiation chamber.

圖5分別為非光照條件下TiO2、Fe-TiO2、CS以及不同質(zhì)量比的CS@Fe-TiO2和FA-CS@Fe-TiO2復(fù)合納米顆粒對(duì)HL60細(xì)胞相對(duì)存活率的影響。結(jié)果表明，CS本身對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，且在低質(zhì)量濃度5 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)還有一定的促進(jìn)作用；而隨著 TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2、FA-CS@Fe-TiO2離子質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞的相對(duì)存活率逐漸降低，即各納米材料對(duì)細(xì)胞的暗毒性隨其質(zhì)量濃度的升高逐漸增強(qiáng)。但相對(duì)于Fe-TiO2和FA-CS@Fe-TiO2的暗毒性，CS@Fe-TiO2的暗毒性降低更明顯，細(xì)胞的相對(duì)存活率整體偏高，即使在160 μg/mL的高質(zhì)量濃度作用下，與CS@Fe-TiO2（3:2）共孵育的HL60細(xì)胞其相對(duì)存活率仍可高達(dá)85%，另外CS@Fe-TiO2（1:1）和CS@Fe-TiO2（2:1）的相對(duì)存活率分別為80%、83%，這表明CS的包裹能改善金屬Fe摻雜帶來(lái)的毒副作用，從而顯著提高復(fù)合納米顆粒的生物相容性。

2.3 復(fù)合納米顆粒對(duì)HL60細(xì)胞的PDT體外滅活試驗(yàn)

PDT效率的計(jì)算公式：

式中EfficiencyPDT為PDT效率；ODirradiation為光照組的OD值；ODwithout-irradiation為遮光組的OD值。

圖5 暗室條件下經(jīng)不同納米顆粒作用后HL60細(xì)胞的相對(duì)存活率Fig. 5 Relative survival rate of HL60 cells in dark room after different nanoparticles（a）不同質(zhì)量濃度TiO2、Fe-TiO2、CS對(duì)HL60細(xì)胞的暗毒性分析（P＜0.05）；（b）不同質(zhì)量濃度CS@Fe-TiO2對(duì)HL60細(xì)胞的暗毒性分析（P＜0.05）；（c）不同質(zhì)量濃度FA-CS@Fe-TiO2對(duì)HL60細(xì)胞的暗毒性分析（P＜0.05）。(a) Dark toxicity analysis of different mass concentrations of TiO2, Fe-TiO2, CS on HL60 cells (P＜0.05)； (b) Dark toxicity analysis of different mass concentrations of CS@Fe-TiO2 on HL60 cells (P＜0.05)； (c) Dark toxicity analysis of different mass concentrations of FA-CS@Fe-TiO2 on HL60 cells (P＜0.05).

