劉 霖,湯 婧,邢 兵,李 鑫,陳 瑩,周祖平,蒲仕明*

(1.廣西師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院;b.生物醫(yī)學(xué)研究中心,中國(guó)廣西 桂林 541004;2.廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)廣西 桂林 541004)

在哺乳動(dòng)物中,胸腺是T細(xì)胞發(fā)育、分化、成熟并向外周輸出T細(xì)胞的場(chǎng)所。其能通過(guò)分泌各種胸腺激素,調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[1]。胸腺作為T細(xì)胞發(fā)育、分化的重要器官,在接收來(lái)自骨髓的原胸腺細(xì)胞(prothymocyte)后,相繼分化為前胸腺細(xì)胞(prethymocyte)、CD4-CD8-T 細(xì)胞、CD4+CD8+T細(xì)胞,最后分化為成熟的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL;CD4-CD8+T細(xì)胞)或輔助性T細(xì)胞(T helper cell,Th cell;CD4+CD8-T 細(xì)胞)[2]。

成熟的T淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫,其直接消滅侵入機(jī)體的病原微生物,監(jiān)視和清除體內(nèi)出現(xiàn)的癌變細(xì)胞、衰老死亡的細(xì)胞等,具有促進(jìn)免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)的作用,因此胸腺在抗衰老、抗感染、抗腫瘤及自身免疫性疾病中起著重要作用[3]。一直以來(lái),腫瘤對(duì)胸腺發(fā)育及T細(xì)胞功能影響的研究受到人們的關(guān)注。小鼠膠質(zhì)瘤模型的研究表明,模型小鼠的胸腺質(zhì)量減輕,組織學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[4]。另有研究表明,小鼠纖維肉瘤在10 d內(nèi)引起胸腺萎縮,這種胸腺萎縮的特征是細(xì)胞數(shù)量減少,成熟胸腺細(xì)胞百分比增加,組織學(xué)上胸腺皮質(zhì)減小,未成熟胸腺細(xì)胞中增殖細(xì)胞百分比增加[5]。Sun等[6]提出,CD8+T細(xì)胞不能有效地獨(dú)立消除H22腫瘤細(xì)胞,而CD4+T細(xì)胞被腫瘤抑制,這樣機(jī)體只會(huì)增強(qiáng)胸腺中T細(xì)胞的分化和成熟,并將其釋放到實(shí)體腫瘤中以增強(qiáng)抗腫瘤免疫能力,引起惡性循環(huán),最終導(dǎo)致胸腺萎縮。研究表明,BALB/c小鼠在營(yíng)養(yǎng)不良或感染的情況下,胸腺組織發(fā)生明顯的萎縮[7];腫瘤的發(fā)生與免疫細(xì)胞生成的內(nèi)部紊亂有關(guān)聯(lián)[8],特別是髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)——一類大量積聚在腫瘤模型動(dòng)物或癌癥病人的骨髓、血液、脾臟以及癌組織中的未成熟髓系抑制細(xì)胞[9～10]。因此,本研究構(gòu)建小鼠肺癌模型,采用HE染色分析小鼠胸腺形態(tài)學(xué)變化,并利用流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠胸腺、外周血中T細(xì)胞亞群的豐度及外周血中MDSCs的含量,旨在探索腫瘤發(fā)生對(duì)胸腺發(fā)育的影響,為明確腫瘤調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所使用的C57BL/6小鼠(體重相近的8周齡雄鼠)購(gòu)買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,飼養(yǎng)于廣西師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),產(chǎn)品號(hào):KCB20781YJ。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Anti-mouse CD3-APC、anti-mouse CD4-PE、anti-mouse CD8-PE-Cy7、anti-mouse Gr-1-PE、anti-mouse CD11b-PE-cy7、anti-mouse CD3e functional grade purified、anti-mouse CD28 functional grade purified以及CFSE proliferation dye源自e-Bioscience公司(美國(guó)),胎牛血清和DMEM Basic(1×)培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco公司(美國(guó)),20×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、膠原酶Ⅱ、紅細(xì)胞裂解液、蘇木素染液、石蠟和伊紅染液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

