張 博 諶苗苗 冀萬杰 趙春山 李喜升 王鳳成

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，國家蠶桑改良中心遼寧柞蠶分中心，遼寧省野蠶研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧鳳城 118100)

柞蠶核型多角體病毒是危害柞蠶的主要病原，在我國的遼寧、吉林、山東、黑龍江、內(nèi)蒙古、河南等省每年均有不同程度的發(fā)生，在遼寧省嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率可達(dá)50%以上，有的年份個(gè)別地區(qū)發(fā)病率竟高達(dá)80%以上。給廣大養(yǎng)蠶農(nóng)戶造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。尤其最近幾年，該病的發(fā)生呈加重趨勢[1-2]。因此，柞蠶品種對于ApNPV的抗性是評價(jià)品種生產(chǎn)性狀的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

熱激蛋白是在熱激條件下產(chǎn)生的一種特殊蛋白，此外其他外界刺激，如缺氧[3]、中毒[4]、缺乏能量[5]、病毒侵染[6]等，也能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生熱激蛋白。它在進(jìn)化上高度保守，且在生物體內(nèi)具有重要的生理意義，參與熱耐受[7]、免疫調(diào)控、細(xì)胞凋亡、病毒感染等生理過程[8]。

有研究顯示，柞蠶21.4 KDa小熱激蛋白(Ap-sHSP21.4)在大腸桿菌、白僵菌和ApNPV感染時(shí)在柞蠶中腸和脂肪體中高量上調(diào)表達(dá)。干擾Ap-sHSP21.4基因的合成可導(dǎo)致防御素、多巴脫羧酸酶、溶酶菌等參與免疫調(diào)控基因的下調(diào)[9]。對5齡家蠶進(jìn)行42 ℃、15 min短時(shí)熱激處理可提高家蠶對核型多角體病毒的抗性[10]。

本文將重點(diǎn)介紹高溫脅迫后柞蠶F1代稚蠶對ApNPV的抗性對比試驗(yàn)，討論柞蠶品種熱激蛋白表達(dá)量差異與ApNPV抗性差異的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的4個(gè)柞蠶品種為方山黃、抗大、F、5204，是在2016年耐熱性特征研究中篩選出來的4個(gè)耐熱性比較強(qiáng)的品種，由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所提供。2017年7月，將制備好的上述4個(gè)品種的種卵自然溫度催青，待孵化出蠶進(jìn)行試驗(yàn)。

柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所柞蠶保護(hù)研究室采集留存和提純。

1.2 柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)原液的制備及各濃度梯度的配制

將提純的柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)原液以無菌水稀釋、勻漿后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)算濃度為1.3×109p/mL的溶液作為病毒原液，保存?zhèn)溆谩Ｒ?.3×109p/mL的溶液作為病毒原液為起始濃度，用滅菌水按10倍稀釋法依次逐級稀釋，即吸取1 mL 1.3×109p/mL的核型多角體病毒原液和9 mL滅菌水均勻混合得到1.3×108p/mL的病毒溶液，再吸取1 mL 1.3×108p/mL的核型多角體病毒原液和9 mL滅菌水均勻混合得到1.3×107p/mL的病毒溶液，以此類推，依次得到1.3×106p/mL、1.3×105p/mL、1.3×104p/mL、1.3×103p/mL共6個(gè)濃度的病毒溶液，本次采用1.3×103～1.3×107p/mL共5個(gè)濃度進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)蠶的準(zhǔn)備

將供試的4個(gè)柞蠶品種按每個(gè)品種取10個(gè)蛾的卵，攪拌均勻，然后每個(gè)品種各取6 g卵平均分成6份置于產(chǎn)卵袋中。用事先準(zhǔn)備好的0.5%的氫氧化鈉溶液去掉卵表面的粘液，再放入甲醛-鹽酸混合溶液中進(jìn)行卵面消毒，晾干后掛在消毒過的養(yǎng)蠶室內(nèi)，待孵化前一天采用室內(nèi)卵面添毒方法，把蠶卵用紗布包好浸泡在5個(gè)濃度梯度的病毒液中，對照組浸泡無菌水中，浸泡時(shí)間為2 min，晾干裝入養(yǎng)蠶袋(已消毒)中待第2天孵化。

1.4 調(diào)查方法

蠶卵孵化時(shí)，蟻蠶因咬食卵殼而感染核型多角體病毒。將養(yǎng)蠶袋內(nèi)的蠶(健康且大小均勻)分裝在貼有品種名和病毒溶液濃度標(biāo)簽的罐頭瓶(已消毒)中，每個(gè)品種5個(gè)濃度，每個(gè)濃度5次重復(fù)，每個(gè)品種每個(gè)濃度各設(shè)置一個(gè)對照組，每個(gè)瓶中飼養(yǎng)10頭蟻蠶。溫度25～26 ℃，相對濕度80%～85%，每日取新鮮遼東櫟葉喂食1次，并且除蠶沙。逐日記錄蠶的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)病蠶死蠶及時(shí)記錄并剔除，以免造成交叉感染，對于疑似病蠶，必須經(jīng)過顯微鏡檢查確認(rèn)，避免數(shù)據(jù)誤差過大，調(diào)查至二眠起結(jié)束[11]。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對4個(gè)柞蠶品種(方山黃、抗大、F、5204)抗病性的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1)毒力回歸方程方差分析F值及其顯著水平。數(shù)量型數(shù)據(jù)毒力回歸方程診斷采用方差分析方法進(jìn)行，這是數(shù)量型資料和計(jì)數(shù)資料在生物測定分析進(jìn)行模型診斷方面的差異。

