哈依努爾,梁旭俊,李茂玉,邵美英,付 瑩*,陳 林,陳主初

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤科國家衛(wèi)健委蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室抗癌藥物國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室國家老年醫(yī)學(xué)臨床研究中心,中國湖南 長沙 410008;2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科,中國新疆烏魯木齊 830000)

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第8位,死亡率位居腫瘤相關(guān)死因第6位[1]。中國是食管癌高發(fā)國家,每年新發(fā)病例數(shù)約占全球新發(fā)病例的50%,是世界上食管癌新發(fā)病例數(shù)最多的國家[2]。目前早期食管癌以手術(shù)治療為主,但是大部分患者在確診時(shí)已進(jìn)入中晚期,預(yù)后較差,其5年生存率僅為20%左右[3]。因此,尋找有效的分子靶向藥物可為食管癌的治療提供新的思路,具有重要的臨床意義。

食管癌的分子靶向治療已進(jìn)行多個(gè)靶點(diǎn)的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)[4～6]。其中,非受體酪氨酸激酶Src在多種腫瘤細(xì)胞中高度活化或過表達(dá),能持續(xù)激活Ras/MEK、PI3K/AKT、JAK/STAT 等下游信號(hào)傳導(dǎo)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移,抑制其凋亡,是食管癌等腫瘤治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)[7]。臨床試驗(yàn)證實(shí),針對(duì)Src激酶的多種小分子抑制劑在多種腫瘤中取得了良好療效,而且這些小分子抑制劑除了作用于Src外,一般還有其他有效靶點(diǎn)[8～9]。研究顯示,Src/Abl雙效抑制劑達(dá)沙替尼在腫瘤細(xì)胞中除了抑制Src和Bcr-Abl外,還能有效抑制c-KIT、血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)等激酶的活化[10]。博舒替尼(bosutinib,SKI-606)是一種新型的雙重Src/Abl激酶抑制劑,2012年被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn),適用于慢性、加速或急變期慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)患者的治療[11],研究證明它能同時(shí)阻止多種腫瘤細(xì)胞中Src和Abl激酶的磷酸化,具有高效的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性[12～15],但是除了Src/Abl外,博舒替尼是否還有其他有效作用靶點(diǎn)尚不清楚。我們先前的研究證實(shí)博舒替尼顯著抑制人食管癌細(xì)胞Eca-109和KYSE450的增殖,促進(jìn)其凋亡,并且抑制Src、c-Abl及其下游信號(hào)通路的激活[16],因此本研究在此基礎(chǔ)上采用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法,探究博舒替尼作用于食管癌細(xì)胞的潛在作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與藥物

人食管癌細(xì)胞Eca-109購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng);博舒替尼(純度＞99%)購自美國Selleck公司,實(shí)驗(yàn)前用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解配制成濃度為20 mmol/L的貯存液,避光保存于-20℃。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)胞培養(yǎng)所用RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS及iTRAQ標(biāo)簽試劑、Bradford定量試劑盒、蛋白質(zhì)上樣緩沖液購自美國Thermo公司;尿素、硫脲、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate,SDS)、甘氨酸、過硫酸銨、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、TEAB(triethylammonium bicarbonate)和Tris購自美國GE Healthcare公司;蛋白酶抑制劑cocktail和磷酸酶抑制劑購自瑞士Roche公司;DMSO、碳酸氫銨、碘乙酰胺、胰蛋白酶、乙腈(acetonitrile,ACN)、異丙醇、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)和甲酸(formic acid,FA)購自美國Sigma公司。UltiMate 3000 UHPLC、Q-Exactive HF X 質(zhì)譜儀、High PH RP離心柱、C18色譜柱、Multiskcan FC酶標(biāo)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱均為美國Thermo公司產(chǎn)品;低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 5430R)為德國Eppendorf公司產(chǎn)品;數(shù)據(jù)分析軟件Proteome Discoverer為美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.3 主要方法

