田 密, 高 尚, 周 珊, 王曉峰, 劉 杰

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 口腔科, 黑龍江 哈爾濱, 150000)

納米技術(shù)是一種工程化的功能系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)不同的原子結(jié)構(gòu)從而使納米材料具有新特性和新用途[1-3]。納米粒子表現(xiàn)出更大的表面積與體積之比，具有棒形或球形等優(yōu)異外形，可廣泛應(yīng)用于口腔科領(lǐng)域。金屬納米粒子，如金、鈀、鉑等，由于其良好的機(jī)械、化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)而被廣泛使用[4-5], 其中金納米顆粒(Au NPs)具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)、良好的生物相容性、易于合成和功能化等優(yōu)點(diǎn)，已在生物成像、藥物輸送、疾病的診斷和治療中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[6]。金納米具有藥物輸送、抗菌、成骨等作用，可以作為一種新興的牙周疾病預(yù)防和治療的手段。本文對(duì)金納米的抗菌及成骨的機(jī)制進(jìn)行闡明，并綜述其在牙周病預(yù)防與治療中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 Au NPs可以促進(jìn)牙槽骨的形成

1.1 Au NPs促進(jìn)牙槽骨形成

牙周治療的最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)牙周組織再生，其中牙周骨組織再生是至關(guān)重要的部分[7]。 Au NPs可以參與骨形成的機(jī)制主要有以下假說。

Au NPs促進(jìn)牙槽骨的形成的機(jī)制之一是通過參與細(xì)胞自噬過程。包括Au NPs在內(nèi)的納米顆粒是一類新型的自噬調(diào)節(jié)劑，研究[8-9]表明自噬在間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的成骨分化中起重要作用。人類間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化需要早期誘導(dǎo)自噬，遺傳或藥理自噬抑制作用均會(huì)阻止成骨過程[10]。PANTOVIC A等[10]報(bào)道, RNA干擾技術(shù)沉默自噬必需的微管關(guān)聯(lián)蛋白(LC3β)以及使用自噬的藥理學(xué)抑制劑均抑制了間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。KIM I R等[11]表明用小干擾RNA(siRNA)敲除自噬相關(guān)基因，包括人自噬基因7(Atg7)或程序性死亡受體-1基因(Beclin1)會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞礦化作用顯著降低，且自噬相關(guān)基因5(Atg5)的缺失會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)骨形成減少。在另一項(xiàng)研究[12]中，自噬小體復(fù)合物(FIP 200)必需成分的缺失導(dǎo)致自噬不足，從而導(dǎo)致骨形成和礦化的減少。上述研究提示自噬可能是Au NPs介導(dǎo)的成骨分化的潛在機(jī)制。ZHANG Y H等[13]通過金納米促進(jìn)與自噬有關(guān)的微管關(guān)聯(lián)蛋白輕鏈3(LC3)、Beclin1 基因和微管關(guān)聯(lián)蛋白-Ⅱ(LC3-Ⅱ) 蛋白的表達(dá)，以及消耗自噬過程所需要的底物P62 蛋白，并且進(jìn)一步通過自噬不同階段的抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)和氯喹(CQ)探討自噬對(duì)成骨過程的影響，結(jié)果表明金納米可通過自噬來促進(jìn)牙周膜組細(xì)胞分化成為牙槽骨。

Au NPs參與Wnt/β-catenin信號(hào)通路。干細(xì)胞的增殖和生長是形成組織并最終分化為生物所需細(xì)胞的前提。Wnt/β-catenin信號(hào)對(duì)于調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和細(xì)胞增殖以及細(xì)胞分化的過程至關(guān)重要[14]。LI C等[15]研究表明，細(xì)胞外的Au NPs可以促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，增加低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5(LRP5)分泌增加，促進(jìn)細(xì)胞外因子(Wnt)和卷曲蛋白的聚集并作用于細(xì)胞質(zhì)中的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)。磷酸化的β-catenin去磷酸化，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，促進(jìn)了與牙周膜干細(xì)胞增殖相關(guān)基因，如MYC、CCND1、AXIN2、POU5F1基因的表達(dá)水平增加，從而促進(jìn)了牙周膜干細(xì)胞增殖。

