吳信舉， 陶周善， 謝加兵， 丁國正

（皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科， 安徽 蕪湖241001）

據(jù)統(tǒng)計， 在美國每年約有7 000 萬例外傷發(fā)生， 骨折患者約有500 萬例， 術(shù)后骨折不愈合患者占骨折患者的5%～10%［1］。 若骨折患者合并開放傷、 免疫性疾病、 骨質(zhì)疏松、 吸煙酗酒等高危因素， 骨不連發(fā)生率更是高達(dá)30%［2］。 骨不連表現(xiàn)的斷端異常活動、 負(fù)重疼痛、 畸形及功能喪失，會嚴(yán)重影響患者的工作及生活質(zhì)量， 再次行手術(shù)治療也會加重家庭及社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 因此進(jìn)一步探討骨不連的治療方法， 可為臨床提供個體化治療的參考依據(jù)。 骨不連的定義涉及影像學(xué)檢查、不愈合時間及動態(tài)觀察時間等多個方面， 國內(nèi)定義為： 骨折超過6 個月沒有愈合就可診斷為骨不連［3］。 目前國際上較推崇的診斷標(biāo)準(zhǔn)是由FDA 定義的： 骨折9 個月不愈合， 連續(xù)3 個月沒有愈合的跡象［4］。 骨折愈合需要穩(wěn)定的生物力學(xué)及生物學(xué)環(huán)境， 四種物質(zhì)對骨折愈合骨再生起到關(guān)鍵作用， 即： （1） 對骨誘導(dǎo)信號作出反應(yīng)的干細(xì)胞（成骨）； （2） 骨誘導(dǎo)生長因子（誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化）； （3） 完整的血管供應(yīng)； （4） 支持細(xì)胞附著、 增殖和進(jìn)入的支架 （骨傳導(dǎo)性基質(zhì)）［5］。 完成骨再生后， 生物應(yīng)力又可影響細(xì)胞因子的遠(yuǎn)期表達(dá)。 骨折修復(fù)過程在時間和空間完成新骨的生成， 使新生骨的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度與骨折前狀態(tài)相似。 目前骨不連物理治療方法主要包括低強(qiáng)度脈沖超聲 （LIPUS）、 電刺激療法、 高壓氧（HBO） 治療、 體外沖擊波刺激（ESWT） 等； 組織工程治療包括經(jīng)皮自體濃縮骨髓注射、 干細(xì)胞、細(xì)胞因子、 支架材料等。

1 物理治療

1.1 LIPUS LIPUS 治療可通過選擇超聲頻率強(qiáng)度， 針對目標(biāo)骨骼及軟組織， 消除腫脹， 促進(jìn)骨痂組織活性， 縮短愈合時間。 超聲波在對骨折愈合過程的促進(jìn)作用可能與以下生物學(xué)機(jī)制有關(guān)：（1） LIPUS 可以通過增加堿性磷酸酶（ALP）、 核因子κB 受體活化因子配體（RANKL） 和Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （RUNX2） 來促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化［6］。 （2） LIPUS 可促進(jìn)骨折斷端周圍血管增生， 增加細(xì)胞因子的運(yùn)輸及代謝物的清除［7］。（3） LIPUS 在促進(jìn)骨再生的同時， 還通過增加骨的容積及骨皮質(zhì)的厚度等方式來增加骨骼的機(jī)械強(qiáng)度［8］。

Zhou 等［9］使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人骨肉瘤細(xì)胞（MG-63） 來研究LIPUS 在內(nèi)皮細(xì)胞-成骨細(xì)胞共同培養(yǎng)系統(tǒng)中的應(yīng)用， 結(jié)果表明LIPUS 可顯著提高HUVECs 的遷移能力， 促進(jìn)血管生成， 同時可顯著提高成骨細(xì)胞中成骨相關(guān)基因的表達(dá)。 一項關(guān)于足踝關(guān)節(jié)融合術(shù)后骨不連的病例研究中， 應(yīng)用LIPUS 輔助治療， 結(jié)果表明在小關(guān)節(jié)的融合術(shù)骨不連中， 治愈有效率達(dá)90%［10］。 也有相關(guān)研究表明LIPUS 對加快骨不連愈合及縮短負(fù)重時間沒有明顯幫助［11］。 但LIPUS治療骨折端不愈合的前提條件是必須具備穩(wěn)定的生物力學(xué)環(huán)境， 因此常與骨折斷端植骨內(nèi)固定術(shù)相結(jié)合。 后期還需對超聲波治療骨折不愈合的最優(yōu)參數(shù)、 治療期限及配合相應(yīng)其他治療方法進(jìn)行更深一步的研究。

