周海, 潘凱, 陳玉明, 申余勇, 周明, 賀興軍, 費尚春, 王小祥

微小RNAs(mircoRNAs, miRNAs)是一種由21～22個核苷酸構(gòu)成的非編碼RNA,可以通過與靶基因3′-非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,從而抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解。實驗證據(jù)表明miRNAs參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1]。Sprouty2屬于哺乳動物Sprouty信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白家族,在細胞凋亡、增殖、遷移中發(fā)揮重要的作用[2-3]。本實驗旨在研究miR-122在腎癌中的作用,并確定Sprouty2是否是miR-122的作用靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 原發(fā)性腎癌和相鄰正常組織標(biāo)本來自揚州大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1月至2019年6月接受部分或根治性腎切除術(shù)的患者,共42例,中位年齡55歲(41～70歲)。組織標(biāo)本于術(shù)后立即在液氮中冷凍,并儲存在-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。選取腫瘤組織>70%的樣品用于提取總RNA。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會審核,并取得所有患者及家屬書面知情同意。

1.1.2 實驗材料 CAKI-1、786-0細胞系、放射免疫沉淀測定緩沖液(南京凱基生物公司),Lipofectamine 2000TM試劑、Trizol試劑(上海英俊生物公司),轉(zhuǎn)染序列(上海吉瑪公司),Sprouty2和 GAPDH基因序列(上海捷瑞生物),NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司,美國),TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan MicroRNA Assay Kit及 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司,美國),PrimerScript One-Step RT-PCR試劑盒(大連Takara公司),PVDF膜(Millipore公司,美國),抗β微管蛋白、小鼠抗Sprouty2(Abcam公司,美國),化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司,美國),細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)(上海碧云天生物技術(shù)公司),pGL3-REPORT熒光素酶載體試劑盒(Invitrogen公司,美國),雙熒光素酶測定法(Promega公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 本實驗使用了CAKI-1和786-0兩種人類細胞系。細胞在包含有10%胎牛血清(FBS)、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640和McCoy’s 5A培養(yǎng)基中,于含有5%CO2的37 ℃環(huán)境培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前1天將細胞接種在6孔板上,細胞生長密度約70%時使用LipofectamineTM2000試劑進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后,用RPMI-1640/McCoy’s 5A和FBS代替培養(yǎng)基。miR-122 模擬序列為:上游引物5′-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3′;下游引物5′-AACACCAUUGUCACACUCCAUU-3′。miR-122 對照序列為:上游引物5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′;下游引物5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。miR-122 抑制劑序列為:5′-CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3′;miR-122 抑制劑對照序列為:5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。靶向作用于Sprouty2的小干擾RNA(siRNA)序列為:上游引物5′-CCCAGCAGGUACAUGUCUUTT-3′;下游引物5′-AAGACAUGUACCUGCUGGGTT-3′。

1.2.2 RT-qPCR檢測 根據(jù)說明書,使用Trizol試劑從組織和細胞中提取總RNA,用NanoDrop測量RNA濃度。使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 反轉(zhuǎn)錄得到miR-122的互補DNA(cDNA),根據(jù)使用說明將總RNA(10ng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用TaqMan MicroRNA Assay Kit行PCR操作。內(nèi)參U6探針序列為cat:4395356。使用PrimerScript One-Step RT-PCR Kit將Sprouty2 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Sprouty2引物序列:正向引物 5′-ATCCAGAGACAAGACATGTAC-3′,反向引物5′-TTCAGATGTGTTCTAAGCC-3′; 而GAPDH的序列為:正向引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,反向引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。所有反應(yīng)均使用7900HT Fast Real-Time PCR System進行3次。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔,每個實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Western bolt檢測 采用radioimmunoprecipitation assay buffer,加入蛋白酶抑制劑,提取細胞系和腎癌組織蛋白。應(yīng)用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;然后用5%脫脂牛奶在PBST中封閉1 h。在4 ℃下與一抗anti-β-tubulin和 anti-Sprouty2孵育過夜后,用TBST洗滌3次,常溫下二抗孵育2 h,檢測條帶。上述每個實驗重復(fù)至少3次。

1.2.4 CCK-8實驗測定腎癌細胞體外增殖水平 細胞以2 000個/孔接種在96孔板中。在分別轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h和96 h后,進行CCK-8測定。每個處理組3組樣品,測量450 nm波長處吸光度來確定細胞存活率。

1.2.5 流式細胞法測定腎癌細胞體外細胞周期 轉(zhuǎn)染48 h后,收集細胞,用PBS洗滌兩次,并在-20 ℃下用70%乙醇固定過夜。然后常溫下將細胞在50 mg/ml碘化丙啶和1 mg/ml RNA酶中孵育30 min。使用流式細胞儀分析細胞周期。每個樣品至少包含20 000個細胞。上述每個實驗重復(fù)至少3次。