1.3.1 細(xì)胞處理

將對(duì)數(shù)生長期的Eca-109細(xì)胞分為兩組,根據(jù)博舒替尼抑制食管癌細(xì)胞生長的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[16],實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5 μmol/L的博舒替尼,對(duì)照組加入等體積的DMSO,置于CO2培養(yǎng)箱中處理4 h。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取與酶解

收集細(xì)胞于1.5 mL離心管,加入預(yù)冷的含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液,置于冰上5 min;加入終濃度為10 mmol/L的DTT,用超聲破碎儀冰浴超聲2 min,在4℃條件下25 000g離心15 min;取上清并加入終濃度為10 mmol/L的DTT,56℃水浴1 h,冷卻至室溫后加入終濃度為55 mmol/L的碘乙酰胺,避光放置45 min,最后在4℃條件下25 000g離心10 min,收集的上清即為總蛋白質(zhì)。用Bradford方法對(duì)收集的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,取100 μg蛋白質(zhì)按胰蛋白酶∶蛋白質(zhì)=1∶20的比例加入胰酶,渦旋振蕩后低速離心1 min,隨后37℃水浴2 h,消化后的肽段進(jìn)行除鹽操作,然后將得到的肽段液冷凍抽干。

1.3.3 肽段標(biāo)記、富集與分離

用0.5 mol/L TEAB溶解肽段樣品,加入i-TRAQ標(biāo)簽試劑,室溫靜置2 h,用C18萃取柱脫鹽并抽干;以樣品∶TiO2=1∶4稱取TiO2,加入1 mL蛋白質(zhì)上樣緩沖液,室溫振蕩10 min,然后加入抽干的肽段,于37℃條件下1 100 r/min振蕩1 h;12 000g離心30 s后保留沉淀,加入1～2 mL上樣緩沖液,室溫圓盤翻轉(zhuǎn)5 min,12 000g離心30 s后棄上清,然后加入洗滌液洗4次,最后加入洗脫液洗脫,收集上清并抽干。用300 μL 0.1%的TFA復(fù)溶抽干的肽段,采用High PH RP小柱進(jìn)行組分分離,最后合并樣品得到6個(gè)組分,冷凍抽干。

1.3.4 高效液相色譜分離及質(zhì)譜檢測(cè)

將抽干的肽段樣品用流動(dòng)相A(2%ACN,0.1%FA)復(fù)溶,20 000g離心10 min后,取上清進(jìn)樣。通過UltiMate 3000 UHPLC進(jìn)行分離,樣品首先進(jìn)入trap柱富集并除鹽,隨后與自裝C18柱(75 μm內(nèi)徑, 粒徑＞3 μm 柱料,25 μm 柱長)串聯(lián), 以300 nL/min流速通過如下有效梯度:0～5 min,5%流動(dòng)相B(98%ACN,0.1%FA);5～45 min,流動(dòng)相B從5%線性升至25%;45～50 min,流動(dòng)相B從25%升至35%;50～52 min,流動(dòng)相B從35%升至80%;52～54 min,80%流動(dòng)相B;54～60 min,5%流動(dòng)相B。納升液相分離末端直接連接質(zhì)譜儀。經(jīng)液相分離的肽段通過nanoESI源離子化后進(jìn)入到串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-Exactive HF X進(jìn)行DDA(data-dependent acquisition)模式檢測(cè)。主要參數(shù):離子源電壓設(shè)置為1.9 kV;一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍(m/z)為350～1 500,分辨率設(shè)置為60 000;二級(jí)質(zhì)譜起始m/z固定為100,分辨率為15 000。二級(jí)碎裂的母離子篩選條件:電荷2+到6+,峰強(qiáng)度超過10 000的強(qiáng)度排在前20的母離子。離子碎裂模式為HCD,碎片離子在Orbitrap中進(jìn)行檢測(cè)。動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)定為30 s。AGC設(shè)置:一級(jí)為3.0E+06,二級(jí)為1.0E+05。