1.2 電刺激療法 目前電刺激治療方法分直流電刺激、 電容耦合電場 （CCEF） 和脈沖電磁場（PEMF）。 Muttini 等［12］在研究電流刺激聯(lián)合外固定器對綿羊骨折模型骨愈合的影響發(fā)現(xiàn)， 電刺激應(yīng)用于長骨骨折模型可加速骨痂的形成。 一項Me?ta 分析發(fā)現(xiàn)， 電刺激作為骨愈合輔助治療可緩解骨不連患者疼痛， 改善愈后的功能［13］。 電刺激療法通過刺激成骨細(xì)胞來促進(jìn)骨的愈合已被證實，Zeighami 等［14］進(jìn)一步研究了刺激前臂骨折成骨細(xì)胞所需的輸入電流， 計算了各骨折斷端形態(tài)下的最佳電流。

1.3 HBO 治療 HBO 治療可迅速提高組織氧分壓， 改善組織低氧情況， 促進(jìn)毛細(xì)血管生成， 豐富組織血運(yùn)， 進(jìn)而從根本上解決組織乏氧。 劉震［15］發(fā)現(xiàn)HBO 可使骨折斷端因子BMP - 2、BMP7、 CD34、 VEGF 表達(dá)上調(diào)， 從而加快新生骨形成作用， 促進(jìn)骨折端愈合。 臨床中HBO 常用于骨折不愈合的輔助治療。 李宏宇等［16］通過對小間隙骨不連患者（一般間隙小于1 cm） 的骨不連斷端應(yīng)用HBO 聯(lián)合ESWT， 在治療后的1 年內(nèi)， 每3個月復(fù)查一次X 線片， 結(jié)果顯示HBO 聯(lián)合ESWT治療效果明顯， 可顯著提高骨不連斷端的愈合率。HBO 為沖擊波治療四肢骨折內(nèi)固定術(shù)后骨不連的協(xié)同方法。 Ma 等［17］探討HBO 治療兔開放性脛骨骨折的效果， 通過放射學(xué)、 組織學(xué)和免疫組化檢查比較實驗組和對照組骨折區(qū)， 結(jié)果顯示HBO 治療組可減少炎癥反應(yīng)及再灌注損傷， 促進(jìn)骨斷端愈合。

1.4 ESWT ESWT 一般在外科中用于腎結(jié)石的治療， 沖擊波通過震動產(chǎn)生具有力學(xué)特性的聲波，引起介質(zhì)物理性質(zhì)的變化。 近年來， ESWT 被骨科用來刺激骨的生長， 治療骨折延遲愈合及不愈合，患者無需再次手術(shù)， 可達(dá)到愈合效果， 為患者減輕了手術(shù)治療的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

Valchanou 等［18］應(yīng)用ESWT 治療骨折延遲愈合和骨不連， 82 例患者中70 例出現(xiàn)骨愈合， 且無并發(fā)癥， 并認(rèn)為沖擊波在治療部位產(chǎn)生微小的骨折卻不損傷周圍組織， 以微小骨折刺激患處重新進(jìn)入骨折愈合過程。 目前ESWT 的確切作用機(jī)制尚不清楚， Schaden 等［19］認(rèn)為ESWT 致生物反應(yīng)是由機(jī)械作用觸發(fā)的， 沖擊波使壓力迅速上升， 組織細(xì)胞受到剪切力和拉力， 導(dǎo)致信使從細(xì)胞外基質(zhì)中釋放， 這種基質(zhì)可以激活細(xì)胞核中的基因， 從而誘導(dǎo)生長因子的上調(diào)。 李衛(wèi)等［20］認(rèn)為沖擊波能夠以定量的機(jī)械能對骨組織進(jìn)行微觀層次的刺激，體現(xiàn)了Wolff 定律和張力-應(yīng)力法則， 是Wolff 定律、 張力-應(yīng)力法則在微觀層次的一個重要體現(xiàn)。