流式細(xì)胞分選/分析儀(Becton Dickinson公司,美國(guó));普通光學(xué)顯微鏡、熒光倒置顯微鏡(Nikon公司,日本);冷凍離心機(jī)、超純凈去離子水組合系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó));石蠟切片機(jī)和石蠟包埋儀(上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺癌模型的構(gòu)建

培養(yǎng)LLC細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底面積的80%左右,用胰蛋白酶將其消化成單個(gè)懸浮細(xì)胞,經(jīng)PBS洗滌(300g)兩次后稀釋成密度為2.5×106mL-1的細(xì)胞懸液。將0.2 mL細(xì)胞懸液注射至小鼠左腋皮下(5×105個(gè)/只),對(duì)照組注射等量的PBS。小鼠飼養(yǎng)4周,選擇腫瘤直徑不小于1.5 cm的荷瘤小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 小鼠胸腺指數(shù)的測(cè)定

稱量小鼠體重(g)后將其頸椎脫臼處死,置于75%乙醇中5～10 s。用剪刀和鑷子打開(kāi)小鼠胸腔,取出胸腺放于PBS中清洗兩次,隨后將胸腺置于濾紙上吸干水分,并立即用電子天平進(jìn)行稱重(mg)。胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.2.3 小鼠胸腺石蠟切片的制作和HE染色

處死小鼠,取出胸腺置于波氏固定液中進(jìn)行固定過(guò)夜。用流水沖洗胸腺組織過(guò)夜至表面固定液顏色(黃色)基本褪去。將固定好的胸腺依次置于梯度濃度的乙醇溶液(50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%)中,各脫水20 min;再依次置于乙醇-二甲苯等體積混合液、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中,各滲透10 min;將完成滲透的胸腺組織置于60℃石蠟中滲透石蠟2～3 h;隨后進(jìn)行石蠟包埋、切片(蠟片厚度為 4～5 μm)、展片(38 ℃液面)、烤片(58 ℃處理4 h后37℃過(guò)夜)。將上述切片材料依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、乙醇-二甲苯等體積混合液中,各脫蠟10 min;再置于逆濃度梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%)中,各浸泡3 min;室溫條件下用蘇木素染液染色10～15 min,分化液浸洗3～5 s,再用伊紅染液染色5 min;隨后將切片依次置于95%乙醇、100%乙醇、乙醇-二甲苯等體積混合液中,各脫水2 min,緊接著二甲苯透明2 min,最后封片用于鏡檢。

1.2.4 小鼠胸腺細(xì)胞的制備及流式細(xì)胞術(shù)分析

取小鼠胸腺置于PBS中,經(jīng)剪碎后用0.1%膠原酶Ⅱ于37℃消化15 min,隨后用PBS洗滌兩次(500g,下同)。過(guò)濾后用PBS重懸細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取約1.0×107個(gè)細(xì)胞于4℃避光條件下孵育anti-mouse CD4和anti-mouse CD8熒光偶聯(lián)抗體30 min,經(jīng)PBS清洗、重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.2.5 骨髓單細(xì)胞懸液的制備及MDSCs的分選

頸椎脫臼處死小鼠后將其浸泡于75%乙醇中5～10 s,分離出小鼠脛骨與股骨并將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái),用75%的乙醇浸泡脛骨與股骨15 s后,用無(wú)菌PBS浸洗兩次。剪開(kāi)脛骨與股骨兩端,用吸有DMEM完全培養(yǎng)基的1 mL注射器將骨髓組織吹出。用移液器反復(fù)吹培養(yǎng)基至形成骨髓單細(xì)胞懸液。離心棄上清,對(duì)骨髓細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解液裂解2 min,隨后用PBS清洗兩次。將所得骨髓細(xì)胞用anti-mouse CD11b和anti-mouse Gr-1熒光偶聯(lián)抗體孵育30 min,經(jīng)PBS清洗、重懸后用于流式細(xì)胞術(shù)分選MDSCs。