由圖5b、5c的暗毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，HL60細(xì)胞與未用FA修飾的CS@Fe-TiO2納米顆粒和FA修飾后的CS@Fe-TiO2納米顆粒共孵育后，后者細(xì)胞的相對(duì)存活率較前者細(xì)胞的相對(duì)存活率降低了7%左右。在光照劑量為18 J/cm2、波長(zhǎng)為410 nm的光源下進(jìn)行PDT之后，HL60細(xì)胞的相對(duì)存活率明顯低于之前的遮光組。如圖6a、6b可知，當(dāng)光照條件一樣時(shí)，同一質(zhì)量濃度不同納米顆粒作用下的HL60細(xì)胞的相對(duì)存活率依次為：FA-CS@Fe-TiO2（3:2）＜FACS@Fe-TiO2（2:1）＜FA-CS@Fe-TiO2（1:1）＜CS@Fe-TiO2（3:2）＜CS@Fe-TiO2（2:1）＜CS@Fe-TiO2（1:1）＜Fe-TiO2＜TiO2，且FA-CS@Fe-TiO2作用后的細(xì)胞相對(duì)存活率較CS@Fe-TiO2作用后的細(xì)胞相對(duì)存活率降低了19%左右。由此可知FA-CS@Fe-TiO2納米顆粒的暗毒性和光催化過(guò)程均能殺傷滅活HL60細(xì)胞，而在PDT試驗(yàn)中FA-CS@Fe-TiO2的靶向光催化滅活占主要地位。由圖6c可知，隨著各納米顆粒質(zhì)量濃度的升高，其PDT滅活HL60細(xì)胞的效率逐漸增強(qiáng)，并且經(jīng)過(guò)Fe摻雜、CS包裹的復(fù)合納米顆粒的PDT效率均不同程度地高于純TiO2，說(shuō)明Fe的摻雜以及CS的包裹可以不同程度地提高TiO2的光催化活性，從而提高PDT的滅活效率。另外在質(zhì)量濃度大于80 μg/mL后，PDT效率的上升趨勢(shì)變緩，這可能是由于納米顆粒的質(zhì)量濃度偏高，HL60細(xì)胞對(duì)納米顆粒的吸收已達(dá)到飽和，影響了細(xì)胞的攝取。此外還可看出，CS@Fe-TiO2（3:2）的整體PDT效率要高于另外2種不同比例的CS@Fe-TiO2納米材料，其PDT效率最高可達(dá)55.18%。其原因可能是：適量的CS包裹有利于提高復(fù)合納米顆粒的光催化活性；少量的CS包裹使得復(fù)合納米顆粒所含氨基、羥基的數(shù)量有限，因而光催化效果不佳；而過(guò)量的CS會(huì)導(dǎo)致復(fù)合納米顆粒的凝聚，從而影響其分散性，使得光照射到的面積有限。

由圖6d可知，F(xiàn)A-CS@Fe-TiO2的PDT滅活效率要遠(yuǎn)高于TiO2的PDT滅活效率，且隨著粒子質(zhì)量濃度的升高，F(xiàn)A-CS@Fe-TiO2的PDT滅活效率也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為160 μg/mL時(shí)，F(xiàn)A-CS@Fe-TiO2（3:2）納米顆粒的PDT滅活效率達(dá)到78.75%，比同質(zhì)量濃度未用FA修飾的CS@Fe-TiO2（3:2）增加了23.57%，說(shuō)明FA的修飾能使復(fù)合納米顆粒對(duì)HL60細(xì)胞具有良好的靶向性，能增強(qiáng)其滅活效果。

圖6 不同質(zhì)量濃度納米顆粒對(duì)HL60細(xì)胞的活性影響以及PDT滅活效率Fig. 6 Effect of nanoparticles of different concentrations on HL60 cell activity and PDT inactivation efficiency（a）不同質(zhì)量濃度TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2處理的HL60細(xì)胞在光照下的細(xì)胞存活率（P＜0.05）；（b）不同質(zhì)量濃度TiO2、FA-CS@Fe-TiO2處理的HL60細(xì)胞在光照下的細(xì)胞存活率（P＜0.05）；（c）不同質(zhì)量濃度TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2對(duì)HL60細(xì)胞的PDT滅活效率（P＜0.05）；（d）不同質(zhì)量濃度TiO2、FA-CS@Fe-TiO2對(duì)HL60細(xì)胞的PDT滅活效率（P＜0.05）。(a) Cell survival rate of HL60 cells treated with different mass concentrations of TiO2, Fe-TiO2, CS@Fe-TiO2 under light (P＜0.05)； (b) Cell survival rate of HL60 cells treated with different mass concentrations of TiO2, FA-CS@Fe-TiO2 under light (P＜0.05)； (c) PDT ef ficiency of HL60 cells with different mass concentrations of TiO2, Fe-TiO2, CS@Fe-TiO2 (P＜0.05)； (d) PDT ef ficiency of HL60 cells with different mass concentrations of TiO2, FA-CS@Fe-TiO2 (P＜0.05).