一項關(guān)于ESWT 治療兔骨不連療效的分析，對于兔骨不連模型， 實驗組采用ESWT 治療3 次，對照組不進(jìn)行治療， 12 周后用X 線和HE 染色進(jìn)行修復(fù)區(qū)的放射學(xué)和組織學(xué)觀察評分， 結(jié)果顯示2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義， ESWT 對治療骨不連有效果［21］。 另一項回顧性研究結(jié)果表明ESWT 與手術(shù)治療骨不連的愈合率相當(dāng)， 且ESWT 后無嚴(yán)重不良事件報告［22］。

2 再生組織工程

骨不連的再生組織工程材料核心為骨誘導(dǎo)材料、 骨傳導(dǎo)材料和骨促進(jìn)材料。 骨誘導(dǎo)材料刺激多能干細(xì)胞發(fā)育成骨細(xì)胞； 骨傳導(dǎo)材料有助于骨細(xì)胞的黏附和生長； 促骨材料通過釋放各種生長因子間接促進(jìn)骨形成， 即通過細(xì)胞、 支架和生物活性因子的組合完成骨的再生， 為骨不連或大段骨缺損的治療帶來廣泛的應(yīng)用前景。

2.1 經(jīng)皮自體濃縮骨髓注射 自體骨髓組織中含有造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）， 后者是一類具有多分化潛能的組織細(xì)胞， 可以根據(jù)骨誘導(dǎo)信號分化為成骨細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞、 脂肪細(xì)胞等［23］。 體外、 體內(nèi)動物和臨床研究已經(jīng)證實了自體骨髓注射的成骨特性［24］。 Sahu 等［25］研究內(nèi)固定術(shù)后出現(xiàn)骨不連及骨折延遲愈合的患者經(jīng)皮注射自體骨髓治療的療效， 對93 例長骨延遲愈合（56例） 和不愈合（37 例）， 經(jīng)皮自體骨髓注射治療，所有患者隨訪24 個月， 結(jié)果顯示所有患者均在12周內(nèi)愈合， 患者預(yù)后優(yōu)良率評分達(dá)88.16%。 Islam等［26］對21 例骨不連和骨折延遲愈合的患者進(jìn)行自體濃縮骨髓注射治療， 15 例患者完全愈合， 愈合率達(dá)72%， 術(shù)中未見明顯并發(fā)癥， 與普通開放骨移植相比， 它是一種簡單、 安全、 微創(chuàng)的方法，尤其適用于麻醉風(fēng)險高或感染風(fēng)險高的病例。 經(jīng)皮骨髓移植是一種微創(chuàng)治療， 它避免了開放式手術(shù)導(dǎo)致的相關(guān)并發(fā)癥。 然而， 如果單獨(dú)使用該技術(shù)， 可能不足以誘導(dǎo)具有較大骨間隙的復(fù)雜骨不連的愈合。

對于經(jīng)皮自體骨髓移植治療骨不連， 國外有一項關(guān)于評估自體骨髓移植祖細(xì)胞數(shù)量、 濃度對移植后愈傷組織體積和臨床愈合率關(guān)系的研究［27］。研究發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)皮自體骨髓移植獲得骨愈合的53 例患者成纖維細(xì)胞集落濃度高于7 例未愈合者， 且在注射后4 個月時礦化愈傷組織體積與移植時成纖維細(xì)胞集落單位數(shù)和濃度呈正相關(guān)； 經(jīng)皮自體骨髓移植的效果與抽吸中可用的骨祖細(xì)胞數(shù)量有關(guān)， 因此優(yōu)化抽吸技術(shù)和濃縮過程對于提高成功結(jié)果的發(fā)生率至關(guān)重要［27］。

2.2 干細(xì)胞 干細(xì)胞組中最受關(guān)注的是MSCs［28］。MSCs 是一種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療多種疾病的新技術(shù)［29］。 其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs） 和脂肪來源干細(xì)胞（ASCs） 由于其廣泛的分布和物種多樣性而成為研究的熱點(diǎn)。