1.3.5 磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定與定量

利用Proteome Discoverer 1.4軟件將質(zhì)譜產(chǎn)生的原始圖譜文件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換,并通過Mascot 2.3對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索,數(shù)據(jù)庫為人蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫human UniProt(20356 sequence)。搜索參數(shù)設(shè)置如下:酶切方式為胰蛋白酶,最大允許兩個(gè)漏切位點(diǎn),固定修飾為半胱氨酸烷基化,可變修飾為甲硫氨酸的氧化、蛋白質(zhì)N端的乙?；?、脫酰胺化以及絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化,母離子容忍度為2.0E-05,碎片離子容忍度為0.05 Da。利用Percolator對(duì)Mascot搜索的結(jié)果進(jìn)行再處理,以圖譜的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)≤0.05過濾得到可信的肽段。利用Proteome Discoverer整合的phosphoRS對(duì)鑒定到的磷酸化肽段進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)打分,以phosphoRS probability≥0.75[17]過濾得到可信的磷酸化位點(diǎn)。

1.3.6 磷酸化蛋白質(zhì)組結(jié)果的生物信息學(xué)分析

用clusterProfile軟件包[18]對(duì)差異磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行GO(Gene Ontology)富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路富集。在蛋白激酶的活性預(yù)測(cè)中,用KinSwingR軟件包[19]從PhosphoSitePlus數(shù)據(jù)庫[20]得到已知的355種蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)周圍的氨基酸殘基位置權(quán)重矩陣,之后使用位置權(quán)重矩陣在差異磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中搜索能夠顯著匹配的磷酸化肽段,并根據(jù)與特定蛋白激酶的位置權(quán)重矩陣相匹配的磷酸化肽段的磷酸化升高或降低來定義蛋白激酶的KS score(KinSwingR Z-score),通過KS score預(yù)測(cè)蛋白激酶的活性。

在繪制博舒替尼作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中,首先,將差異磷酸化蛋白質(zhì)和KinSwingR預(yù)測(cè)的活性顯著變化的蛋白激酶作為輸入因子,從STRING數(shù)據(jù)庫得到這些蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)[21];其次,使用Cytoscape軟件中的ClusterOne插件識(shí)別蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中的模塊[22];最后,使用BiNGO插件對(duì)模塊涉及的生物過程進(jìn)行富集[23],用Cytoscape 3.2.1軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 磷酸化蛋白質(zhì)組鑒定

采用iTRAQ定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法分別對(duì)博舒替尼和DMSO處理的人食管癌細(xì)胞Eca-109中的磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行鑒定,結(jié)果如表1:在2 741個(gè)蛋白質(zhì)上共鑒定到11 335條磷酸化肽段和 7 940個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中1 272個(gè)蛋白質(zhì)只鑒定到1個(gè)磷酸化位點(diǎn),534個(gè)蛋白質(zhì)鑒定到兩個(gè)磷酸化位點(diǎn),305個(gè)蛋白質(zhì)鑒定到6個(gè)及以上磷酸化位點(diǎn)(圖1A);在鑒定到的7 940個(gè)磷酸化位點(diǎn)中,85.45%為絲氨酸(S),13.64%為蘇氨酸(T),0.91%為酪氨酸(Y)(圖1B)。

2.2 差異磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析

以博舒替尼處理的人食管癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,DMSO處理組作為對(duì)照組,取兩組數(shù)據(jù)的比值進(jìn)行差異磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析。差異磷酸化肽段的篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)(fold change)≥1.5或≤0.667,同時(shí)P-value≤0.05,結(jié)果共篩選到182個(gè)差異磷酸化肽段,其中上調(diào)55個(gè),下調(diào)127個(gè)(圖2)。

表1 磷酸化蛋白質(zhì)組的鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 The statistics of phosphorylated proteome identification

圖1 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的鑒定結(jié)果(A)蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)數(shù)分布;(B)磷酸化修飾的氨基酸殘基分布,S代表絲氨酸,T代表蘇氨酸,Y代表酪氨酸。Fig.1 Identification results of protein phosphorylation sites(A)Distribution of phosphorylation sites on proteins;(B)Distribution of phosphorylated amino acid residues.S represents serine,T represents threonine,and Y represents tyrosine.

