喻茂文 柳建磊 湯洪波 陳建軍 莫邦竹

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)通過調(diào)節(jié)微小RNA(MicroRNA，miRNA)在牙周炎的發(fā)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[2-3]。LINC00963是一種在癌癥病理進展中具有重要作用的lncRNA[4]，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子。研究表明，LINC00963在急性腎損傷小鼠和細(xì)胞模型中高表達(dá)，敲低其表達(dá)可靶向miR-128-3p減輕急性腎損傷[5]。LINC00963在慢性腎衰竭小鼠模型中高表達(dá)，干擾其表達(dá)可抑制慢性腎衰竭造成的氧化應(yīng)激[6]。MiR-525-5p在心肌梗死中下調(diào)表達(dá)[7]。miR-525-5p在腦缺血再灌注損傷中下調(diào)表達(dá)，敲低其表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加腦梗死面積[8]。可見LINC00963和miR-525-5p可以影響細(xì)胞損傷過程，但二者在酯多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷中的表達(dá)及其對LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷的影響尚未可知。本研究構(gòu)建了LPS刺激的人牙周膜細(xì)胞作為細(xì)胞模型，考察LINC00963和miR-525-5p對此模型中細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響，并進行LINC00963的機制探索。

1 材料與方法

1.1 材料

LipofectamineTM2000、增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑底物(Invitrogen,美國); PrimeScript RT試劑盒、SYBR Master Mix試劑盒(Takara,日本); miScript Reverse Transcription試劑盒、miScript SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen，德國)； si-NC、si-LINC00963、miR-NC、miR-525-5p、anti-miR-NC、anti-miR-525-5p(上海GenePharma)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(南京KeyGen)； TNF-α和IL-1βELISA試劑盒(Abcam,美國)。

1.2 細(xì)胞分離培養(yǎng)

收集在本院進行正畸的健康志愿者離體牙，研究獲得參與者的知情同意，經(jīng)醫(yī)院倫理批準(zhǔn)通過。將牙周膜組織從牙根表面輕輕刮下，根據(jù)先前的報道[9]分離人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells， hPDLCs)，將其接種到含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中生長，并保持在5% CO2和37 ℃的環(huán)境。

1.3 細(xì)胞處理與分組

取第2～3 代牙周膜細(xì)胞分為Con組(對照)、LPS組(10 μg/mL LPS誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞24 h)、LPS+si-NC組(LPS+轉(zhuǎn)染si-NC)、LPS+si-LINC00963組(LPS+轉(zhuǎn)染si-LINC00963)、LPS+miR-NC組(LPS+轉(zhuǎn)染miR-NC)、LPS+miR-525-5p組(LPS+轉(zhuǎn)染miR-525-5p)、LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC組(LPS+轉(zhuǎn)染si-LINC00963+anti-miR-NC)、LPS+si-LINC00963+anti-miR-525-5p組(LPS+轉(zhuǎn)染si-LINC00963+anti-miR-525-5p)。根據(jù)制造商Invitrogen的操作規(guī)程，當(dāng)牙周膜細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時，使用LipofectamineTM2000進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，進行10 μg/mL LPS誘導(dǎo)，持續(xù)24 h。

1.4 RT-qPCR檢測LINC00963和miR-525-5p表達(dá)

將Con組、LPS組和各實驗組中的牙周膜細(xì)胞加入Trizol試劑提取總RNA。檢測LINC00963表達(dá)時，根據(jù)說明，使用PrimeScript RT試劑盒用10 μL逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR實驗是使用SYBR Master Mix試劑盒在ABI 7900HT定量PCR系統(tǒng)進行的。檢測miR-525-5p表達(dá)時，根據(jù)說明，使用miScript Reverse Transcription試劑盒制備cDNA，miScript SYBR Green PCR試劑盒進行qPCR。將GAPDH和U6用作內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算LINC00963和miR-525-5p水平。引物如下(5′-3′)：LINC00963 F：GGTAAATCGAGGCCCAGAGAT，R：ACGTGGATGACAGCGTGTGA。GAPDH F：AGTCCACTGGCGTCTTCA，R：GAG-TCCTTCCACGATACCAA。miR-525-5p F：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG，R：GCGAGCACAGAATTAATAC-GACTCAC。U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA，R：AACG-CTTCACGAATTTGCGT。

