肖 穎, 吳玉璘, 趙永秀, 林 寧

(1. 江蘇省泰興市婦幼保健院 婦產(chǎn)科, 江蘇 泰興, 225400;2. 江蘇省衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心, 江蘇 南京, 210000)

耳聾是較為常見的感覺神經(jīng)系統(tǒng)缺陷性疾病，研究[1]統(tǒng)計(jì)約2/3的聽力損害是由遺傳缺陷所致，其中線粒體遺傳是一種母系遺傳，而線粒體DNA 12S rRNA是氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)的非綜合征性耳聾研究中的熱點(diǎn)區(qū)域[2]，其中A1555G和C1494T這2個(gè)位點(diǎn)的突變是目前公認(rèn)的與藥物性耳聾密切相關(guān)的致病性突變，可引起突變攜帶者對(duì)氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)出高度敏感[3-5]。目前，江蘇省泰興地區(qū)孕婦藥物性耳聾基因篩查知識(shí)普及率較低，有關(guān)藥物性耳聾基因的突變率等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究對(duì)孕婦進(jìn)行A1555G、C1494T基因突變篩查，早期發(fā)現(xiàn)藥物性耳聾敏感個(gè)體、遲發(fā)型遺傳性耳聾個(gè)體，為藥物性耳聾遺傳咨詢及預(yù)防提供理論依據(jù)和干預(yù)措施，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取 2019年5月—2020 年6月江蘇省泰興市婦幼保健院定期參加產(chǎn)前檢查的孕婦300例，篩查前均詳細(xì)告知線粒體DNA 12S rRNA基因突變篩查相關(guān)知識(shí)和風(fēng)險(xiǎn)，所有研究對(duì)象均自愿簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集: 收集所有研究對(duì)象的基本信息，包括耳聾家族史、耳聾發(fā)病原因等資料。

1.2.2 樣本采集: 抽取研究對(duì)象的外周靜脈血2 mL, 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，樣本保存于-20 ℃冷凍備用。

1.2.3 藥物性耳聾基因篩查: 應(yīng)用藥物性耳聾基因檢測(cè)試劑盒(山東英盛生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)191201), 采用堿基突變?nèi)獧z測(cè)法，在1.5 mL離心管中分別加入抗凝血液200.0 μL; 加純水600.0 μL, 震蕩混勻，室溫放置10 min; 12 000 轉(zhuǎn)/min離心5 min后棄上清; 加純水600.0 μL, 震蕩混勻，室溫放置5 min, 期間混勻1次, 12 000轉(zhuǎn)/min離心5 min后吸棄上清; 加200.0 μL DNA提取液, 100 ℃水浴 8 min; 短暫震蕩, 12 000轉(zhuǎn)/min離心5 min, 取上清用于檢測(cè)。

在96孔板上擺放2套八連管，標(biāo)記檢測(cè)位點(diǎn)(1555A>G、1494C>T)、樣本編號(hào)、陰性/陽性質(zhì)控; 每管分裝23.0 μL待測(cè)位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的反應(yīng)液于PCR反應(yīng)管內(nèi); 確認(rèn)離心好的樣本、陰性/陽性質(zhì)控品與PCR反應(yīng)管的排列順序一致; 向分裝好試劑的PCR管內(nèi)分別加入2.0 μL待測(cè)DNA模板、陰性/陽性質(zhì)控。開啟ABI7500熒光PCR儀，設(shè)置PCR擴(kuò)增參數(shù)，并設(shè)定FAM、HEX(VIC)檢測(cè)通道; 核對(duì)擴(kuò)增程序及擴(kuò)增體積25.0μL無誤，按順序放入待擴(kuò)增樣本，開始擴(kuò)增。最后根據(jù)“反應(yīng)孔信息表”項(xiàng)目下儀器自動(dòng)讀取的Ct值進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.2.4 子代聽力篩查: 采用丹麥MADSEN耳聲發(fā)射儀和自動(dòng)聽性腦干反應(yīng)篩查儀，對(duì)出生48 h至出院前的新生兒進(jìn)行聽力篩查。