圖2 磷酸化肽段定量的火山圖紫色圓點(diǎn)代表下調(diào)的磷酸化肽段,橙色圓點(diǎn)代表上調(diào)的磷酸化肽段,灰色圓點(diǎn)代表無明顯變化的磷酸化肽段。Fig.2 Volcano plot showing quantification of phosphorylated peptide segmentsPurple dots represent down-regulated phosphorylated peptide segments,orange dots represent up-regulated phosphorylated peptide segments,and gray dots represent phosphorylated peptide segments with no significant change.

2.3 差異磷酸化蛋白質(zhì)的功能富集分析

采用clusterProfile軟件包對(duì)差異磷酸化蛋白質(zhì)涉及的生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組分(cellular component)進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果顯示:這些差異磷酸化蛋白質(zhì)主要位于細(xì)胞連接、胞外空間和肌動(dòng)蛋白骨架等位置,主要參與了mRNA代謝、細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞內(nèi)其他有機(jī)化合物的分解代謝等生物過程;其分子功能主要是結(jié)合RNA、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞黏附分子和鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體等(圖3)。

圖3 差異磷酸化蛋白質(zhì)的GO富集分析(前15位)(A)差異磷酸化蛋白質(zhì)參與的生物過程富集;(B)差異磷酸化蛋白質(zhì)的生物功能富集;(C)差異磷酸化蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位富集。在每個(gè)富集結(jié)果中,條形的大小代表富集的基因數(shù)量,顏色代表顯著性水平,藍(lán)色表示顯著性較低,紅色表示顯著性較高。Fig.3 GO enrichment analysis of the differentially phosphorylated proteins(top 15)(A)Biological processes involving differentially phosphorylated proteins;(B)Molecular functions of differentially phosphorylated proteins;(C)Cellular components of differentially phosphorylated proteins.For each term,the number of enriched genes is indicated by the bar size,while the P-value is represented by the color.Blue indicates a high P-value while red represents a low P-value.

2.4 博舒替尼對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和遷移相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響

對(duì)參與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移相關(guān)過程的差異磷酸化蛋白質(zhì)在博舒替尼處理組和對(duì)照組中的磷酸化水平進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示:在增殖相關(guān)的蛋白質(zhì)中,博舒替尼能夠顯著抑制核仁蛋白NOP2、SFRS蛋白激酶 2(SFRS protein kinase 2,SRPK2)等的磷酸化,促進(jìn)中心體蛋白131(centrosomal protein 131,CEP131)、JUN、核糖體蛋白 S6(ribosomal protein S6,RPS6)等的磷酸化;在凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)中,博舒替尼顯著抑制SRPK2、CD44等的磷酸化,促進(jìn)JUN、RPS6的磷酸化;在遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)中,博舒替尼顯著抑制CD44的磷酸化,促進(jìn)絲切蛋白1(cofilin 1,CFL1)等的磷酸化(圖 4)。

2.5 差異磷酸化蛋白質(zhì)的信號(hào)通路富集分析

對(duì)差異磷酸化蛋白質(zhì)參與的信號(hào)通路進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果如表2所示:富集的信號(hào)通路主要涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、核糖體相關(guān)的信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路和鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路。這一結(jié)果與生物過程的富集相似,且大部分核糖體相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化水平顯著下調(diào),提示博舒替尼可能通過影響轉(zhuǎn)錄和翻譯過程進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤作用。