2.4 FA-CS@Fe-TiO2納米顆粒PDT體外滅活HL60細(xì)胞的機(jī)理分析

2.4.1 FS分析

本試驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)試了TiO2、Fe-TiO2和不同質(zhì)量比的CS@Fe-TiO2納米顆粒的熒光發(fā)射光譜，試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。從圖7中可知，TiO2在摻雜Fe、CS之后，其熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了明顯的變化。對(duì)比單純的TiO2，F(xiàn)e-TiO2及不同比例的CS@Fe-TiO2的熒光發(fā)射強(qiáng)度均有不同程度的降低，且CS@Fe-TiO2（3:2）的熒光強(qiáng)度最低。相關(guān)研究表明，半導(dǎo)體顆粒的光致發(fā)射光譜是由其內(nèi)部電子-空穴的復(fù)合所引起的，其熒光強(qiáng)弱的變化與在適當(dāng)波長(zhǎng)激發(fā)下的顆粒內(nèi)部載流子電荷的轉(zhuǎn)化、遷移和捕獲效率相一致，電子-空穴復(fù)合率越高則熒光強(qiáng)度越強(qiáng)［21-22］。由此可知，410 nm光照下，F(xiàn)e、CS與TiO2之間發(fā)生了有效的電子轉(zhuǎn)移，使其空穴電子的復(fù)合率明顯降低。其中CS@Fe-TiO2（3:2）的熒光強(qiáng)度減弱程度最大，表明電子-空穴的復(fù)合率越低，可參與吸收轉(zhuǎn)移光子能量的粒子越多、光催化效果越好。

圖7 不同納米顆粒的熒光發(fā)射光譜（λex = 410 nm）Fig. 7 Fluorescence emission spectra of different nanoparticles(λex = 410 nm)

2.4.2 FA-CS@Fe-TiO2復(fù)合納米顆粒介導(dǎo)的PDT試驗(yàn)過(guò)程中活性氧（ROS）的檢測(cè)

在PDT中，活性氧（reactive oxygen species, ROS）是造成細(xì)胞損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要媒介［23］，因此光照后在細(xì)胞內(nèi)部導(dǎo)致的ROS產(chǎn)量已經(jīng)成為評(píng)價(jià)光敏劑性能的一個(gè)重要指標(biāo)。圖8為TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2和FA-CS@Fe-TiO2介導(dǎo)的PDT過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光光譜圖。從圖8中可得，ROS（TiO2）＜ROS（Fe-TiO2）＜ROS（CS@Fe-TiO2）＜ROS（FA-CS@Fe-TiO2），顯然摻雜后的TiO2能產(chǎn)生更多的ROS。分析可知，當(dāng)光輻射到復(fù)合納米顆粒表面時(shí)，其價(jià)帶電子吸收光子的能量躍遷到導(dǎo)帶，因而在價(jià)帶中產(chǎn)生空穴。導(dǎo)帶電子和價(jià)帶空穴與細(xì)胞內(nèi)的氧分子、水分子分別發(fā)生氧化和還原反應(yīng)，而兩者均能產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，如超氧陰離子自由基（O2·-）、羥基自由基（OH·）等。通過(guò)Fe、CS摻雜后，復(fù)合納米顆粒中氨基、羥基有效地抑制了其電子-空穴的復(fù)合，促進(jìn)了光催化過(guò)程中的氧化還原反應(yīng)，因而產(chǎn)生了更多的活性氧物質(zhì)。其氧化反應(yīng)方程式如下：

此外，經(jīng)FA修飾后，復(fù)合納米顆粒對(duì)HL60細(xì)胞具有靶向性，因而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)參與光動(dòng)力反應(yīng)的納米顆粒不斷增多，PDT過(guò)程中介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS含量也不斷增加。

圖8 PDT作用后HL60細(xì)胞中ROS探針的熒光光譜（λex = 485 nm）Fig. 8 Fluorescence spectra of ROS probe in HL60 cells after PDT for 485 nm