1.2.6 小鼠外周血有核細(xì)胞的制備及流式細(xì)胞術(shù)分析

對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶取血,將血液滴入盛有3 mL 0.5%肝素鈉溶液的離心管中,并迅速混合。離心棄上清后,用PBS洗滌兩次。加入紅細(xì)胞裂解液裂解5 min后,用PBS清洗兩次。將所得外周血有核細(xì)胞分為兩組,一組于4℃避光條件下孵育anti-mouse CD3、anti-mouse CD4 和 anti-mouse CD8熒光偶聯(lián)抗體30 min,用于分析T細(xì)胞的豐度;另一組在同樣條件下孵育anti-mouse CD11b和anti-mouse Gr-1熒光偶聯(lián)抗體,用于分析MDSCs的豐度。

1.2.7 非特異性T細(xì)胞增殖抑制

將羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimide ester,CFSE)工作液加入到胸腺單細(xì)胞懸液并快速混勻(終濃度為5 μmol/L),室溫下避光孵育10 min,用冰冷的DMEM完全培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將上述經(jīng)CFSE染色的胸腺細(xì)胞(4×105個(gè))接種于96孔板中,隨后分別向每孔加入分選獲取的腫瘤小鼠來(lái)源的MDSCs或正常小鼠來(lái)源的MDSCs(2×105個(gè))共培養(yǎng)(胸腺細(xì)胞∶MDSCs=2∶1),空白組(Medium)加入等量的PBS(胸腺細(xì)胞∶MDSCs=2∶0)。此外,每孔加入 anti-mouse CD3e functional grade purified、anti-mouse CD28 functional grade purified抗體(終質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL)刺激T細(xì)胞增殖?；旌暇鶆蚝笤贑O2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。72 h后收集細(xì)胞,經(jīng)PBS清洗和重懸后分析CFSE的熒光強(qiáng)度,以確定T細(xì)胞的增殖情況。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

流式細(xì)胞術(shù)所得數(shù)據(jù)由FlowJo7流式分析軟件分析;柱形圖生成與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用GraphPad Prism軟件,并進(jìn)行獨(dú)立樣本t-test分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001)。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤狀態(tài)下小鼠胸腺發(fā)生萎縮

利用LLC細(xì)胞構(gòu)建小鼠肺癌模型(圖1A),分別取出荷瘤小鼠(Tumor)與對(duì)照組小鼠(Normal)的胸腺稱重,獲取小鼠胸腺質(zhì)量,并計(jì)算其胸腺指數(shù)。結(jié)果表明,與正常小鼠的胸腺相比,腫瘤狀態(tài)下小鼠胸腺的體積和質(zhì)量均明顯減小(圖1B,C),胸腺指數(shù)也顯著降低(圖1D),提示腫瘤發(fā)生中胸腺發(fā)育受阻,胸腺器官萎縮。

圖1 小鼠胸腺質(zhì)量及指數(shù)分析(A)小鼠肺癌模型圖;(B)小鼠胸腺對(duì)比圖;(C)小鼠胸腺質(zhì)量分析;(D)小鼠胸腺指數(shù)分析。Fig.1 Analysis of mouse thymus mass and index(A)The mouse model of lung cancer;(B)Comparison of thymus samples;(C)Analysis of thymus mass of mice;(D)Analysis of thymus index of mice.

