李 龍，程金生，任安祥，許穩(wěn)健

（1.韶關(guān)學(xué)院 英東食品學(xué)院；2.韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

新鮮馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)含量為1.7%～2.1%，馬鈴薯蛋白質(zhì)按分子量大小分為高分子量蛋白質(zhì)、糖蛋白、蛋白酶抑制劑3部分［1］.目前堿溶酸沉法提取馬鈴薯蛋白質(zhì)堿溶最佳pH值在9.2～9.5之間，酸沉pH值為3.5左右［2］.堿溶最佳pH值的選擇避開了酸溶堿沉蛋白質(zhì)等電點pH值8.5，從而可獲得更多堿溶蛋白質(zhì)的提取，也防止了因pH值過高（pH＞9.5）導(dǎo)致浸提溶液粘度過大造成蛋白質(zhì)分離困難和堿溶蛋白質(zhì)的水解失去生物活性.因此堿溶酸沉法提取馬鈴薯蛋白質(zhì)堿溶最佳pH值的選擇是科學(xué)合理的.其中堿溶酸沉蛋白主要是馬鈴薯儲藏蛋白高分子，酸溶堿沉蛋白主要是馬鈴薯蛋白酶抑制劑［3］.為了進一步了解馬鈴薯堿溶酸沉蛋白和酸溶堿沉蛋白的分離特性，本研究分別做了馬鈴薯堿溶酸沉蛋白和酸溶堿沉蛋白的提取方法優(yōu)化和分子量測定，為將來馬鈴薯生物活性蛋白膜分離提取技術(shù)和層析分離純化技術(shù)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

馬鈴薯（內(nèi)蒙古赤峰市合作企業(yè)提供）；鹽酸、硫酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純，由廣州化學(xué)試劑有限公司提供.葡聚糖凝膠：型號Sephadex G-200，購于阿拉丁試劑（上海）有限公司，已知分子量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品以及其他所需試劑均購置阿拉丁試劑（上海）有限公司.

所用儀器中：烘箱（型號Eny202266，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；離心機（TGL-16G，上海菁華科技儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（型號UV-240，上海菁華科技儀器有限公司）；電子分析天平（型號JA5003，韶關(guān)市科力實驗儀器有限公司）；立式膠體磨（型號JM-50A，廣西天諢機械有限公司）.

1.2 試驗方法

為了快速測定單因素實驗（pH值、料液比、時間）對馬鈴薯蛋白質(zhì)溶解度的影響，選擇280 nm波長下測蛋白質(zhì)測吸光度測定，吸光度與蛋白質(zhì)提取率（酸提或堿提）呈反比.

為了優(yōu)化工藝條件本研究采用正交實驗，選擇微波消化凱氏定氮法精確測定馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取率.

為了快速測定提?。ㄋ崽峄驂A提）馬鈴薯蛋白質(zhì)在分子篩色譜過程的出峰位置，選擇280 nm波長下測蛋白質(zhì)測吸光度測定，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈正比.為了確定分子篩層析內(nèi)標(biāo)葡聚糖的出峰位置，選擇了苯酚-硫酸法測定內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰位置.

1.2.1 馬鈴薯前處理

馬鈴薯→去皮、切塊→稱300 g馬鈴薯用1% NaCl溶液護色料液比（1∶2）→經(jīng)豆?jié){機、膠體磨粉碎→紗布過濾→抽濾→過濾液→等體積分裝，備用.

1.2.2 不同pH值時馬鈴薯上清液的吸光度測定

取前處理后的分裝液，用濃HCl，濃NaOH溶液分別調(diào)節(jié)至設(shè)定pH→靜置1 h→離心（6 000 r） →沉淀蛋白質(zhì)干燥105 ℃至恒重稱重→上清液在280 nm測量吸光度［5］.

1.2.3 不同料液比條件下的馬鈴薯上清液（pH=3.5，pH=8）吸光度的測定

馬鈴薯前處理條件一樣，按照液料比1∶1，2∶1，3∶1，4∶1分別在pH=3.5，pH=8，時間為1 h的情況進行提取，離心后取上清液在280 nm波長下測蛋白質(zhì)測吸光度，吸光度與蛋白質(zhì)提取率呈反比.

1.2.4 提取時間對提取率的影響

馬鈴薯前處理條件一樣，按照提取時間0.5、1、1.5、2 h分別在pH=3.5，pH=8，液料比2∶1的情況進行提取，離心后取上清液在280 nm下測蛋白質(zhì)測吸光度，吸光度與蛋白質(zhì)提取率呈反比.