2.2.1 BMSCs 常通過髂骨翼、 脛骨內(nèi)側(cè)近端或肱骨近端的骨髓抽吸進(jìn)行， 可以從骨髓中提取MSCs， 直接移植到骨不連部位； 也可多部位提取后， 在移植前進(jìn)行體外擴(kuò)增。 汪兆文［30］研究經(jīng)皮自體BMSCs 移植治療四肢骨折骨不連的療效中，試驗組患者治療有效率為94.44%， 高于對照組的自體松質(zhì)骨移植治療有效率72.22%， 且未見明顯不良反應(yīng)。

2.2.2 ASCs ASCs 的特點(diǎn)是脂肪組織豐富， 易于獲取。 Fraser 等［31］報道脂肪組織中MSCs 的頻率是骨髓的500 倍左右。 它們在體外擴(kuò)增時遺傳穩(wěn)定， 但ASCs 會產(chǎn)生抑制軟骨細(xì)胞增殖和刺激軟骨細(xì)胞凋亡的因子［32］， 故不適用于軟骨內(nèi)骨折的愈合。 Kishimoto 等［33］發(fā)現(xiàn)去分化脂肪細(xì)胞是一種高度同質(zhì)、 高度增殖的細(xì)胞群， 在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下具有向成骨細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力。

2.2.3 骨膜源祖細(xì)胞 骨膜是一層100 μm 的薄膜， 覆蓋所有未被軟骨覆蓋的外骨表面［34］。 內(nèi)形成層直接與外骨皮質(zhì)相連， 血管化程度高， 是骨軟骨祖細(xì)胞的宿主， 具有獨(dú)特的組織形成能力。在骨折過程中， 骨膜的祖細(xì)胞發(fā)生大量增殖， 隨后發(fā)生軟骨形成和／或成骨分化［35］。 這導(dǎo)致了愈傷組織的發(fā)育， 進(jìn)一步促進(jìn)了骨折愈合。

2.2.4 細(xì)胞因子 除了治療骨折的機(jī)械不穩(wěn)定外， 生物學(xué)缺陷也會導(dǎo)致骨折不愈合。 生物學(xué)因素中生長因子起到活化劑的作用， 可在一定程度上促進(jìn)新骨生成， 另一方面也可通過負(fù)性作用抑制骨的吸收破壞。 目前研究較多的是人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP） 和成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）。

BMP 是強(qiáng)的骨誘導(dǎo)劑。 目前已發(fā)現(xiàn)20 個BMP家族成員， 其中研究最多的是BMP-2 和BMP-7。一項關(guān)于骨不連微環(huán)境中BMP-9 與EGFR 表達(dá)的研究中， 骨不連微環(huán)境中BMP-9 的表達(dá)量較正常骨組織明顯降低， 由此推斷骨不連可能與局部組織中BMP-9 數(shù)量減少有關(guān)［36］。 有研究表明腎臟在骨代謝中的重要作用， BMP-7 是腎臟中產(chǎn)生的重要活性分子之一， 參與了與骨形成相關(guān)的不同途徑［37］。

FGF 利用旁分泌或內(nèi)分泌信號介導(dǎo)多種生物病理生理過程， 包括血管生成、 傷口愈合、 胚胎發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)［38］。 哺乳動物FGF 家族有22 個成員， 其中FGF-2 是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最常用的FGF配體。 有研究表明， 基于干細(xì)胞的FGF-2 的治療在紅骨髓中具有成骨作用， 而在黃骨髓中無成骨作用［39］。 Charles 等［40］研究顯示， 高劑量的FGF-2抑制成骨細(xì)胞分化的進(jìn)展， 低濃度的FGF-2 促進(jìn)成骨。 這表明， FGF2 在促進(jìn)和抑制成骨的兩個方向上都起作用。 Wallner 等［41］對糖尿病模型小鼠骨骼再生的影響進(jìn)行研究， 發(fā)現(xiàn)1 mm 骨皮質(zhì)缺損的骨愈合明顯延遲， 成骨標(biāo)志物表達(dá)水平降低， 用醫(yī)用膠原蛋白海綿結(jié)合FGF-9 予以缺損處治療，可促進(jìn)骨愈合。