2.2 腫瘤發(fā)生中小鼠胸腺皮/髓質(zhì)比下降

為分析腫瘤狀態(tài)下小鼠胸腺的發(fā)育情況,分別對(duì)正常小鼠和荷瘤小鼠的胸腺進(jìn)行病理切片分析(圖2)。結(jié)果表明,正常小鼠胸腺皮質(zhì)較厚,細(xì)胞排列緊密;荷瘤小鼠胸腺皮質(zhì)變薄,細(xì)胞排列稀疏。此外,正常小鼠胸腺的皮質(zhì)比例高于荷瘤小鼠胸腺的皮質(zhì)比例。以上信息提示,腫瘤發(fā)生中未成熟T細(xì)胞生成可能受阻。

圖2 正常小鼠和荷瘤小鼠胸腺組織的形態(tài)學(xué)比較1:小鼠胸腺的皮質(zhì)區(qū);2:小鼠胸腺的髓質(zhì)區(qū)。Fig.2 Morphological comparison of thymus tissues in normal and tumor-bearing mice1:The cortical region of the mouse thymus;2:Medullary region.

2.3 腫瘤狀態(tài)下胸腺T細(xì)胞亞群顯著下降

為分析腫瘤發(fā)生中胸腺T細(xì)胞發(fā)育的變化,對(duì)正常小鼠和荷瘤小鼠的胸腺細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析(圖3)。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,荷瘤小鼠胸腺中未成熟CD4+CD8+T細(xì)胞的豐度明顯降低(Normal vs.Tumor:77.50%±1.761%vs.68.67%±2.136%)(圖3C);成熟的CD4-CD8+T細(xì)胞(Normal vs.Tumor:2.09%±0.112%vs.4.25%±0.219%)和CD4+CD8-T細(xì)胞(Normal vs.Tumor:14.23%±1.497%vs.20.97%±1.481%)的豐度均顯著升高(圖 3D,E)。為充分討論胸腺在腫瘤發(fā)生中的變化規(guī)律,本研究對(duì)胸腺分離的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)數(shù)(圖3F),計(jì)算了胸腺中各T細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)量(胸腺單細(xì)胞數(shù)×細(xì)胞豐度)。結(jié)果表明,胸腺中未成熟的CD4-CD8-T 細(xì)胞[Normal vs.Tumor:(39.51±3.702)×105vs.(8.99±2.446)×105]、CD4+CD8+T 細(xì)胞[Normal vs.Tumor:(60.01±3.568)×106vs.(12.16±4.012)×106]和成熟的CD4-CD8+T細(xì)胞[Normal vs.Tumor:(1.63±0.164)×106vs.(0.69±0.178)×106]、CD4+CD8-T 細(xì)胞[Normal vs.Tumor:(13.51±1.271)×106vs.(3.19±0.820)×106]的絕對(duì)數(shù)量在腫瘤狀態(tài)下均明顯減少(圖3G～J),這提示腫瘤發(fā)生中胸腺產(chǎn)生的成熟T細(xì)胞(CD4+CD8-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞)、未成熟T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量均顯著下降。上述結(jié)果揭示,腫瘤發(fā)生導(dǎo)致胸腺發(fā)育異常,T細(xì)胞分化與增殖受阻。

2.4 腫瘤發(fā)生中外周血T細(xì)胞含量明顯下降

為評(píng)估腫瘤狀態(tài)下小鼠的免疫功能,本研究檢測(cè)了外周血有核細(xì)胞中T細(xì)胞的含量,結(jié)果如圖4。腫瘤狀態(tài)下CD4+T細(xì)胞(4.59%±0.118%)和CD8+T細(xì)胞(3.69%±0.402%)的含量較正常小鼠CD4+T細(xì)胞(17.85%±0.988%)和 CD8+T細(xì)胞(12.94%±0.694%)的含量顯著降低,提示腫瘤發(fā)生中小鼠細(xì)胞免疫功能下降。