研究表明Au NPs通過p38 MAPK途徑促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。YI C等[16]研究表明, Au NPs誘導(dǎo)增強(qiáng)的成骨轉(zhuǎn)錄譜，減弱成脂轉(zhuǎn)錄譜，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Au NPs通過與細(xì)胞膜相互作用并與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白相結(jié)合，從而引起機(jī)械擴(kuò)散，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成骨相關(guān)蛋白酶原，活化成骨細(xì)胞。

干細(xì)胞成骨是許多因素相互作用的復(fù)雜過程, Au NPs可通過幾種經(jīng)典路徑成骨，但成骨機(jī)制還尚未闡明，還需深入研究，以為牙周組織工程的發(fā)展提供更多的依據(jù)。

1.2 Au NPs可以改善牙周組織的炎癥環(huán)境

在牙周炎的病理過程中，駐留在牙根表面的微生物感染的初始反應(yīng)激活先天免疫系統(tǒng)，釋放細(xì)胞因子和其他介質(zhì)，使炎癥在牙周組織中的傳播，繼而驅(qū)動(dòng)牙周炎的骨丟失和結(jié)締組織破壞[17]。在免疫系統(tǒng)中，由于巨噬細(xì)胞在宿主抵抗微生物的第一道防線中起重要作用，并且是破壞性細(xì)胞因子的主要來源之一，因此發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可通過改變其表型來參與牙周骨損傷的修復(fù)[18-19]。 研究[19]表明, M2巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)可以預(yù)防小鼠牙周炎模型中的骨質(zhì)流失，這表明巨噬細(xì)胞的極化在牙周炎進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。已知M1和M2巨噬細(xì)胞亞群的特征是分泌不同的細(xì)胞因子，并在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮不同的作用。 M1巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等炎性因子來防御病原體的侵襲，而M2巨噬細(xì)胞則通過分泌白細(xì)胞介素-10(IL-10)和腫瘤壞死因子-β(TGF-β)等細(xì)胞因子來發(fā)揮抗炎作用，具有組織修復(fù)和傷口愈合的血管生成作用[20]。 此外，巨噬細(xì)胞能夠分泌BMP-2并直接介導(dǎo)成骨過程[21]。因此，巨噬細(xì)胞的行為可能會(huì)影響牙周組織損傷和再生過程。

SUMBAYEV V V等[22]觀察到脂多糖(LPS)可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為促炎性M1表型，并增加炎性因子的分泌，從而構(gòu)建炎性微環(huán)境。在此過程中, Au NPs(尤其是45 nm Au NPs)通過抑制M1表型極化并促進(jìn)其向M2表型轉(zhuǎn)換，發(fā)揮消炎作用。因此, 45 nm Au NPs具有免疫調(diào)節(jié)作用，可改善炎癥狀態(tài)。但目前有關(guān)Au NPs對(duì)炎癥影響的相關(guān)研究得出的結(jié)論并不一致。研究[18]表明Au NPs可以減弱LPS或白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的炎癥作用。另一些研究[23-24]顯示, Au NPs對(duì)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)沒有影響，甚至無上調(diào)作用。分析差異原因可能是Au NPs的表面修飾、濃度和大小的差異所致，這些特征的微小變化可能會(huì)導(dǎo)致Au NPs的性質(zhì)產(chǎn)生較大差異[25]。TSAI C Y等[23]認(rèn)為45 nm Au NPs是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的最佳粒徑，參與巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換和細(xì)胞因子的分泌，為組織再生產(chǎn)生有利的巨噬細(xì)胞相關(guān)免疫微環(huán)境。但在長期的炎癥環(huán)境中，單純的金納米不能長期促進(jìn)骨組織的形成, ZHOU J等[26]研究Au NPs和人β-防御素3(hBD3)協(xié)同作用對(duì)炎癥下牙周膜成骨的作用，結(jié)果表明hBD3結(jié)合Au NPs可激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并在長期炎癥微環(huán)境中促進(jìn)牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。