2.3 支架材料 一些細(xì)胞因子植入體內(nèi)后， 并未達(dá)到理想的結(jié)果， 考慮缺乏支架材料， 植入物并不能在局部固定形成有效的細(xì)胞濃度。 支架材料可以為細(xì)胞提供保護(hù)的三維空間， 同時還可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及功能代謝。 可通過三維支架材料與干細(xì)胞在體外聯(lián)合培養(yǎng)后將有活性的復(fù)合物再植入骨不連斷端， 支架材料可提供保護(hù)細(xì)胞因子增殖的空間， 后期支架不斷降解， 最終完成骨修復(fù)。支架材料不僅具備生物相容性和可降解性，還應(yīng)有良好的力學(xué)性能、 孔隙結(jié)構(gòu)及滲透率［42］。適宜的力學(xué)性能是支架的三維空間基礎(chǔ)， 力學(xué)性能低則不足以提供附著物生存的環(huán)境， 過高則可能產(chǎn)生應(yīng)力屏蔽效應(yīng)［43］。 多孔支架適用于細(xì)胞的附著， 孔隙大小及其相互連通性、 三維表面環(huán)境等有利于促進(jìn)細(xì)胞間的接觸［44］。 其在臨床上可用于替代自體骨與異體骨移植， 可模擬骨的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及力學(xué)特性， 且無來源限制， 為治療缺損性骨不連提供了應(yīng)用前景。 殼聚糖力學(xué)性能也較差， 可與其他支架材料復(fù)合提高力學(xué)性能［45］。 聚乳酸生物相容性較好， 有一定的力學(xué)強(qiáng)度， 但生物活性不足， 降解物可能致機(jī)體炎癥［46］。 生物陶瓷機(jī)械強(qiáng)度高， 生物相容性好， 三維空隙結(jié)構(gòu)為細(xì)胞的增殖分化提供載體基礎(chǔ)。 臨床常用的羥基磷灰石、 β- 磷酸鈣為較好的骨修復(fù)材料［47］。 金屬材料在臨床中應(yīng)用廣泛， 鈦網(wǎng)植骨常用于椎體間融合術(shù)， 鈦金屬具有較高的生物相容性及良好的彈性模量、 骨再生能力［48］， 不僅提高與周圍骨組織的整合力， 還可促進(jìn)骨組織再生。 研究發(fā)現(xiàn)，兩種或兩種以上的材料組成的復(fù)合材料具有較好的生物活性及力學(xué)強(qiáng)度， 彌補(bǔ)了單一材料應(yīng)用的缺陷， 具有較好的應(yīng)用前景［49］。 對于一些較大的骨缺損骨不連， 3D 打印技術(shù)可以為不同的缺損提供個性化治療， 實現(xiàn)定制骨材料， 是未來醫(yī)學(xué)發(fā)展的方向。

3 小結(jié)

分析骨折愈合過程中哪個環(huán)節(jié)受損， 予以針對性的非手術(shù)治療或手術(shù)治療， 為骨折端提供合適的生物學(xué)環(huán)境及生物力學(xué)環(huán)境， 重新啟動骨折愈合過程。 臨床常用治療骨不連的金標(biāo)準(zhǔn)為內(nèi)固定植骨術(shù)， 重新恢復(fù)斷端穩(wěn)定性， 植骨為斷端提供骨誘導(dǎo)、 骨傳導(dǎo)、 成骨等生物學(xué)環(huán)境。 考慮到再次手術(shù)的創(chuàng)傷及并發(fā)癥， 某些穩(wěn)定的骨不連可以考慮物理方法或微創(chuàng)注射方法治療， 同樣為斷端提供重新愈合的細(xì)胞及因子。 合適的骨生物材料可取代自體骨或同種異體骨， 為骨修復(fù)的替代物。 再生生物工程可通過在支架上植入細(xì)胞或因子， 正好提供了骨折愈合所需的必要因素， 應(yīng)用前景廣泛。