圖4 博舒替尼對(duì)細(xì)胞功能相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響(A)博舒替尼對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響;(B)博舒替尼對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響;(C)博舒替尼對(duì)細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響。圖中顏色表示每個(gè)樣本中蛋白質(zhì)磷酸化水平的程度,紅色表示磷酸化水平較高,藍(lán)色表示磷酸化水平較低。Fig.4 Effect of bosutinib on phosphorylation levels of cell function-associated proteins(A)Effect of bosutinib on phosphorylation levels of cell proliferation-associated proteins;(B)Effect of bosutinib on phosphorylation levels of apoptosis-related proteins;(C)Effect of bosutinib on phosphorylation levels of cell migration-related proteins.The color indicates the level of protein phosphorylation in each sample,with red indicating higher levels of phosphorylation and blue indicating lower levels of phosphorylation.

2.6 博舒替尼對(duì)蛋白激酶活性影響的預(yù)測(cè)

采用KinSwingR軟件包、差異磷酸化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)以及已知的蛋白激酶和底物的關(guān)系對(duì)蛋白激酶的活性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果如圖5所示:cAMP依賴型蛋白激酶A催化亞基α(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha,PRKACA)、極光激酶B(aurora kinase B,AURKB)等激酶的活性顯著降低,而Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)的活性顯著升高,提示這些激酶可能是博舒替尼在食管癌中的潛在作用靶點(diǎn)。

表2 差異磷酸化肽段的KEGG富集結(jié)果(前15位)Table 2 KEGG enrichment of differentially phosphorylated peptides(top 15)

圖5 KinSwingR預(yù)測(cè)蛋白激酶的活性紅色圓點(diǎn)為活性升高的蛋白激酶,藍(lán)色圓點(diǎn)代表活性降低的蛋白激酶(P＜0.05)。Fig.5 The kinase activity predicted by KinSwingRRed dots are protein kinases with increased activity,and blue dots are protein kinases with decreased activity(P＜0.05).

2.7 博舒替尼作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析

為全面了解博舒替尼的作用靶點(diǎn),我們構(gòu)建了博舒替尼作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò),結(jié)果如圖6所示。博舒替尼作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)大致可以分為4個(gè)功能模塊,主要涉及細(xì)胞周期和分裂、細(xì)胞骨架組織、RNA轉(zhuǎn)錄和代謝、細(xì)胞凋亡和程序性死亡等生物過程,每個(gè)生物過程中包含的蛋白質(zhì)列于表3。這些模塊涉及的生物過程既有區(qū)別又相互聯(lián)系,展示了博舒替尼可能的分子機(jī)制整體圖景,其中GAPDH、RPS6和JUN在網(wǎng)絡(luò)中有最高的連接度,而RPS6和JUN是磷酸化差異較顯著的蛋白質(zhì),同時(shí)也與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)。

圖6 博舒替尼作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)涉及的生物學(xué)過程可以把該網(wǎng)絡(luò)分為4個(gè)模塊,分別用紅色、紫色、黃色和綠色的底色表示,每個(gè)模塊中包含的生物學(xué)過程列于旁側(cè)。紅色節(jié)點(diǎn)代表磷酸化水平上調(diào)的蛋白質(zhì),藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表磷酸化水平下調(diào)的蛋白質(zhì),綠色節(jié)點(diǎn)代表KinSwingR預(yù)測(cè)的活性顯著變化的蛋白激酶,灰色節(jié)點(diǎn)是STRING數(shù)據(jù)庫中與上述蛋白質(zhì)存在相互作用的蛋白質(zhì)。其中,連接度最高的3個(gè)蛋白質(zhì)GAPDH、RPS6和JUN用深紅色突出表示。Fig.6 Protein network of bosutinib actionThe network can be divided into four modules based on the biological processes involved in the proteins,indicated by red,purple,yellow,and green background colors.The biological processes in each module listed beside it.Red nodes represent proteins with up-regulated phosphorylation levels,blue nodes represent proteins with down-regulated phosphorylation levels,green nodes represent protein kinases with significant changes in activity as predicted by KinSwingR,and gray nodes are proteins that have interactions with the above proteins in the STRING database.The three most highly connected proteins,GAPDH,RPS6,and JUN,are highlighted in dark red.