2)對四個(gè)品種進(jìn)行幾率值分析。DPS系統(tǒng)采用致死劑量比率測定方法來檢驗(yàn)各個(gè)品種在致死劑量方面的差異：當(dāng)致死劑量比率的95%置信區(qū)間包含1，則各品種的某致死劑量之間的差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試柞蠶品種的ApNPV抗性分析

用1.3×103～1.3×107p/mL共5個(gè)濃度梯度的ApNPV溶液分別處理4個(gè)品種即將孵化的蠶卵后，調(diào)查孵化后各品種的發(fā)病率，結(jié)果見表1。從中可以看出，處理的病毒溶液濃度越高，參試品種蠶的發(fā)病率越高，各品種平均發(fā)病率為26.9 %，對ApNPV的感染抵抗性品種存在一定的差異，參試的4個(gè)品種中，方山黃的抵抗能力最強(qiáng)，其次是5204、抗大，F(xiàn)的抵抗能力最差。

表1 柞蠶對ApNPV感染抵抗能力調(diào)查

采用DPS分析軟件對結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的模型分析，結(jié)果見表2。4個(gè)柞蠶品種的死亡率和幾率值都是隨著劑量的增加而逐漸增大，符合ApNPV濃度增大死亡率增大的現(xiàn)象。分析結(jié)果顯示5204和方山黃稚蠶的抗ApNPV能力較強(qiáng)。但F與方山黃在1.3×103p/mL、1.3×104p/mL、1.3×105p/mL上出現(xiàn)了低濃度死亡率大的結(jié)果，需要后期再確定結(jié)果的合理性。

表2 不同劑量下4個(gè)柞蠶品種的死亡率和幾率值

4個(gè)柞蠶品種LD50與劑量對毒力的回歸方程分析結(jié)果見表3，方山黃的LD50值為10.4874，明顯好于其他品種，5204的結(jié)果較方山黃的結(jié)果稍低，也好于其他兩個(gè)品種，該結(jié)果與死亡率和幾率值的結(jié)果相同。說明方山黃和5204對ApNPV的抗性較強(qiáng)。通過對不同劑量下的4個(gè)品種進(jìn)行毒力結(jié)果顯著性分析發(fā)現(xiàn)，品種F在5個(gè)劑量間的毒力結(jié)果表現(xiàn)出極顯著性差異P<0.01。

表3 四個(gè)柞蠶品種的劑量對毒力回歸曲線和毒液半數(shù)致死劑量

通過毒力回歸曲線圖1顯示：4個(gè)柞蠶品種中，方山黃的斜率較低，隨著劑量逐漸的增大并沒有表現(xiàn)出趨勢大幅度變化的現(xiàn)象，說明該品種對ApNPV有相對穩(wěn)定的抵抗性，且相對抵抗性強(qiáng)于其他品種。雖然F的結(jié)果在低劑量上出現(xiàn)死亡個(gè)數(shù)較多的情況，方山黃存在較高劑量間死亡個(gè)數(shù)少的現(xiàn)象，但是總體結(jié)果能夠看出相應(yīng)的趨勢，品種間存在顯著性差異結(jié)果。

3 討 論

昆蟲在面臨溫度驟升和微生物脅迫時(shí)，會采取提高抗菌肽及熱激蛋白基因表達(dá)量的策略來應(yīng)對這些脅迫[9]。本研究的4個(gè)柞蠶品種熱激處理后F1代的ApNPV抗性比較結(jié)果與前期熱激處理后各柞蠶品種2種熱激蛋白的表達(dá)量結(jié)果[12]趨勢基本一致，均為方山黃>5204>抗大>F。可推測部分熱激蛋白家族成員參與柞蠶的ApNPV侵染后相應(yīng)的免疫調(diào)控。即使昆蟲沒有免疫系統(tǒng)，但也可通過相應(yīng)的一些脅迫過程達(dá)到對機(jī)體自身保護(hù)作用。后期需要進(jìn)一步試驗(yàn)劃分柞蠶熱激蛋白家族在ApNPV侵染后的免疫調(diào)控中所起作用的貢獻(xiàn)率。

在4個(gè)柞蠶品種中，方山黃和5204不僅在遭受高溫脅迫時(shí)表現(xiàn)出2種主要熱激蛋白基因的高量表達(dá)，而且在對熱激處理后F1代稚蠶添食ApNPV時(shí)表現(xiàn)出高抗性，因此推測這2個(gè)品種的耐高溫與抗ApNPV能力較好。柞蠶品種方山黃已審定并在山東省推廣應(yīng)用多年，可將該品種作為柞蠶耐高溫品種選育試驗(yàn)的對照品種。柞蠶品系5204在幼蟲具有典型標(biāo)記表型形狀，若對該品種進(jìn)行繼代熱激鍛煉，將更有可能培育出抗逆型柞蠶新品種。

此外，試驗(yàn)選擇的柞蠶卵為熱激后的柞蠶F1代，取得的ApNPV抗性比較結(jié)果與熱激處理后熱激蛋白的表達(dá)量高低有一定相似性，需要進(jìn)一步試驗(yàn)確定熱激處理后各個(gè)柞蠶品種抗逆性是否進(jìn)行了一定繼代效果，從而得到了兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果的一致性。如果確定有抗逆性的繼代現(xiàn)象，可以通過逆境處理進(jìn)行抗逆品種的選育與材料發(fā)掘的準(zhǔn)備工作。