孟德光， 王佳榮， 常曉峰， 韓煒， 史奎， 滕懷炟， 趙曼

腎母細(xì)胞瘤又稱威爾姆斯瘤(Wilms’ tumor，WT)，是一種幼兒常見的、源于腎臟胚基細(xì)胞的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。WT占小兒實(shí)體瘤的6%，占小兒腎臟腫瘤的95%，多發(fā)于5歲之前的兒童時(shí)期，尤以2～3歲時(shí)發(fā)病率最高[1-2]。WT的發(fā)病癥狀通常表現(xiàn)為腹部腫脹、腹痛、血尿等，約有20%的患兒表現(xiàn)出高血壓等癥狀。WT具有生長速度快、惡性程度高、發(fā)生轉(zhuǎn)移早等特點(diǎn)，通常血行轉(zhuǎn)移至肝臟和肺[3]。難治性WT是指WT患者在術(shù)后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的情況。目前臨床上對(duì)難治性WT的治療方法主要是瘤體的二次切除結(jié)合術(shù)后放療或化療，但是由于瘤體二次切除手術(shù)的難度較大，化療敏感性較低，且復(fù)發(fā)瘤體廣泛浸潤生長，因此患者預(yù)后效果不佳[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的提高，已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶-Ⅱα(Topoisomerase-Ⅱα，TOPOⅡα)的表達(dá)異常與多種實(shí)體腫瘤如腦膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺浸潤導(dǎo)管癌等密切相關(guān)[5-7]。TOPOⅡα參與調(diào)節(jié)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，是調(diào)控核酸空間結(jié)構(gòu)、控制核酸生理功能的一種關(guān)鍵酶，存在于多種增殖細(xì)胞中，且呈現(xiàn)出周期特異性表達(dá)[8]。但有關(guān)TOPOⅡα在難治性WT中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較為少見。本研究通過檢測(cè)難治性WT腫瘤組織和癌旁組織中TOPOⅡα的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其與難治性WT患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為研究難治性WT的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和后續(xù)治療提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年7月至2018年7月于保定市兒童醫(yī)院治療且具有完整臨床和隨訪資料的62例難治性WT患兒的腫瘤組織標(biāo)本，同時(shí)收集58例癌旁組織為對(duì)照。62例患兒中男32例，女30例；年齡1～7(3.2±0.6)歲；均經(jīng)病理、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)證實(shí)為WT術(shù)后復(fù)發(fā)。收集患兒臨床資料，包括年齡、性別、病理類型、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、腫瘤位置、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等。其中病理類型包括預(yù)后良好型和預(yù)后不良型，預(yù)后良好型包括胚芽型、上皮型、間葉型和混合型，預(yù)后不良型主要指間變型和未分化型。本研究經(jīng)保定市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 所取得的腫瘤組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm的正常組織)經(jīng)固定、包埋、切片后行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)TOPOⅡα的表達(dá)情況。所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說明書執(zhí)行，免疫組化試劑盒購于北京鑫諾生物技術(shù)有限公司。染色結(jié)果由兩位或兩位以上病理科醫(yī)師進(jìn)行判定。以細(xì)胞核或部分胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒判定為陽性細(xì)胞。染色評(píng)分：棕褐色3分，棕黃色2分、淡黃色1分；陽性細(xì)胞占比評(píng)分：高于80%為4分，51%～80%為3分，11%～50%為2分，0%～10%為1分。染色評(píng)分與陽性細(xì)胞占比評(píng)分的積為最后得分，總得分≥6為高表達(dá)，<6為低表達(dá)。

隨訪：患兒均隨訪12個(gè)月，最后1例患兒隨訪時(shí)間截至2019年7月，失訪者以失訪時(shí)實(shí)際疾病狀態(tài)計(jì)算。統(tǒng)計(jì)終點(diǎn)為復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡及帶病生存。

2 結(jié)果

2.1 難治性WT患兒中TOPOⅡα表達(dá)情況 難治性WT組患兒TOPOⅡα高表達(dá)率為59.68%(37/62)，高于對(duì)照組的29.31%(17/58)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.165，P<0.001)，見圖1。免疫組化檢測(cè)各組病理組織中TOPOⅡα表達(dá)，TOPOⅡα高表達(dá)組中陽性細(xì)胞深染，多呈棕褐色，TOPOⅡα陽性細(xì)胞數(shù)為(84.03±10.64)個(gè)，高于對(duì)照組的(2.58±1.13)個(gè)和TOPOⅡα低表達(dá)組的(5.79±2.76)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為57.923、53.401，P均<0.001)，見圖2。

圖1 難治性WT患兒的TOPOⅡα表達(dá)情況

2A：對(duì)照組中TOPOⅡα表達(dá)情況；2B：難治性WT患兒組TOPOⅡα低表達(dá)；2C：難治性WT患兒組TOPOⅡα高表達(dá)

2.2 TOPOⅡα表達(dá)與難治性WT患兒臨床病理特征的關(guān)系 在WT病理類型為預(yù)后不良型、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期為Ⅲ或Ⅳ期、有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患兒中，TOPOⅡα高表達(dá)率較高(P<0.05)?；純旱哪挲g、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置與TOPOⅡα表達(dá)高低無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 TOPOⅡα表達(dá)與難治性WT患兒臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