1.2.6 熒光素酶報告實驗測定Sprouty2基因表達水平 將含有miR-122結(jié)合位點的野生型Sprouty2 3′-UTR和突變型Sprouty2 3′-UTR的片段克隆至pGL3熒光素酶報告系統(tǒng)。構(gòu)建含有Sprouty2 3′-UTR和突變型Sprouty2 3′-UTR熒光素酶報告質(zhì)粒;miR-122類似物、miR-122類似物對照和miR-122抑制劑、miR-122抑制物對照共轉(zhuǎn)染腎癌細胞株。轉(zhuǎn)染48 h后,以內(nèi)參基因作為內(nèi)參照,雙熒光素酶測定法測量熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-122和Sprouty2在腎癌中的表達水平

使用RT-qPCR分析42個原發(fā)性腎癌和42個正常組織標(biāo)本中miR-122的表達水平。腎癌組織中miR-122的表達水平高于正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。Western bolt顯示Sprouty2蛋白在腎癌組織中的表達水平低于正常對照組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。MiR-122與Sprouty2在腎癌中表達水平呈負(fù)相關(guān)。

注:N代表正常組織,T代表癌組織與癌組織比較,*P<0.05

注:N代表正常組織,T代表癌組織;與癌組織比較,*P<0.05

2.2 下調(diào)miR-122對腎癌細胞增殖的影響

在786-0和CAKI-1細胞中，通過轉(zhuǎn)染miR-122 抑制劑及miR-122抑制劑對照研究miR-122對細胞增殖的影響。在CCK-8實驗中,miR-122表達下調(diào)96 h后腎癌細胞的體外增殖活性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3A)。與陰性對照和空白組相比,miR-122抑制劑轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細胞在G0/G1期的百分比升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明下調(diào)miR-122可引起細胞停滯在G1期(圖3B), miR-122在體外實驗中增強了腎癌細胞的增殖能力。

3A:786-0和CAKI-1細胞不同干預(yù)的增殖能力;3B:miR-122抑制劑轉(zhuǎn)染導(dǎo)致786-0和CAKI-1細胞G1細胞周期停滯，與陰性對照和空白組相比,*P<0.05

2.3 miR-122抑制劑與Sprouty2表達量的關(guān)系

與陰性對照和空白組相比,用miR-122抑制劑轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細胞中miR-122的表達水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4A)。3組間Sprouty2 mRNA表達,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖4B),轉(zhuǎn)染72 h后,轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑的細胞中Sprouty2蛋白的表達高于陰性對照組、空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4C)。miR-122能下調(diào)Sprouty2蛋白的表達水平。

4A:miR-122抑制劑轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細胞中miR-122的表達,與陰性對照和空白組相比,*P<0.05;4B:轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑對細胞Sprouty2 mRNA的影響;4C:轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑對細胞中Sprouty2蛋白表達的影響

2.4 敲低Sprouty2對腎癌細胞增殖的影響

Sprouty2蛋白和mRNA的表達量在si-Sprouty2轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細胞中低于用對照組siRNA或空白組轉(zhuǎn)染的細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5A、5B)。在CCK-8實驗中,用si-Sprouty2轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細胞增殖能力相比對照組、空白組的細胞增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖6A)。轉(zhuǎn)染48 h后,用si-Sprouty2轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細胞與對照和空白組細胞相比,G1期細胞百分比減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖6B)。敲低Sprouty2增強了腎癌細胞的體外增殖能力。

5A:Sprouty2敲低對體外細胞Sprouty2 mRNA表達的影響,與陰性對照和空白組相比，*P<0.05;5B:Sprouty2敲低對體外細胞Sprouty2蛋白表達的影響

6A:Sprouty2敲低對細胞增殖的影響;6B:Sprouty2敲低對細胞G1期的影響,與陰性對照和空白組相比，*P<0.05

2.5 Sprouty2與miR-122的靶向關(guān)系

野生型Sprouty2在其3′-UTR中包含miR-122可能的結(jié)合位點(圖7A)。兩種細胞系中,用miR-122類似物共轉(zhuǎn)染的細胞熒光素酶基因表達水平低于和用miR-122類似物對照或miR-122抑制劑對照轉(zhuǎn)染的細胞熒光素酶基因表達水平;與miR-122抑制劑的共轉(zhuǎn)染增強了熒光素酶基因的活性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖7B)。突變型Sprouty2在3′-UTR中亦包含miR-122可能的結(jié)合位點(圖8A)，但是含有突變型Sprouty2 3′-UTR的報告,基因組間相關(guān)熒光素酶基因活性,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖8B)。因此,miR-122是腎癌細胞系中Sprouty2的直接靶基因。

注:與陰性對照組相比,*P<0.05;與抑制劑陰性對照組相比,*P<0.05。7A:miR-122與野生型Sprouty2 3′-UTR的潛在結(jié)合位點;7B:786-0和CAKI-1細胞株,與miR-122類似物或miR-122 抑制劑組共轉(zhuǎn)染對熒光素酶基因活性的影響