2.5 腫瘤發(fā)生中髓源性抑制細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制作用

腫瘤發(fā)生中,MDSCs抑制T細(xì)胞的增殖與活化。為闡明腫瘤發(fā)生中胸腺萎縮和T細(xì)胞數(shù)量下降潛在的原因,本研究分析了小鼠外周血中MDSCs的產(chǎn)生情況和MDSCs在腫瘤狀態(tài)下的免疫抑制作用。結(jié)果顯示,在腫瘤狀態(tài)下,小鼠外周血中MDSCs比例顯著增加(Normal vs.Tumor:8.15%±0.646%vs.72.23%±1.789%)(圖 5A,C)。在非特異性免疫抑制實(shí)驗(yàn)中,荷瘤小鼠和正常小鼠骨髓來(lái)源的MDSCs與胸腺細(xì)胞1∶2共培養(yǎng)時(shí),T細(xì)胞的增殖指數(shù)分別為7.61%±0.871%和11.50%±0.608%,空白組中T細(xì)胞的增殖指數(shù)為27.34%±2.006%(圖5B,D)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明荷瘤小鼠中產(chǎn)生了更多的MDSCs,且腫瘤來(lái)源的MDSCs具有更強(qiáng)的免疫抑制能力。上述結(jié)果揭示,腫瘤進(jìn)程中產(chǎn)生了更多具有更強(qiáng)免疫抑制能力的MDSCs,其嚴(yán)重抑制T細(xì)胞的增殖與活化,可能是胸腺萎縮以及T細(xì)胞發(fā)育受阻的重要原因。

圖3 小鼠胸腺T細(xì)胞豐度及絕對(duì)細(xì)胞數(shù)量分析(A)小鼠胸腺代表性流式細(xì)胞術(shù)分析圖;(B～E)小鼠胸腺CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD8+、CD4+T細(xì)胞的豐度分析;(F)小鼠胸腺細(xì)胞的計(jì)數(shù);(G～J)小鼠胸腺 CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD8+、CD4+T 細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。Fig.3 Abundance and absolute cell number of mouse thymus T cells(A)Representative flow cytometric analysis of mouse thymus;(B～E)Abundance analysis of CD4-CD8-,CD4+CD8+,CD8+,and CD4+T cells in mouse thymus;(F)Counting number of mouse thymus cells;(G～J)Absolute number of CD4-CD8-,CD4+CD8+,CD8+and CD4+T cells in mouse thymus.

3 討論

在哺乳動(dòng)物中,隨著年齡的增長(zhǎng),胸腺組織會(huì)發(fā)生增齡性萎縮,這屬于生理性萎縮。不論是生理性萎縮還是病理性萎縮,必然會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生直接的影響。Sizova等[11]研究發(fā)現(xiàn),惡性黑色素瘤細(xì)胞能潛藏在萎縮的胸腺中而免于抗癌藥物的殺傷,而且萎縮的胸腺還能為腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供惡性儲(chǔ)備。長(zhǎng)期以來(lái),衰老與萎縮胸腺的功能回復(fù)之間的關(guān)系備受關(guān)注,然而,人們對(duì)腫瘤狀態(tài)下胸腺T細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制知之甚少。因此,文中以LLC細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠肺癌模型為研究對(duì)象,對(duì)腫瘤狀態(tài)下胸腺形態(tài)及其T細(xì)胞的豐度變化進(jìn)行了分析,檢測(cè)了外周血中部分終端分化的免疫細(xì)胞含量,并且還檢測(cè)了MDSCs對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制作用,旨在詮釋腫瘤影響下胸腺T細(xì)胞的發(fā)育及腫瘤狀態(tài)下機(jī)體免疫系統(tǒng)的變化規(guī)律。

圖4 小鼠外周血T淋巴細(xì)胞的豐度分析(A)小鼠外周血T細(xì)胞代表性流式細(xì)胞術(shù)分析圖;(B)小鼠外周血CD4+T細(xì)胞豐度的統(tǒng)計(jì)分析;(C)小鼠外周血CD8+T細(xì)胞豐度的統(tǒng)計(jì)分析。Fig.4 T lymphocyte abundance analysis in mouse peripheral blood(A)Representative flow cytometry analysis of mouse peripheral blood T cells;(B)Statistical analysis of CD4+T cell abundance in peripheral blood of mice;(C)Statistical analysis of CD8+T cell abundance in peripheral blood of mice.