2.3 TOPOⅡα表達(dá)與難治性WT患兒臨床病理特征的多因素分析 以TOPOⅡα表達(dá)為因變量(TOPOⅡα高表達(dá)=1，TOPOⅡα低表達(dá)=0)，以病理類型(預(yù)后不良型=1，預(yù)后良好型=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有=1，無=0)、腫瘤分期(Ⅰ、Ⅱ=0，Ⅲ、Ⅳ=1)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(有=1，無=0)為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，患者的病理類型為預(yù)后不良型、腫瘤分期高是難治性WT患兒TOPOⅡα高表達(dá)的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表2。

表2 影響難治性WT患兒TOPOⅡα高表達(dá)的多因素Logistic分析

2.4 TOPOⅡα表達(dá)與難治性WT患兒預(yù)后的關(guān)系截至2019年7月，62例難治性WT隨訪患兒中，失訪5例，死亡26例。TOPOⅡα高表達(dá)組患兒的中位生存時(shí)間為27周，顯著低于TOPOⅡα低表達(dá)組患兒的49周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)，見圖3。

圖3 TOPOⅡα高表達(dá)與低表達(dá)難治性WT患兒的生存曲線

3 討論

WT是幼兒腹部最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制仍不明確，目前認(rèn)為患兒體內(nèi)癌基因的異常激活、抑癌基因的失活或缺乏、DNA復(fù)制或調(diào)控異常均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[9]。手術(shù)治療、化療和放療是目前臨床治療小兒WT的常用方式，但這些治療方式仍然存在多方面的問題，如未明確WT的具體發(fā)生發(fā)展機(jī)制、化學(xué)藥物的不良反應(yīng)及多種耐藥機(jī)制等[10]。目前WT的治愈率雖然較高，但是仍有部分間變型腫瘤存在復(fù)發(fā)的情況，即成為難治性WT。難治性WT存在治療難度大、治療方法有限和患者預(yù)后較差等問題[11]。因此，除了應(yīng)當(dāng)掌握小兒難治性WT的標(biāo)準(zhǔn)治療方法之外，更應(yīng)當(dāng)加深對(duì)難治性WT分子生物學(xué)水平上的認(rèn)識(shí)和理解。隨著人類基因組計(jì)劃的發(fā)展及精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代的到來，分子檢測(cè)成為臨床診治中必不可少的診斷手段[12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，WT與ERCC1、TUBB3、TOPOⅡα等的表達(dá)關(guān)系密切[13]。

TOPOⅡα通過介導(dǎo)DNA的斷裂并形成新的DNA-蛋白酶復(fù)合物來參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。其編碼的TOPOⅡα蛋白是ATP依賴的對(duì)細(xì)胞起關(guān)鍵作用的水解酶和合成酶，參與染色體濃縮及結(jié)果保持、染色體分離等重要過程。因此，在增殖活性異常升高的腫瘤細(xì)胞中TOPOⅡα表達(dá)顯著升高[15]。本研究結(jié)果顯示，難治性WT組患兒TOPOⅡα高表達(dá)率為59.68%，高于對(duì)照組的29.31%；TOPOⅡα高表達(dá)組陽性細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組和TOPOⅡα低表達(dá)組，表明在難治性WT患兒中，存在TOPOⅡα的高表達(dá)。與陳永江等[16]的研究結(jié)果一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤的預(yù)后不良及腫瘤分期的加重，WT患兒腫瘤組織中TOPOⅡα表達(dá)增高。

本研究結(jié)果顯示，TOPOⅡα高表達(dá)組患兒的中位生存時(shí)間顯著低于TOPOⅡα低表達(dá)組患兒。TOPOⅡα在難治性WT中的研究較少，但其在乳腺癌、膀胱癌中已有較深入的研究[17-18]。劉燕等[19]研究發(fā)現(xiàn)，87%的乳腺癌患者中存在TOPOⅡα陽性表達(dá)，且與人類表皮生長因子受體-2(HER2)的表達(dá)存在相關(guān)性，總體預(yù)后較差。在膀胱癌中，癌組織中TOPOⅡα陽性率顯著高于癌旁組織，且TOPOⅡα高表達(dá)患者生存率較低、預(yù)后較差[20]。由此推測(cè)TOPOⅡα的表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后生存期具有相關(guān)性。

綜上，在難治性WT患兒中存在TOPOⅡα高表達(dá)。難治性WT患兒的病理類型為預(yù)后不良型、腫瘤分期高是TOPOⅡα高表達(dá)的危險(xiǎn)因素。TOPOⅡα低表達(dá)組患兒的生存預(yù)后好于TOPOⅡα高表達(dá)組患兒。本研究納入樣本量較少，除了研究中納入的影響因素外，可能還存在其他影響TOPOⅡα表達(dá)的因素，有待于日后擴(kuò)大樣本量對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。此外，WT的發(fā)生發(fā)展是環(huán)境因素和多個(gè)基因共同作用的結(jié)果，受多種信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的影響，關(guān)于TOPOⅡα與其他基因或信號(hào)通路之間的關(guān)系尚待進(jìn)一步深入研究。