2.4.3 細(xì)胞內(nèi)攝取納米顆粒的熒光強(qiáng)度分析

如圖9所示，曲線（1）表示細(xì)胞內(nèi)CS@Fe-TiO2所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，曲線（2）表示細(xì)胞內(nèi)FA-CS@Fe-TiO2所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。與CS@Fe-TiO2相比，F(xiàn)ACS@Fe-TiO2的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，即表明被細(xì)胞攝取參與到細(xì)胞活化反應(yīng)的FA-CS@Fe-TiO2納米顆粒遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于CS@Fe-TiO2，說(shuō)明了FA的修飾可以增強(qiáng)納米顆粒的靶向性，顯著提高細(xì)胞對(duì)復(fù)合納米顆粒的攝取效率，從而提高PDT滅活效率，因此起到了較好的修飾效果。這與前面FA-CS@Fe-TiO2的PDT效率高于CS@Fe-TiO2的PDT效率相一致。

圖9 細(xì)胞攝取不同納米顆粒的熒光光譜Fig. 9 Fluorescence spectrum of cells taking up different nanoparticles

3 討論

本文主要研究了TiO2改性后形成的復(fù)合納米顆粒FA-CS@Fe-TiO2對(duì)HL60細(xì)胞的PDT滅活作用。采用溶膠凝膠法、離子交聯(lián)法、表面修飾等方法制備了FA-CS@Fe-TiO2復(fù)合納米顆粒。SEM圖像表明Fe的摻雜能有效提高納米顆粒的分散性。紫外-可見(jiàn)光譜表明，F(xiàn)e摻雜后納米顆粒的吸收邊明顯紅移。通過(guò)傅里葉紅外光譜圖對(duì)不同納米顆粒所含基團(tuán)的振動(dòng)吸收峰進(jìn)行對(duì)比可知，F(xiàn)A與CS@Fe-TiO2已連接成功，使得復(fù)合納米顆粒對(duì)HL60細(xì)胞具有良好的靶向性，有效地提高了FA-CS@Fe-TiO2的PDT體外滅活HL60細(xì)胞的效率。細(xì)胞試驗(yàn)表明，暗室條件下TiO2、Fe-TiO2均有較低的毒性，而低質(zhì)量濃度的CS能促進(jìn)HL60細(xì)胞的生長(zhǎng)，可能是因?yàn)榈唾|(zhì)量濃度的CS能夠在生物體內(nèi)降解。此外Fe-TiO2被CS包裹后也具有較好的生物相容性。在PDT中，當(dāng)光照射光敏劑時(shí)，光敏劑能吸收光子的能量從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，隨后將吸收的能量轉(zhuǎn)移到附近的氧氣分子上產(chǎn)生單線態(tài)氧，或者與周圍的物質(zhì)通過(guò)電子轉(zhuǎn)移發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)［24-25］?；钚匝跷镔|(zhì)能與細(xì)胞生物膜、各種亞細(xì)胞器以及細(xì)胞內(nèi)大分子（例如蛋白質(zhì)、核酸等）發(fā)生反應(yīng)，加快機(jī)體衰老，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死或凋亡。本文的PDT試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)A-CS@Fe-TiO2整體的PDT滅活效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TiO2、CS@Fe-TiO2，且隨著納米粒子質(zhì)量濃度的升高，F(xiàn)A-CS@Fe-TiO2的PDT滅活效率也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為160 μg/mL時(shí)，F(xiàn)A-CS@Fe-TiO2（3:2）納米顆粒的PDT滅活效率達(dá)到78.75%，比同質(zhì)量濃度未用FA修飾的CS@Fe-TiO2（3:2）增加了23.57%，比同質(zhì)量濃度的TiO2增加了54.75%。分析其原因可知：Fe和CS的摻雜能有效地抑制TiO2中電子和空穴的復(fù)合，從而提高復(fù)合納米顆粒的光催化活性，在PDT過(guò)程中產(chǎn)生更多的活性氧物質(zhì)。而FA的修飾增強(qiáng)了復(fù)合納米顆粒與HL60細(xì)胞的特異性結(jié)合，進(jìn)一步提高了FA-CS@Fe-TiO2對(duì)HL60細(xì)胞的滅活效率。因此，F(xiàn)A-CS@Fe-TiO2有望成為一種用于靶向治療腫瘤細(xì)胞的新型光敏劑。