Au NPs雖然可以改善牙周的炎癥環(huán)境，促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨，但長期的炎癥環(huán)境會(huì)導(dǎo)致成骨作用減弱，還需更多的研究探索Au NPs是否可以協(xié)同其他物質(zhì)增強(qiáng)牙周膜干細(xì)胞的成骨效果。

1.3 Au NPs促進(jìn)成骨的影響因素

離體研究[27-28]表明，特定粒徑和濃度的Au NPs可促進(jìn)細(xì)胞增殖，且Au NPs的細(xì)胞毒性是大小依賴性、濃度依賴性和時(shí)間依賴性效應(yīng)[28]。 Au NPs的促成骨作用取決于其性質(zhì)，尤其是納米顆粒的大小。 LI J等[29]比較了40、70和110 nm Au NPs的促成骨作用，發(fā)現(xiàn)40和70 nm Au NPs更有效。在另一項(xiàng)研究[30]中也獲得了相似的結(jié)果，其中30和50 nm Au NPs的成骨作用優(yōu)于15 nm和75、100 nm Au NPs。但ZHANG D W等[31]觀察到20 nm Au NPs對(duì)原代成骨細(xì)胞的成骨作用優(yōu)于40 nm Au NPs。KIBAR H等[32]研究了各種直徑的金納米粒(GNP)對(duì)牙周膜祖細(xì)胞(PDLP)成骨分化的影響。這項(xiàng)研究比較了5、13和45 nm 3種不同大小Au NPs的成骨特性，結(jié)果為Au NPs促進(jìn)了成骨分化的大小依賴性。因此，具有特定大小的Au NPs可能是牙周再生的良好材料。

2 Au NPs可抑制細(xì)菌的生長和繁殖

2.1 Au NPs的抗菌機(jī)制

金屬納米顆粒是重要的納米材料，具有出色的理化、光熱、磁和電性能[33-34], 其被作為有效的抗菌劑，用于細(xì)菌感染的檢測、診斷和治療中[34-36]。 Au NPs的抗菌作用很大程度上取決于其大小、形狀、表面化學(xué)性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)的固有組成部分[35-36]。由于Au NPs的作用獨(dú)立于活性氧(ROS)，因此對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性作用較小[37]，多種機(jī)制的抗藥途徑使耐藥性不易產(chǎn)生，并增強(qiáng)了抗生物膜的作用?？咕呗圆荒芫窒抻趩我煌緩剑瑧?yīng)同時(shí)根據(jù)微生物在其生態(tài)系統(tǒng)中的生存狀態(tài)采用多種抗菌途徑[38], 故未來需針對(duì)Au NPs的不同抗菌途徑進(jìn)行深入研究，以加深對(duì)其抗菌效果的認(rèn)識(shí)。

2.2 Au NPs作為藥物載體應(yīng)用臨床

牙周炎是最常見的慢性口腔感染性疾病之一，由牙周病細(xì)菌引起，常導(dǎo)致牙周袋的形成以及牙齒周圍支撐組織的破壞，甚至?xí)寡例X松動(dòng)和脫落[39-41]。通常需要潔治、刮治進(jìn)行機(jī)械清除，但要徹底清除牙周袋底部和牙根分叉區(qū)域的牙周病原菌仍然具有難度[42], 臨床常聯(lián)合抗生素共同治療牙周炎。然而，正常菌群的破壞和維持局部治療的濃度限制了抗生素的使用[43], 且抗生素過度使用會(huì)導(dǎo)致耐藥菌的出現(xiàn)，使治療無效，而納米粒子可以充當(dāng)藥物的載體，將藥物濃縮在其表面或特異性地攻擊生物學(xué)目標(biāo)。