1.5 ELISA檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β水平

使用ELISA試劑盒測定Con組、LPS組和各實驗組中的牙周膜細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β水平。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒于流式細(xì)胞儀分析不同組的牙周膜細(xì)胞凋亡率(%)。

1.7 Western blot檢測B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)表達(dá)

將Con組、LPS組和各實驗組中牙周膜細(xì)胞于RIPA裂解緩沖液在冰上反應(yīng)30 min。使用Bio-Rad電泳儀，SDS-PAGE(10%凝膠)分析含有20 μg總蛋白的樣品，并轉(zhuǎn)膜。將膜與抗Bcl-2、Bax和GAPDH(對照)抗體(均為1∶1 000)在4 ℃過夜，并與山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶二抗在室溫下孵育1 h。隨后將膜與ECL溶液孵育進行成像分析。

1.8 雙熒光素酶報告實驗

構(gòu)建含有miR-525-5p結(jié)合位點的LINC00963野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報告質(zhì)粒，命名為WT-LINC00963和MUT-LINC00963。隨后，將兩個質(zhì)粒分別與miR-NC或miR-525-5p共轉(zhuǎn)染到牙周膜細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，利用雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測相關(guān)熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 LINC00963和miR-525-5p在LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷中的表達(dá)

LPS誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞后，LPS組LINC00963表達(dá)水平約為Con組的2.74 倍，miR-525-5p表達(dá)水平約為Con組的0.35倍(P<0.05)(圖 1)。

圖 1 LINC00963和miR-525-5p在LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷中的表達(dá)

2.2 干擾LINC00963表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

LPS組牙周膜細(xì)胞中LINC00963表達(dá)水平、TNF-α和IL-1β水平分別比Con組增加了約1.88、1.80和2.33 倍(P<0.05)，干擾LINC00963表達(dá)后，LPS+si-LINC00963組牙周膜細(xì)胞中LINC00963表達(dá)水平、TNF-α和IL-1β水平比LPS+si-NC組減少了約0.47、 0.57和0.48 倍(P<0.05)(圖 2)。

圖 2 干擾LINC00963表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

2.3 干擾LINC00963表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞凋亡的影響

LPS組牙周膜細(xì)胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白水平分別是Con組的約3.68、0.39和4.83 倍(P<0.05)，干擾LINC00963表達(dá)后，LPS+si-LINC00963組牙周膜細(xì)胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白水平是LPS+si-NC 組的約0.41、2.5和0.34 倍(P<0.05)(圖 3)。

圖 3 干擾LINC00963表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞凋亡的影響

2.4 LINC00963靶向調(diào)控miR-525-5p的表達(dá)

StarBase軟件對LINC00963與miR-525-5p靶向結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果見圖 4A。 miR-NC組WT-LINC00963和MUT-LINC00963的熒光素酶活性分別為1.02±0.05、1.00±0.06，miR-525-5p組WT-LINC00963和MUT-LINC00963的熒光素酶活性分別為0.62±0.04、1.03±0.07，WT-LINC00963的熒光素酶活性在miR-NC組和miR-525-5p組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，MUT-LINC00963的熒光素酶活性在miR-NC組和miR-525-5p組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05, 圖 4B)。miR-525-5p表達(dá)水平在pcDNA-LINC00963組(0.33±0.03)顯著低于pcDNA組(1.00±0.05)(P<0.05)， si-LINC00963組(2.71±0.21)卻顯著高于si-NC組(0.98±0.07)(P<0.05)(圖 4C)。

圖 4 LINC00963靶向調(diào)控miR-525-5p的表達(dá)