1.3 評(píng)估指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)300例孕婦藥物性耳聾基因篩查突變率; 對(duì)突變基因攜帶者提供科學(xué)用藥指導(dǎo)，對(duì)子代進(jìn)行藥物性耳聾基因篩查，對(duì)子代進(jìn)行聽力篩查并隨訪跟蹤。

2 結(jié) 果

300例孕婦中, 298例通過了藥物性耳聾基因篩查, A1555G基因突變攜帶率為0.67%(2/300), 未發(fā)現(xiàn)C1494T基因突變。子代耳聾基因篩查結(jié)果顯示，未通過篩查的2例孕婦子代均為A155G攜帶者。2例A1555G基因突變攜帶者的子代均通過了新生兒聽力篩查。

3 討 論

藥物性耳聾是指使用某些藥物引起的位聽神經(jīng)系統(tǒng)中毒性損害而誘發(fā)的一種非綜合征性耳聾，具有遺傳易感性[6-7]。線粒體DNA 12S rRNA突變是其主要致病機(jī)制, A1555G和C1494T是較為常見的突變位點(diǎn)。研究[8-10]報(bào)道，線粒體DNA 12S rRNA突變攜帶者出生時(shí)聽力正常，若使用氨基糖苷類抗生素可出現(xiàn)感應(yīng)神經(jīng)性耳聾。氨基糖苷類抗生素具有較強(qiáng)的毒副作用，對(duì)聽覺、前庭系統(tǒng)都會(huì)造成不可逆的損傷[11], 因其具有抗菌譜廣、臨床起效快等特點(diǎn)，目前仍廣泛應(yīng)用于臨床，導(dǎo)致氨基糖苷類抗生素誘發(fā)致聾成為新發(fā)耳聾的主要原因。

本研究對(duì)300例孕婦進(jìn)行藥物性耳聾基因篩查，研究對(duì)象均為首次就診，說明泰興地區(qū)的孕婦及家屬對(duì)耳聾基因篩查的重要性認(rèn)知不足，因此需要加強(qiáng)專業(yè)衛(wèi)生人員相關(guān)培訓(xùn)，大力宣傳孕婦耳聾基因篩查的重要性。本研究采用PCR法檢測(cè)出孕婦線粒體DNA 12S rRNA的A1555G攜帶率為0.67%, 子代線粒體DNA中A1555G攜帶率也為0.67%, 因線粒體基因具有母系遺傳特點(diǎn)，故突變位點(diǎn)在母體與子代中的攜帶率并無差異。

線粒體12S rRNA突變可導(dǎo)致氨基糖苷類抗生素耳聾[12]。在中國，線粒體DNA 12S rRNA基因以A1555G突變?yōu)橹? C1494T突變概率較低[13-14]。本研究共檢出2例A1555G基因突變，說明攜帶者應(yīng)避免使用氨基糖苷類藥物，防止藥物性耳聾的發(fā)生。本研究孕婦A1555G突變率僅為0.67%，且未檢測(cè)到C1494T突變，低于研究[13-14]報(bào)道的突變率，可能與本研究樣本量較少、各地區(qū)間存在差異等因素有關(guān)。本研究孕婦線粒體DNA 12S rRNA中A1555G突變2例，突變率為0.67%, 原因可能為本研究?jī)H篩查了線粒體DNA 12S rRNA的2個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，即A155G和T1494T, 而線粒體DNA上其他位點(diǎn)突變?cè)斐傻乃幬镄远@存在漏篩。因此，需進(jìn)一步完善本研究中線粒體DNA其他位點(diǎn)上的篩查。

綜上所述，在江蘇省泰興地區(qū)對(duì)孕婦人群開展藥物性耳聾基因突變篩查，不僅可指導(dǎo)攜帶者合理用藥，為攜帶者家庭揭示分子病因，避免孕期藥物性耳聾的發(fā)生，還可對(duì)孕婦子代進(jìn)行跟蹤隨訪，進(jìn)行專項(xiàng)管理，及早干預(yù)并構(gòu)建完整的藥物性耳聾防控體系。