1.2.5 正交實驗設(shè)計

根據(jù)單因素的測定結(jié)果，確定等電點pH（A）、提取時間（B）和液料比（C）3個主要因素，從而在酸性條件和堿性條件下分別建立L9（33）三因素三水平的正交試驗［8］，提取馬鈴薯蛋白質(zhì)采用微波消化凱氏定氮法測定計算提取率，提取率=過濾液的蛋白質(zhì)總量-調(diào)pH值后上清蛋白質(zhì)總量/過濾液的蛋白質(zhì)總量.實驗方案見表1、表2.

表1 酸性性條件下正交實驗因素水平

表2 堿性條件下正交實驗因素水平

1.2.6 馬鈴薯蛋白質(zhì)分子量的測定

一定體積的馬鈴薯過濾液調(diào)pH=3.5提取沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)堿溶后過柱分析，再經(jīng)堿液中和調(diào)pH=8.5提取沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)酸溶后過柱分析，利用紫外線分光光度計確定酸溶性和堿溶性蛋白質(zhì)的大致含量，通過與內(nèi)標(biāo)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的流出時間測定馬鈴薯蛋白質(zhì)的分子量，從而對馬鈴薯酸溶和堿溶蛋白質(zhì)進行初步的分析和分類.

1.2.6.1 測定內(nèi)標(biāo)葡聚糖含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的配制：稱取葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，加水適量使溶解，定容.吸取上述溶液10 mL，定容至100 mL.即得0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液［6］.

苯酚-硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：用移液管移取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別置于10 mL試管中，依次加水,終體積為1.0 mL［7］.另加1.0 mL的5%的苯酚，搖勻，再各加入濃硫酸5 mL，搖勻，在室溫下顯色10～20 min，以空白校正零點，于490 nm波長下處檢測其吸光度［6］.然后以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.

圖1 苯酚-硫酸法測定葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.6.2 分子篩層析法測定蛋白質(zhì)分子量

堿溶性蛋白質(zhì)和酸溶性蛋白質(zhì)分別通過酸沉堿溶、堿沉酸溶方法，各取出1 mL溶液，加水稀釋至5 mL，搖勻待用.查閱資料得知馬鈴薯含有的3種蛋白質(zhì)分子量，選取多糖分子量為1.1×105，6.06×104，1.26×104的3種標(biāo)準(zhǔn)品［7］，分別用精密天平準(zhǔn)確稱取3.0 mg，一起溶解在5 mL水中，搖勻，待用.精密天平稱取標(biāo)準(zhǔn)藍色聚多糖5.0 mg溶于50 mL容量瓶中.混勻，待用.

1.2.6.3 葡聚糖凝膠柱的制備及實驗方法

（1）裝柱：用 Sephadex G-200填柱.

（2）跑柱：平衡凝膠柱需過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，如果出現(xiàn)，必須重新裝柱［9］.

（3）測定V0：取0.5 mL配制好的藍色葡聚糖-2000上柱、洗脫，測出洗脫體積Ve.藍色葡聚糖的Ve即為該柱的V0［8］.

（4）上樣：酸提堿溶性蛋白：取上述蛋白質(zhì)溶液0.5 mL，藍色葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，搖勻，在加入1 mL配置好的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻.加樣，過柱.由于藍色聚多糖分子量最大，所以在柱內(nèi)走的最快，因此當(dāng)看到藍色物質(zhì)流出時，開始收集洗脫液，2 mL一管，共40管.按照1～40號的先后收集順序貼好標(biāo)簽，待用.

（5）檢樣：依次取洗脫液1 mL加水稀釋至5 mL在490 nm下測吸光度代表標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的吸光度.另依次取0.5 mL洗脫液加水至5 mL在280 nm下吸光度值代表蛋白質(zhì)的吸光度，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖和馬鈴薯蛋白質(zhì)的出峰位置計算蛋白質(zhì)分子量.