2.5 miR-525-5p過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞損傷影響

miR-525-5p過表達(dá)后，LPS+miR-525-5p組牙周膜細(xì)胞中miR-525-5p表達(dá)水平是LPS+miR-NC組的約3.01 倍，TNF-α、IL-1β水平、凋亡率和Bax蛋白水平分別比LPS+miR-NC組減少了約0.25、0.30、0.53、 0.59 倍，Bcl-2蛋白水平比LPS+miR-NC組增加了約1.18 倍(P<0.05)(圖 5)。

圖 5 miR-525-5p過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷的影響

2.6 下調(diào)miR-525-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾LINC00963表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷的作用

同時下調(diào)miR-525-5p和干擾LINC00963表達(dá)后，LPS+si-LINC00963+anti-miR-525-5p組牙周膜細(xì)胞中miR-525-5p表達(dá)水平低于LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC組，TNF-α、IL-1β水平、凋亡率和Bax蛋白水平高于LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC組，Bcl-2蛋白水平低于LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC組(P<0.05)(圖 6)。

圖 6 下調(diào)miR-525-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾LINC00963表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷的作用

3 討 論

LPS也稱為內(nèi)毒素，是炎癥反應(yīng)的有效激活劑，導(dǎo)致炎癥因子如IL-1β， IL-6， IL-8和TNF-α等炎癥因子的過度產(chǎn)生[10-11]。本研究同樣利用LPS誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞損傷，檢測到了LINC00963的上調(diào)。在乳腺癌[12]、骨肉瘤[13]、胃癌[14]等癌癥中， LINC00963通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、轉(zhuǎn)移、分化等過程促進癌癥的惡性進展。此外，根據(jù)Xie等[5]的研究結(jié)果，在缺氧誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞模型和缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠模型中，LINC00963的表達(dá)均增加。本研究發(fā)現(xiàn)干擾LINC00963表達(dá)可通過抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)、促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)來減少LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞凋亡。促炎因子TNF-α和IL-1β是牙周炎中炎性損傷的重要調(diào)節(jié)劑[15]。本研究表明，干擾LINC00963表達(dá)抑制了炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)。通過檢測這些指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)，干擾LINC00963表達(dá)可降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)和細(xì)胞凋亡，從而在牙周炎中起保護作用，這與Chen等[6]報道的si-LINC00963減少慢性腎功能衰竭大鼠模型中TNF-α、IL-6及細(xì)胞凋亡率、Bax和增加Bcl-2的結(jié)果相類似。

大多數(shù)lncRNA主要靶向miRNA以發(fā)揮其功能[16]。本研究中，miR-525-5p是牙周膜細(xì)胞中LINC00963的直接靶標(biāo)。miR-525-5p作為一種腫瘤抑制因子，被確定在膠質(zhì)瘤[17]、宮頸癌[18]中表達(dá)下調(diào)。最近的研究表明， miR-525-5p減輕了Ang-II處理的心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng)[19]。但miR-525-5p在牙周炎中的功能仍然未知。本實驗中，牙周膜細(xì)胞中的miR-525-5p被LPS下調(diào)，miR-525-5p過表達(dá)通過抑制細(xì)胞凋亡和炎癥因子TNF-α、 IL-1β表達(dá)，在LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞中顯示出有益作用。此外，下調(diào)miR-525-5p后，干擾LINC00963表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷的保護作用被逆轉(zhuǎn)，這表明下調(diào)miR-525-5p可以反向增加被si-LINC00963減少的LPS損傷牙周膜細(xì)胞的凋亡和炎癥因子表達(dá)，也表明LINC00963通過靶向LINC00963實現(xiàn)對LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)作用。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞中，LINC00963表達(dá)增加，干擾LINC00963表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)，可能與靶向miR-525-5p有關(guān)。本研究結(jié)果表明，LINC00963和miR-525-5p可能成為治療牙周炎的新靶標(biāo)。