表3 博舒替尼作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)模塊涉及的生物學(xué)過程及包含的蛋白質(zhì)Table 3 The related biological processes and proteins in each module of protein network of bosutinib action

3 討論

磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要形式之一,參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤發(fā)生等各種生理病理過程,而小分子激酶抑制劑一般是通過調(diào)節(jié)激酶的磷酸化調(diào)控相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路來發(fā)揮作用,因此通過蛋白質(zhì)磷酸化尋找潛在的靶標(biāo)及作用機(jī)制是小分子激酶抑制劑研究的重要策略之一。博舒替尼作為高選擇性小分子Src/Abl雙靶抑制劑,在前列腺癌中通過抑制AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,MAPK)、AKT的磷酸化及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogeneticprotein 2,BMP2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)的表達(dá)來抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[24];在乳腺癌中通過促進(jìn)細(xì)胞之間的黏附和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的膜轉(zhuǎn)運(yùn),抑制AKT、黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(prolinerich tyrosine kinase 2,Pyk2)的磷酸化,從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[25]。我們先前的研究證明博舒替尼可顯著抑制食管癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡[16],但其具體作用機(jī)制及靶點(diǎn)并不清楚。本研究對(duì)博舒替尼作用于食管癌細(xì)胞后磷酸化蛋白質(zhì)組的變化進(jìn)行檢測(cè)和分析,發(fā)現(xiàn)除了抑制Src、Abl外,博舒替尼還顯著影響 JUN、RPS6、CD44、SRPK2等蛋白質(zhì)的磷酸化(圖4),而這些差異磷酸化蛋白質(zhì)主要參與mRNA代謝、細(xì)胞骨架組織、鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)等重要生物學(xué)過程(圖3),其中JUN、RPS6被鑒定到有多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化發(fā)生變化。大量研究證明,JUN的磷酸化在腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過程中扮演了重要的角色[26～27],一方面JUN的磷酸化影響了其DNA結(jié)合能力,另一方面影響了其轉(zhuǎn)錄激活能力[28];同時(shí)也有研究證明,JUN的磷酸化與Abl的激酶活性密切相關(guān),它們之間存在互相激活的循環(huán)[29]。RPS6作為核糖體蛋白在正常生理過程中發(fā)揮重要作用,同時(shí)作為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路下游重要分子,參與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過程[30]。在本研究中,博舒替尼作用引起食管癌細(xì)胞RPS6蛋白的S241、S244、S246位點(diǎn)的磷酸化水平發(fā)生顯著變化,因此其可能是通過mTOR信號(hào)通路發(fā)揮作用,而且在博舒替尼作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中,JUN和RPS6也有較高的連接度(圖6),這些結(jié)果都提示JUN和RPS6可能是博舒替尼的潛在作用靶點(diǎn)。

蛋白激酶的活性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,PRKACA、PLK1、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶1(calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1,CAMK1)、AURKA和AURKB等蛋白激酶的活性發(fā)生顯著變化(圖5)。文獻(xiàn)報(bào)道,PRKACA能介導(dǎo)STAT3磷酸化,激活果蠅zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)[31];PLK1可促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂[32],這些激酶在腫瘤進(jìn)展中都發(fā)揮著重要作用,由此推測(cè)這些激酶的活性改變可能是博舒替尼抑制食管癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。

雖然博舒替尼在CML中顯示出良好的治療效果,但其在實(shí)體瘤中的應(yīng)用及作用機(jī)制有待進(jìn)一步拓展及研究。本文從磷酸化蛋白質(zhì)組層面揭示了除Src/Abl外博舒替尼在食管癌中潛在的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制,為其在食管癌中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ),同時(shí)也為其在其他腫瘤中的研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。