2 結(jié)果分析

2.1 單因素的分析結(jié)果

2.1.1 不同pH值對浸提馬鈴薯蛋白質(zhì)后離心上清液吸光度的影響

馬鈴薯蛋白質(zhì)的吸光度在酸性條件和堿性條件下均出現(xiàn)最小吸光度，如圖2所示，說明馬鈴薯蛋白質(zhì)有兩個等電點.由圖可以看出，隨著pH值在2.0到13.0的范圍內(nèi)變化時，馬鈴薯蛋白質(zhì)提取率的變化趨勢. pH在3～4之間時上清液吸光度有一個最低值，預(yù)測該PH值與馬鈴薯酸性等電點較接近，pH=8左右時又出現(xiàn)一個吸光度最小值，預(yù)測該pH值與馬鈴薯堿性等電點比較接近.比較吸光度可知，馬鈴薯蛋白質(zhì)酸性等電點蛋白質(zhì)含量較高.

圖 2 pH值對上清液吸光度的影響

2.1.2 不同料液比對浸提馬鈴薯蛋白質(zhì)后離心上清液吸光度的影響

在酸性和堿性條件下，當(dāng)提取液的料液比從1∶1上升至2∶1區(qū)間時，上清液的吸光度逐漸減少，馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取率不斷升高，料液比達到2∶1為吸光度曲線拐點，如圖3所示.當(dāng)料液比繼續(xù)升高時，溶液因體積增大數(shù)倍而吸光度略有下降，說明溶液中不沉淀蛋白質(zhì)略有增加.考慮到食品加工生產(chǎn)過程中，料液比太大會增加后處理的負(fù)擔(dān)，浪費資源，使產(chǎn)品成本增大，因此選取料液比2∶1左右進行提取比較適宜.

圖3 料液比對上清液吸光度的影響

2.1.3 提取時間對浸提馬鈴薯蛋白質(zhì)后離心上清液吸光度的影響

在酸性和堿性條件下，提取時間對提取率的影響不是特別大，提取時間在0.5～1.5 h區(qū)間時，提取率升高比較明顯，1.5 h之后較為緩慢，逐漸趨于平穩(wěn)，如圖4所示.考慮到企業(yè)生產(chǎn)效益，因此選取提取時間1 h左右進行提取比較適宜.

圖4 提取時間對上清液吸光度的影響

2.2 馬鈴薯蛋白質(zhì)在酸性條件下提取蛋白質(zhì)正交實驗的結(jié)果

由表3可得，酸性條件下，等電點提取馬鈴薯蛋白質(zhì)的最佳提取條件為A2B2C1，顯著性：A＞C＞B.說明pH值對馬鈴薯蛋白質(zhì)提取的影響最大.在最優(yōu)的提取條件下馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取率為74.3%.

表3 酸性條件下正交實驗結(jié)果分析

2.3 馬鈴薯蛋白質(zhì)在堿性條件下提取蛋白質(zhì)正交實驗的結(jié)果

通過表4可知，堿性條件下，等電點提取馬鈴薯蛋白質(zhì)的最佳提取條件為A2B2C1，顯著性：A＞C＞B.說明pH值對馬鈴薯蛋白質(zhì)提取的影響最大.此時在最優(yōu)提取條件下馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取率為11.6%.通過上述研究表明，影響馬鈴薯蛋白質(zhì)提取率的因素顯著（R）值得次序為：pH＞液料比＞時間，其中以pH值對提取率影響較為顯著.另酸性條件下蛋白質(zhì)提取率最大為74.3%，堿性條件下馬鈴薯蛋白質(zhì)最大提取率為11.6%.證明在酸性等電點條件下馬鈴薯沉淀量較大，馬鈴薯含有的大部分蛋白質(zhì)是堿溶性蛋白質(zhì).通過優(yōu)化提取條件，在液料比2∶1、酸堿等電點分別作用下，提取1 h，總的蛋白質(zhì)提取率為85.9%.

表4 堿性條件下正交實驗結(jié)果

2.4 馬鈴薯蛋白質(zhì)分子量的測定

2.4.1 酸性條件下馬鈴薯蛋白質(zhì)色譜分析結(jié)果

在490 nm下根據(jù)凝膠層析的原理和通過標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖公式的計算出峰值的含聚多糖量，可以確定3個標(biāo)準(zhǔn)聚多糖的峰值，如圖5所示.由于分子量越小在分析柱流動越慢，流出來也越晚，所以的分子量小的標(biāo)準(zhǔn)品損失也越多，因此越晚流出來的標(biāo)準(zhǔn)品，波峰相對越低.查找資料可得馬鈴薯中存在3種蛋白質(zhì)，其分子量分別為1.8×104，4.0×104，7.8×104［7］.在280 nm下，通過測定蛋白質(zhì)吸光度，發(fā)現(xiàn)在酸性提取條件下，只有一種蛋白質(zhì)，根據(jù)3種標(biāo)準(zhǔn)聚多糖的波峰和分子量，通過馬鈴薯蛋白質(zhì)出現(xiàn)的波峰管位位置，可判斷其分子量為4.0×104左右.