介孔二氧化硅(MSN)作為藥物載體已受到廣泛關(guān)注。由于有序的孔和較高的表面積比，MSN可承載抗生素的較高負(fù)荷并實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放藥物[44-45]。在MSN的表面應(yīng)用納米閥和聚合物，可保護(hù)加載在孔中的抗生素并靶向病變部位，但當(dāng)加載到MSN上的抗生素濃度降低到最低有效濃度以下時(shí)，齦下病原體會(huì)恢復(fù)增殖，導(dǎo)致感染復(fù)發(fā)。LIN J等[46]設(shè)計(jì)了1種將介孔二氧化硅涂層的Au NPs(Au NBPs@ SiO2)與甲基丙烯酸明膠(GelMA)混合而成的混合水凝膠(GelMA-Au NBPs@ SiO2)。該凝膠具有良好的生物相容性，能夠在近紅外光照射下實(shí)現(xiàn)抗生素藥物的釋放，并延長藥物在牙周袋中的保留時(shí)間，長期控制牙齒表面的細(xì)菌繁殖。通過抗生素和光熱處理，該生物材料對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抗菌作用可以提高到90%。GelMA-Au NBPs@ SiO2水凝膠具有細(xì)胞毒性成分小、細(xì)菌耐藥性低、外部可控性和廣譜殺菌性等優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)出徹底治療頑固性牙周炎的潛力。

3 金納米簇(AuNCs)在牙周病預(yù)防中的

應(yīng)用

牙齦卟啉單胞菌是一種糖酵解革蘭氏陰性的口腔致病性厭氧菌，影響口腔和全身健康，是導(dǎo)致牙周病的主要感染細(xì)菌。牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生的主要毒力因子為Gingipain, 用廣譜抗生素治療極少能根除牙齦卟啉單胞菌并可能導(dǎo)致耐藥。ZHANG M等[47]通過AuNCs在其表面上的靜電自組裝，開發(fā)了具有穩(wěn)定抗菌涂層的表面改性的無托槽隱形矯治器，并作為牙齦卟啉單胞菌感染患者的長期藥物輸送系統(tǒng)，與傳統(tǒng)的口服給藥相比，長期佩戴的可移動(dòng)式抗菌裝置可保持藥物的連續(xù)供應(yīng)，維持治療效率，避免因依從性或藥效動(dòng)力學(xué)差而產(chǎn)生的耐藥性。XIE Y等[48]開發(fā)了脫氧核糖核酸酶(DNase)功能化的AuNCs(DNase-AuNCs), 其能夠殺死革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，特別是分散周圍的生物膜。DNase可以分解細(xì)胞外聚合物基質(zhì)，使無防御的細(xì)菌在808 nm激光照射下，通過DNase-AuNCs暴露于光熱療法(PTT)和光動(dòng)力療法(PDT)中而被降解。PDT和PTT組合可以有效去除生物膜，分散率高達(dá)80%, 并可殺死約90%的細(xì)菌。DNase-AuNCs作為細(xì)菌生物膜涂層用于無托槽隱形矯治器的表面，在消滅細(xì)菌生物膜、預(yù)防牙周病的進(jìn)展上表現(xiàn)出良好的應(yīng)用情景。

4 小結(jié)及展望

牙周炎是一種由菌斑聚集引起的炎癥性疾病，如不加以控制會(huì)造成牙齦附著喪失，形成牙周袋，吸收牙槽骨，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)，甚至脫落。細(xì)菌的耐藥性、藥物的持續(xù)輸送以及牙槽骨的成骨能力是影響牙周炎治療效果的難點(diǎn)。Au NPs具有消除病原細(xì)菌和促進(jìn)牙周間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的能力，可作為一種新興的牙周病治療材料。雖然Au NPs的殺菌作用有限，但可作為藥物載體輔助藥物的遞送，并且可與DNase靜電組裝，功能化的Au NPs具有可聯(lián)合激光消滅生物膜內(nèi)細(xì)菌的作用，提高了抑菌能力。除具殺菌作用, Au NPs還參與損傷牙槽骨的修復(fù)過程，長期的炎癥環(huán)境會(huì)影響Au NPs對(duì)牙槽骨的修復(fù)效果，需協(xié)同hBD3改善牙周袋內(nèi)炎癥微環(huán)境。Au NPs具有藥物載體所需的安全性和可修飾特性，故其可作為輔助牙周病治療的一種安全載體或藥物。Au NPs的大小和濃度會(huì)對(duì)其作用效果造成影響，所以仍需深入研究Au NPs在牙周治療與預(yù)防中的適宜大小和濃度。