圖5 MDSCs豐度及其免疫抑制分析(A)小鼠外周血MDSCs代表性流式細(xì)胞術(shù)散點(diǎn)圖;(B)CFSE熒光衰減的流式細(xì)胞術(shù)分析;(C)小鼠外周血MDSCs豐度的統(tǒng)計(jì)分析;(D)MDSCs免疫抑制的統(tǒng)計(jì)分析。Fig.5 Abundance and immunosuppressive analysis of MDSCs(A)Representative flow cytometry scatter plots of MDSCs in mouse peripheral blood;(B)Flow cytometry analysis of CFSE fluorescence decay;(C)Statistical analysis of MDSC abundance in peripheral blood of mice;(D)Statistical analysis of immunosuppression of MDSCs.

本研究發(fā)現(xiàn),腫瘤發(fā)生會(huì)導(dǎo)致胸腺萎縮(圖1),其產(chǎn)生的T細(xì)胞發(fā)育異常,CD4+和CD8+T細(xì)胞在胸腺中的含量異常增加(圖3D,E),這可能是胸腺中皮/髓質(zhì)比在荷瘤小鼠中下降造成的(圖2)。既往的研究表明,T細(xì)胞未成熟階段在胸腺皮質(zhì)內(nèi)分化,而CD4+CD8-或CD4-CD8+T細(xì)胞在胸腺髓質(zhì)中成熟[12]。盡管腫瘤狀態(tài)下成熟T細(xì)胞的豐度顯著增加,但是胸腺中總的細(xì)胞數(shù)量是減少的(圖3F),繼而向外周輸出的T細(xì)胞減少(圖4);另外,上游CD4-CD8-、CD4+CD8+T細(xì)胞數(shù)量下降顯著(圖3G,H),是導(dǎo)致胸腺、外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞減少的直接因素。腫瘤發(fā)生中,髓系細(xì)胞成熟受阻,致使未成熟髓系細(xì)胞(髓源性抑制細(xì)胞)積累。研究顯示,積累的MDSCs對(duì)T細(xì)胞的活化與增殖有顯著的抑制作用,是腫瘤發(fā)展和逃逸的關(guān)鍵[13～14]。本研究在荷瘤小鼠中檢測(cè)出大量的MDSCs(圖5C),這些積累的MDSCs可能是導(dǎo)致胸腺萎縮的主要原因。胸腺中T細(xì)胞減少的另一個(gè)主要原因可能是骨髓向胸腺輸入的原胸腺細(xì)胞下降。課題組前期的研究表明,腫瘤發(fā)生中,骨髓共同淋巴祖細(xì)胞(common lymphoid progenitors,CLPs)的生成下降[15]。與之相對(duì)應(yīng),髓系干/祖細(xì)胞偏向髓系分化和增殖,致使MDSCs積累,從而抑制T細(xì)胞增殖與活化,促進(jìn)腫瘤發(fā)展與逃逸[16]。

綜上所述,在腫瘤狀態(tài)下,胸腺發(fā)生明顯萎縮,胸腺指數(shù)下降,胸腺皮/髓質(zhì)比下降,T細(xì)胞生成能力顯著減弱,其中未成熟的T細(xì)胞數(shù)量下降尤為顯著;同時(shí),外周血中T細(xì)胞含量顯著下降,MDSCs顯著增加,且腫瘤條件下MDSCs對(duì)T細(xì)胞增殖具有顯著的抑制能力。這些結(jié)果揭示,在LLC細(xì)胞構(gòu)建的腫瘤模型中,造血干/祖細(xì)胞偏向髓系細(xì)胞分化,并且髓系細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制作用,抑制T細(xì)胞的增殖與活化,這可能是導(dǎo)致胸腺萎縮、T細(xì)胞增殖和活化受阻的主要原因。