圖5 酸提堿溶條件下洗脫液的測量曲線

2.4.2 堿性條件下提取馬鈴薯蛋白質(zhì)色譜分析結(jié)果

根據(jù)凝膠層析的原理和通過標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖公式的計算出峰值的含聚多糖量，可以確定3個標(biāo)準(zhǔn)聚多糖的峰值，如圖6所示.由于分子量越小在分析柱中流動越慢，滯留時間越長，所以的分子量小的標(biāo)準(zhǔn)品擴散波峰越寬，因此越晚流出來的標(biāo)準(zhǔn)品，波峰值相對越低.與圖5相比較，酸性條件下，標(biāo)準(zhǔn)聚多糖和馬鈴薯蛋白質(zhì)出現(xiàn)的波峰的位置比堿性條件下晚一個管位洗脫液體積.在280 nm下，通過測定蛋白質(zhì)吸光度，并由此計算蛋白質(zhì)分子量.研究過程中發(fā)現(xiàn)3個峰，2個波峰分別代表2種酸溶性蛋白質(zhì)，根據(jù)其波峰的位置可判斷它們的分子量分別為1.8×104，7.8×104.表明馬鈴薯含有2種酸溶性蛋白質(zhì).其中分子量為4.0×104的蛋白質(zhì)峰值很小，可能在pH=3.5時，分子量4.0×104的蛋白質(zhì)沒有完全沉淀下來，在酸溶液中還有一定溶解度，在調(diào)pH值過程中分子量4.0×104的蛋白質(zhì)所帶電荷在（pH＞3.5）條件下為負(fù)，與分子量分別為1.8×104，7.8×104的蛋白質(zhì)帶正電荷（pH＜8.5）產(chǎn)生聚沉效應(yīng)，導(dǎo)致酸溶性堿沉蛋白凝膠層析有分子量4.0×104蛋白質(zhì)小波峰出現(xiàn).以上凝膠層析的實驗結(jié)果和舒群芳等的實驗結(jié)果一致［7］.分子量4.0×104蛋白質(zhì)在pH8.5參與的聚沉效應(yīng)很可能使調(diào)pH值從3.5 到8.5 的兩步沉淀方法的蛋白質(zhì)的提取率高于分別調(diào)pH值3.5和8.5的提取率加和85.9%，后續(xù)實驗將對兩步沉淀方法提取蛋白質(zhì)得率進一步進行驗證試驗，為兩步沉淀方法提供實驗依據(jù).

圖6 堿提酸溶條件下下洗脫液的測量曲線

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗和正交試驗的結(jié)果可知馬鈴薯蛋白質(zhì)的最佳提取工藝：pH=3.5，液料比=2∶1，提取時間為1 h和pH=8.5，液料比=2∶1，提取時間為1 h，影響馬鈴薯蛋白質(zhì)提取率的因素顯著（R）值得次序為：pH＞液料比＞時間.在酸性、堿性等電點的分別作用下，可以使馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取率達到85.9%.如果采用中和調(diào)pH值兩步沉淀法可能進一步提高蛋白質(zhì)的提取率（＞85.9%），此方法在實際食品工廠生產(chǎn)中也具有一定的可操作性，但后續(xù)廢液排放前要增加脫鹽處理工序.通過本實驗?zāi)軌蚝苊黠@的發(fā)現(xiàn)這3種蛋白質(zhì)的存在，并且通過不同pH下的蛋白質(zhì)吸光度和洗脫液稀釋度的比較計算，確定酸性等電點pH=3.5的情況下主要沉淀出一種蛋白質(zhì)（堿溶性蛋白），其分子量為4.0×104.堿性等電點pH=8.5的情況下主要沉淀出2種蛋白質(zhì)（酸溶性蛋白），其分子量分別為1.8×104，7.8×104.通過這種方法對馬鈴薯含有的3種蛋白質(zhì)進行分類.彌補了對馬鈴薯蛋白質(zhì)研究的不足，從而為以后研究開發(fā)馬鈴薯蛋白質(zhì)的保健功能和其在食品加工中充分的利用提供了參考.