注:與陰性對照組、抑制劑陰性對照組相比,P>0.05。8A:miR-122與突變型Sprouty2 3′-UTR的潛在結(jié)合位點;8B:786-0和CAKI-1細胞株,與miR-122類似物或miR-122 抑制劑組共轉(zhuǎn)染對熒光素酶基因活性的影響

3 討論

腎癌是一種常見的泌尿系腫瘤,最常見的亞型是透明細胞癌[4]。目前腎癌的發(fā)病機制尚未明確,其高危因素包括吸煙、肥胖、高血壓和糖尿病等[5]。由于臨床缺乏腎癌的早期診斷標(biāo)志物,患者確診時腫瘤進展、轉(zhuǎn)移的比例相當(dāng)高。因此,研究與腎癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的分子機制可為腎癌的臨床診斷、治療提供更多依據(jù)。

miR-122由肝臟特異性產(chǎn)生,它參與調(diào)節(jié)肝細胞發(fā)育、分化、膽固醇代謝和應(yīng)激反應(yīng),并抑制肝細胞癌發(fā)生[6]。研究表明miR-122在乳腺癌和皮膚T細胞淋巴瘤中存在異常表達[7-8]。Osanto等[9]發(fā)現(xiàn)miR-122在腎癌中過度表達,提示miR-122可能是腎癌的診斷標(biāo)志物和潛在治療靶點。Sprouty2通過抑制Ras/促分裂原活化蛋白激酶信號通路[10],調(diào)節(jié)細胞增殖、侵襲、遷移和細胞凋亡,參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。目前miR-122與Sprouty2相關(guān)性仍不清楚,因此,我們期望明確miR-122在腎癌中的作用機制并進一步研究Sprouty2與miR-122的相關(guān)性,為腎癌臨床早期檢測和靶向治療提供參考。

本研究中發(fā)現(xiàn)miR-122在腎癌組織樣本中表達水平相對相鄰正常組織升高,這與其他miR-122在腎癌中表達水平研究結(jié)果一致[9]。近期越來越多的證據(jù)表明[11],miR-122在腫瘤中發(fā)揮不同作用。在肝癌中,誘導(dǎo)miR-122表達抑制Bcl-W和/或細胞周期蛋白 CyclinG1(CCNG1)的表達,引起細胞周期阻滯和細胞凋亡[12]。此外,乳腺癌中miR-122的表達上調(diào)能靶向作用IGF1R,同時調(diào)節(jié)PI3K/AKT/Mtor/p70s6k通路來抑制腫瘤發(fā)生[13]。這些發(fā)現(xiàn)表明miR-122在肝癌和乳腺癌中起到抑癌作用。然而,miR-122在進展性皮膚T細胞淋巴瘤中表達升高,證明miR-122在皮膚T細胞淋巴瘤中起致癌作用[14]。我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-122抑制786-0和CAKI-1細胞系的增殖、侵襲和遷移,表明miR-122在腎癌細胞系中發(fā)揮致癌作用。明確參與miR-122調(diào)控的靶點可以進一步明確miR-122的作用機制。我們認(rèn)為Sprouty2是miR-122的潛在靶點。首先,我們確定了Sprouty2的3′-UTR中有miR-122序列的互補結(jié)合位點。與miR-122抑制劑對照相比,miR-122抑制劑共轉(zhuǎn)染的野生型熒光素酶報告基因的表達增加,但在突變型報告基因中沒有這種變化。同時,miR-122的表達增加會抑制Sprouty2的野生型3′-UTR的活性,然而Sprouty2的突變型3′-UTR不受miR-122的調(diào)控。此外,miR-122抑制劑在翻譯水平促進了Sprouty2的表達。因此,我們認(rèn)為miR-122通過直接結(jié)合Sprouty2 3′-UTR參與調(diào)控Sprouty2的表達。

我們發(fā)現(xiàn)Sprouty2在腎癌組織中的表達水平低于正常組織,表明Sprouty2在腎癌中發(fā)揮抑癌作用。同時,miR-122的表達水平上調(diào)抑制Sprouty2的表達,表明miR-122可能參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由此我們推測,miR-122誘導(dǎo)Sprouty2表達水平降低,通過Ras/MAPK信號通路的異常激活促進癌細胞中細胞增殖或抑制癌細胞凋亡。研究表明Sprouty2在多種癌癥中存在高甲基化[15-17],這可能導(dǎo)致其表達水平降低。但是,甲基化和miRNA都可作用于Sprouty2,導(dǎo)致其在腎癌中的表達下調(diào)。

綜上所述,miR-122可通過抑制Sprouty2的表達,在腎癌中發(fā)揮致癌作用。miR-122是腎癌潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物,在未來可以針對miR-122進行靶向治療,提高腎癌患者生存率。但是,在腎癌中是否存在其他miR-122的靶基因發(fā)揮共同作用,還需要進一步研究。